Fundamentals of Biochemistry

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4 MITOCHONDRIE

5 Les mitochondries ont 2 membranes distinctes membrane externe: contient des canaux VDAC (semblables aux porines de bactéries) => très perméable aux ions et petites molécules. membrane interne = barrière imperméable Contient divers transporteurs (notamment du pyruvate) Hautement invaginée (cristae). Site des complexes de la chaîne respiratoire &ATP Synthase.

6 Les mitochondries ont 2 membranes distinctes membrane externe: contient des canaux VDAC (semblables aux porines de bactéries) => très perméable aux ions et petites molécules. membrane interne = barrière imperméable Contient divers transporteurs (notamment du pyruvate) Hautement invaginée (cristae). Site des complexes de la chaîne respiratoire &ATP Synthase.

7 Membrane externe : très perméable Membrane interne: imperméable -entrée/sortie de composés par des transporteurs très spécifiques Matrice: cycle de Krebs, dégradation d acides gras, etc MITOCHONDRIE Les mitochondries ont 2 membranes distinctes

8 Membrane externe : très perméable Membrane interne: imperméable -entrée/sortie de composés par des transporteurs très spécifiques Matrice: cycle de Krebs, dégradation d acides gras, etc MITOCHONDRIE Les mitochondries ont 2 membranes distinctes

9 MITOCHONDRIE

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11 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase catalyse la decarboxylation oxidative du pyruvate, et forme l acetyl-coa. P y r u v a t e D e h y d r o g e n a se O O HSCoA H 3 C C C O H 3 C pyruvate NAD + NADH O C S CoA acetyl-coa + CO 2

13 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase Grand complexe contenant plusieurs copies de chacun des 3 enzymes, E 1, E 2, & E 3. Cofacteurs & Sous-unités Enzyme Abbreviation Groupe prosthetique Pyruvate Deshydrogenase Dihydrolipoyl Transacetylase Dihydrolipoyl Dehydrogenase E 1 E 2 E 3 Thiamine pyrophosphate (TPP) Lipoamide FAD Enzyme mammifère: Structure icosahedrique formée de 60 copies de E 2. à la péripherie du complexe: 30 copies de E 1 (lui-même un tetramère avec sous-unités α 2 β 2 ). 12 copies de E 3 (un homodimère), plus 12 copies de E 3 binding protein: qui lie E 3 à E 2.

14 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase

16 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase 24 ss-unités E2 24 ss-unités E1 dimères associés à E2 +dimères E3 (rouge) a & b combinés complexe de 60 ss-unités

17 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase E2 Azotobacter v. (24 ss-unités)

18 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase B. Stearothermophilis E2 core = 60 ss-unités de 20 trimères

22 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase Enzyme E1: Cofacteur lié sur E1 = Thiamine pyrophosphate (TPP) H + se dissocie de C entre N et S sur l anneau thiazole. Le carbanion (ylide) peut attaquer le groupe α-cétonique du pyruvate. CH 2 N H 3 C N NH 2 H 3 C CH 2 + N S C H O O CH 2 O P O P O O O acidic H + thiamine pyrophosphate (TPP)

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25 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase Enzyme E2: Cofacteur lié sur E2 = lipoamide Liaison covalente sur Lys groupe carboxylique : liaison amide avec ε-amino d une lysine de E 2 => lipoamide. Longue chaîne flexible (lipoate & résidu de lysine) se lie sur 2 sites de liaison sur E 2. Le lipoamide de E 2 forme bras flexible sur E 2 qui s étend sur le complexe multienzymatique. => le groupe lipoamide functionnel se déplace d un site actif vers l autre sur le complexe. La proteine E3 binding protein contient aussi un lipoamide: participe à l échange d equivalents reducteurs avec le lipoamide de E2. dithiol: subit une oxidation/ reduction Arsenic & Composants arsenicaux organiques : puissants inhibiteurs d enzymes à lipoamide (p.ex. pyruvate deshydrogenase). très toxiques réagissent avec des dithiols vicinaux p.ex. lipoamide. HS R' As O + R' As HS R H 2 O S S R

29 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase Cofacteurs mobiles, non lié sur l enzyme = CoenzymeA & NAD Coenzyme A: fixe Acetyl (de acetyl-lipoamide) => Acetyl-CoA Coenzyme A-SH + HO C CH 3 acetic acid O = produit final de réaction de l enzyme produit-clé du metabolisme. La liaison thioester ( riche en énergie ) = excellent donneur de groupe acetate. O Coenzyme A-S C acetyl-coa CH 3 + H 2 O Rôles de l Acetyl CoA Substrat du Krebs Cycle => sera degradé en CO 2. donneur de acetate pour synthese d acides gras, de corps cétoniques et de cholesterol. NAD + : accepteur final d electrons: NAD + + H + + 2e - => NADH Cofacteur soluble (mobile, diffuse) NAD + NADH H + N R O C NH 2 2e + H + H N R H O C NH 2

31 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase Acetyl CoA

33 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase Enzyme E3: Cofacteur lié sur E3 = FAD (Flavin Adenine Dinucleotide) dimethylisoalloxazine H 3 C C H C C N C O C NH 2 e + 2 H + H 3 C C H C C H N C O C NH H 3 C C C H C N CH 2 C N C O H 3 C C C H C N CH 2 C N H C O HC OH HC OH HC FADHC OH OH O O Adenine FADH 2 HC HC OH OH O O Adenine H 2 C O P O P O Ribose H 2 C O P O P O Ribose O- O- O- O- derivé de riboflavine (vitamine B1). Le groupe dimethylisoalloxazine subit une oxidation/reduction. agent de transfert de 1e- ou 2e- (forme semiquinone intermédiaire) Reaction: FAD + 2 e H + FADH 2

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40 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase Sequence de reactions du complexe Pyruvate Deshydrogenase: 1. Le C du groupe ceto du pyruvate reagit avec le carbanion du TPP sur E 1 pour former un composée d addition. La charge (+) de N de l anneau thiazole ring provoque la décarboxylation (perte de CO 2). Le Hydroxyethyl-TPP reste. 2. Le carbanion hydroxyethyl du TPP de E 1 reagit avec disulfure du lipoamide sur E 2. Ce qui était le C cétone du pyruvate est oxidé en acide carboxylique, et le disulfure du lipoamide est reduit en dithiol. L acetate formé par oxidation de l hydroxyethyl est lié à l un des thiols du lipoamide réduit, sous forme de thioester (~).

41 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase Sequence de reactions du complexe Pyruvate Deshydrogenase: 1. Le C du groupe ceto du pyruvate reagit avec le carbanion du TPP sur E 1 pour former un composée d addition. La charge (+) de N de l anneau thiazole ring provoque la décarboxylation (perte de CO 2). Le Hydroxyethyl-TPP reste. 2. Le carbanion hydroxyethyl du TPP de E 1 reagit avec disulfure du lipoamide sur E 2. Ce qui était le C cétone du pyruvate est oxidé en acide carboxylique, et le disulfure du lipoamide est reduit en dithiol. L acetate formé par oxidation de l hydroxyethyl est lié à l un des thiols du lipoamide réduit, sous forme de thioester (~). 3. L acetate est transferé du thiol du lipoamide sur le thiol du coenzyme A, formant l acetyl CoA. => libération de Acetyl-CoA

42 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase Sequence de reactions du complexe Pyruvate Deshydrogenase: 1. Le C du groupe ceto du pyruvate reagit avec le carbanion du TPP sur E 1 pour former un composée d addition. La charge (+) de N de l anneau thiazole ring provoque la décarboxylation (perte de CO 2). Le Hydroxyethyl-TPP reste. 2. Le carbanion hydroxyethyl du TPP de E 1 reagit avec disulfure du lipoamide sur E 2. Ce qui était le C cétone du pyruvate est oxidé en acide carboxylique, et le disulfure du lipoamide est reduit en dithiol. L acetate formé par oxidation de l hydroxyethyl est lié à l un des thiols du lipoamide réduit, sous forme de thioester (~). 3. L acetate est transferé du thiol du lipoamide sur le thiol du coenzyme A, formant l acetyl CoA. => libération de Acetyl-CoA 4. Le lipoamide reduit, se déplace sur le site actif de E 3. Le Dihydrolipoamide est reoxidé en disulfure, et 2 e H + sont transferés sur le disulfure de E 3 (disulfide interchange). 5. Le dithiol de E 3 est reoxidé par transfert de 2 e H + sur FAD=>FADH Le FADH 2 est reoxidé par transfert d electrons sur NAD + + H + +2e- => NADH => libération de NADH

43 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase Regulation de la Pyruvate Deshydrogenase A/ inhibition par les produits: NADH & acetyl CoA: NADH entre en compétition avec NAD + pour se lier à E 3. Acetyl CoA entre en compétition avec CoA pour se lier à E 2. B/ Régulation par phosphorylation / dephosphorylation de E 1 : Des Kinases et Phosphatases spécifiques sont associées au complexe Pyruvate Dehydrogenase dans la matrice mitochondriale. Une famille de Pyruvate Dehydrogenase Kinases catalysent la phosphorylation de E 1, et inhibent le complexe. Ces kinases sont activées par NADH & acetyl-coa, (produits principaux de reaction) et inhibent le complexe. L activation de Pyruvate Dehydrogenase Kinase entraîne une interaction avec E 2 sensible aux changements de l état d oxidation & d acetylation du lipoamide produit par NADH & acetyl-coa.

44 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase Regulation de la Pyruvate Deshydrogenase A/ inhibition par les produits: NADH & acetyl CoA: B/ Régulation par phosphorylation / dephosphorylation de E 1

45 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase B/ Régulation par phosphorylation de E 1 (kinases) Une isoforme de Pyruvate Deshydrogenase Kinase augmente la quantité de mitochondries dans le muscle au cours du jeûne. Ainsi le muscle ne catabolise pas le glucose nécessaire pour le cerveau. Une isoforme de Pyruvate Deshydrogenase Kinase est inhibée par ADP en presence de [pyruvate] élevée. donc: sous conditions de faible energie cellulaire (faible ~P), le complexe Pyruvate Deshydrogenase est actif, fournissant un input au cycle de Krebs. B/ Régulation par déphosphorylation de E 1 (phosphatases) Une isoforme Ca ++ -sensible de la phosphatase (qui déphosphoryle E 1 ) est exprimée dans le muscle. L augmentation de Ca ++ cytosolique durant la contraction musculaire peut produire une uptake de Ca ++ par la mitochondrie, donc inhibition de la phosphatase, => activation de la Pyruvate Deshydrogenase. => le métabolisme mitochondrial est stimulé durant l exercice!

46 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase REGULATION

47 Cycle de KREBS: a/ Pyruvate Deshydrogénase Regulation de la Pyruvate Deshydrogenase A/ inhibition par les produits: NADH & acetyl CoA: B/ Régulation par phosphorylation / dephosphorylation de E 1

48 CITRATE SYNTHASE

49 CITRATE SYNTHASE

50 CITRATE SYNTHASE Hexamère (6 ss-unités) Liaison de S => fort changement de conformation

51 CITRATE SYNTHASE

52 CITRATE SYNTHASE

53 CITRATE SYNTHASE

54 ACONITASE

55 ACONITASE

56 ACONITASE

57 ISOCITRATE DESHYDROGENASE

61 α-ceto-glutarate DESHYDROGENASE

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63 α-ceto-glutarate DESHYDROGENASE Complexe enzymatique identique à la pyruvate deshydrogenase sous-unité E1: 30 ss-unités (tetramères) - lient thiamine pyrophospahte sous-unité E2: 60 ss-unités - lient lipoamide sous-unité E3: 12 ss-unités (dimères) - lient FAD E3-binding Protein: 12 ss-unités - associent E3 et E2 cofacteurs mobiles: Coenzyme A - NAD E1= spécificité de substrat - lie α-cetoglutarate Régulation par phosphorylation de E1: kinases - phosphatase Régulation par Ca 2+ α-ceto-glutarate -> Succinyl-CoA α-céto-glutarate <=> Glu, His, Pro, Gln Succinyl-CoA => porphyrines