Fractionnement, LC-Maldi, itraq

Transcription

1 Centre Régional de Lutte Contre le Cancer Paul Papin Centre INSERM Régional de Recherche sur le Cancer U892 Fractionnement, LC-Maldi, itraq Amélioration de la Couverture Protéomique des Milieux très Complexes Catherine Guette

2 Deux techniques de protéomique quantitative 2D-DIGE (électrophorèse 2D différentielle) itraq Mass (m/z)

3 Oxaliplatine : un sel de platine de 3 ème génération NH 3 + Cl NH 3 + C CO NH 2 O CO Pt Pt Pt NH 3 + Cl NH 3 + C CO NH 2 O CO Cisplatine Carboplatine Oxaliplatine Seul sel de platine actif dans les cancers colorectaux métastasés Synergie avec le 5-FU, utilisation en première ligne thérapeutique Activité dans les cancers du sein et des ovaires

4 Toxicité de l oxaliplatine Absence de toxicité Faibles toxicités rénale cardiaque auditive hématologique digestive Toxicité limitante neurologique De type neuropathies périphériques : - Neurotoxicité aiguë - Neurotoxicité chronique AIGUE : transitoire et dose-dépendante (85 à 95% des patients). Troubles sensitifs: Crampes, fourmillement parfois laryngospasmes CHRONIQUE : évolution progressive Difficulté à marcher, écrire, se boutonner Dans 20% des cas pas de régression après 8 mois d arrêt

5 Protéomique quantitative Modèle cellulaire : neuroblastome SH-SY5Y CTRL Ox 5 µm Ox 10 µm 4 réplicats biologiques indépendants Ox 50 µm, 24 h DIGE-2D itraq Cy2, Cy3, Cy5 12,5%, ph 3-10, 18 cm MALDI-TOF/TOF 4-plex et 8-plex OFFGEL 24 fractions, nano-lc-c 18 MALDI-TOF/TOF

6 DIGE-2D : principe Cy2 std interne + Cy3 éch. 1 Cy5 éch. 2 Mélange des extraits marqués Séparation Scan Analyse

7 2D-DIGE : Résultats pi

8 Analyse par DIGE-2D 1592 protéines 82 protéines +/- 30 %

9 Les approches

10 itraq : Principe chimique Ross, P. L. (2004) Mol. Cell. Proteomics 3:

11 Premiers essais avec le 8-plex 8-plex itraq

12 Le réactif itraq Peptide A échantillon Peptide A échantillon Peptide A échantillon Peptide A échantillon 4 Réactif spécifique de la fonction amine des extrémités N-terminales des peptides et des chaînes latérales des lysines

13 itraq Marquage Peptide A échantillon Peptide A échantillon Peptide A échantillon Peptide A échantillon Peptide A échantillon Peptide A échantillon Peptide A échantillon Peptide A échantillon Peptide A échantillon Peptide A échantillon 4 Quantification Fragmentation par collision Identification

14 Marquage itraq Échantillon 1 Échantillon 2 Échantillon 3 Échantillon 4 Réduction, alkylation, digestion Digestat 1 Digestat 2 Digestat 2 Digestat 2 itraq 114 itraq 115 itraq 116 itraq 117 Digestat 114 Digestat 115 Digestat 116 Digestat 117 Mélange des peptides Séparation 2D: 1ère dimension: SCX ou OFFGEL 2ème dimension : nanolc sur C 18 Analyse MS/MS sur MALDI TOF/TOF

15 Couplage LC-MALDI MS/MS SCX 1614 MS 8585 MS/MS 42 heures

16 Les spectres MS et MS/MS Final - Shots LC5; Label (R12665,S1920) MS (R14251,S833) (R14770,S434) (R15965,S175) Mass (m/z) Final - Shots LC5; Label 1077 Prec = E+4 70 MS/MS Mass (m/z)

17 Zoom sur la zone des étiquettes itraq Mass (m/z)

18 Résultats Final - Shots LC5; Run #4; Label 1076 Prec = ( ( IDENTIFICATION Mass (m/z) Final - Shots LC5; Run #4; Label 1076 Prec = QUANTIFICATION ( ( Mass (m/z)

19 Résultats Final - Shots LC5; Run #4; Label 1348 Prec = ( IDENTIFICATION Mass (m/z) Final - Shots LC5; Run #4; Label 1348 Prec = QUANTIFICATION Mass (m/z)

20 Identification des protéines : itraq vs non-marqué Poids (µg) Marquage itraq Fractionnement (1ère dimension) Nombre de protéines 200 non SCX 116 (159) 200 oui SCX 310 (472) non-labeled 400 itraq K R

21 Affinité protonique et itraq L affinité protonique des amines tertiaires est supérieure à celle des amines primaires (50 kj/mole) Peptides nonmarqués 1273 Peptides itraq 7438 L itraq augmente l affinité protonique des peptides

22 Evaluation de la concentration des protéines par calcul du PAI PAI= nombre de peptides identifiés/nombre de peptides théoriques microg, µg, SCX, SCX, non-marqués non-labeled vs itraq 50 label-free itraq Number of identified proteins PAI 10 0 < >1 PAI

23 Nombre de protéines identifiées en fonction de la quantité Poids (µg) Marquage itraq Fractionnement (1ère dimension) Nombre de protéines 200 oui SCX 310 (472) 400 oui SCX 429 (492) itraq, SCX, 200microg vs 400 microg µg 400 µg < >1 PAI

24 Fractionnement en fonction du pi des peptides

25 Identification des protéines : SCX vs OFFGEL Poids (µg) Marquage itraq Fractionnement (1ère dimension) Nombre de protéines 400 oui SCX 429 (492) 400 oui OFFGEL 739 (879) SCX OFFGEL < >1 PAI

26 Efficacité de la séparation OFFGEL 90% Total identified peptides (%) 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% non-marqués itraq Introduction d un paramètre supplémentaire, le pi, pour valider l identification des protéines 10% 0% Nombre de fractions contenant un peptide unique

27 Classification des protéines en fonction du pi The human mammary epithelial cell proteome. Liu et al Proteomics (5): Protéome humain (NCBI human protein database) Classification of total identified proteins (A, C) and the human proteome (B, D) based on physiochemical 5 properties. pi distributions were plotted for the total identifications (A) and all human proteins (B) using 0 predicted pi values extracted from 3,7 NCBI human protein database, over increments of 0.1 ph units. MW distributions were plotted for the total Isoelectric identifications point (0.2 (C) unit andincrements) all human proteins (D) using 20 kda increments.

28 Classification des protéines en fonction de la masse The human mammary epithelial cell proteome. Liu et al Proteomics (5): Protéome humain (NCBI human protein database) Number of proteins 50 0 < >300 Molecular weight (20 kda increments)

29 Conclusion L itraq favorise l ionisation des peptides en MALDI Identification de 947 protéines (1111) à partir de 400 µg Le fractionnement OFFGEL permet d introduction d un filtre supplémentaire, le pi, pour la validation de l identification des protéines E. Ernoult, E. Gamelin, C. Guette, Proteome Science, sous presse.

30 Améliorations technologiques et injections multiples Nombre d expériences Quantité Marquage Séparation 1ère Dimension Séparation 2ème Dimension µg itraq OFFGEL nanolc-c18 N Nombre de protéines Total

31 Comparaison 2D-DIGE / marquage itraq 186 protéines (6,6%) 82 protéines (5,1%) itraq +/- 30% 2D-DIGE +/- 30%

32 Le plasma sanguin humain 22 protéines ~ 99% poids total Dynamique de concentration ~10 11

33 Traitement du plasma Conservation des échantillons Déplétion Digestion Multiple Affinity Removal Spin Cartridge Human 14 Proteominer Marquage itraq (4 ou 8 plasmas simultanément, soit 400 µg) Fractionnement OFFGEL 24 fractions Analyse LC-MS/MS Résultats : identification des protéines et quantification

34 Résultats Quantity (µg) Déplétion itraq Fractionation Protein number Peptide Number 400 no no 2DLC (SCX/C18) no no OFF-GEL (12 fractions) prots no OFF-GEL (24 fractions) prots yes OFF-GEL (24 fractions) prots yes OFF-GEL (24 fractions) Score : 95%

35 Comparaison Immunoaffinité / banque de peptides Quantité (µg) Déplétion itraq Séparation Nombre Protéines Nombre Peptides 400 MARS-14 oui OFFGEL (24 fractions) 3 expériences ProtéoM oui OFFGEL (24 fractions) 3 expériences

36 et la gamme de concentration

37 Equipe Protéomique Catherine Guette Emilie Ernoult Anthony Bourreau Catherine Hameline Muriel Bahut