Dosage des principaux acides organiques des vins et des sulfates par électrophorèse capillaire
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- Marie-Claude Laframboise
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1 Méthode OIV-MA-AS Méthode Type II et III Dosage des principaux acides organiques des vins et des sulfates par (Résolution OIV-Oeno 5/2006, révision per Oeno ) 1. Introduction Les acides tartrique, malique et lactique et sulfates sont séparés et dosés par après simple dilution et addition d'étalon interne. 2. Titre DOSAGE DES PRINCIPAUX ACIDES ORGANIQUES DES VINS ET DES SULFATES PAR ELECTROPHORESE CAPILLAIRE 3. Domaine d'application L' permet de doser les acides tartrique et malique des moûts ainsi que les acides tartrique, malique, lactique et les sulfates des vins préalablement dilués, dégazés et filtrés si besoin. 4. Définitions 4.1 Electrophorèse capillaire L' : ensemble de techniques qui utilisent un capillaire de silice de très faible diamètre pour séparer efficacement à l'aide d'un tampon approprié, à la fois des petites et des grosses molécules électriquement chargées en présence d'un courant électrique de fort voltage. 4.2 Tampon pour électrophorèse OIV-MA-AS : R2011 1
2 Solution contenant un ou plusieurs solvants et des solutés de mobilités électrophorétiques convenables capables de tamponner le ph de cette solution. 4.3 Mobilité electrophoretique Aptitude d'un ion à se déplacer rapidement sous l'effet d'un champ électrique. 4.4 Flux electroosmotique Ecoulement du solvant du tampon le long de la paroi interne du capillaire dû aux déplacements des ions solvatés sous les effets du champ et des charges électriques de la silice 5. Principe Les séparations des solutés d'un mélange par sont obtenues par migrations différentielles dans un électrolyte tamponné appelé tampon. L'électrophorèse se déroule dans un tube de silice de diamètre intérieur compris entre 25 et 75 µm. Les solutés à séparer sont entraînés simultanément par 2 forces qui peuvent agir dans le même sens ou en sens contraire. Ces deux forces sont dues au champ électrique et au flux électroosmotique. Le champ électrique est représenté par la tension en volts appliquée entre les électrodes ramenée à un centimètre de capillaire, il est exprimé en V.cm -1. La mobilité est une caractéristique de l'ion. Plus les molécules sont petites et chargées plus leur mobilité électrophorétique est importante. Dans le cas où la paroi interne du capillaire est non revêtue, les charges électriques négatives de la silice vont engendrer une fixation d'une partie des cations du tampon. La solvatation et le déplacement vers la cathode d'une partie des cations du tampon créent le flux électroosmotique. Les choix du ph du tampon et l'utilisation d'additifs permettent de contrôler le sens et l'intensité de ce flux électroosmotique. L'addition d'un ion chromophore dans le tampon permet l'obtention de pics négatifs qui représentent quantitativement les solutés à séparer qui n'absorbent pas à la longueur d'onde utilisée. OIV-MA-AS : R2011 2
3 6. Réactifs et produits 6.1 Produits purs de qualité pure pour analyse à 99 % au moins Sulfate de sodium ou sulfate de potassium Acide L-tartrique Acide D,L-malique Acide citrique monohydraté Acide succinique Acide D,L-lactique Dihydrogénophosphate de sodium Gluconate de sodium Chlorate de sodium Acide dipicolinique Bromure de céthyl-triméthyl-ammonium Acétonitrile pour CLHP Eau pure désionisée, ultrafiltrée Hydroxyde de sodium 6.2 Solutions Solution mère d'étalonnage Solution dans l'eau pure (6.1.13) des différents acides et sulfate à doser (6.1.1 à 6.1.6) à des concentrations exactement connues comprises entre 800 et 1200 mg l -1 Solution à conserver à +5 C pendant 1 mois maximum Solution d'étalon interne Solution de chlorate de sodium (6.1.9) à environ 2 g l-1 dans l'eau pure (6.1.13) Solution à conserver à +5 C pendant 1 mois maximum Solution d'étalonnage à injecter Dans une fiole jaugée de 50 ml de classe "A", déposer à l'aide de pipettes de classe "A": 2 ml de la Solution d'étalonnage (6.2.1) 1 ml de solution d'étalon interne (6.2.2) Compléter à 50 ml avec de l'eau pure (6.1.13) Homogénéiser par agitation Solution à préparer chaque jour OIV-MA-AS : R2011 3
4 6.2.4 Solutions d'hydroxyde de sodium Solution d'hydroxyde de sodium M Placer dans une fiole de 100 ml 4 g d'hydroxyde de sodium (6.1.14) Compléter avec de l'eau pure (6.1.13) Agiter jusqu'à dissolution complète Solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M Placer dans une fiole de 100 ml 10 ml d'hydroxyde de sodium M ( ) Compléter avec de l'eau pure (6.1.13) Homogénéiser Tampon électrophorétique Dans une fiole jaugée de 200 ml de classe "A", déposer g d'acide dipicolinique (6.1.10) g de bromure de céthyl-triméthyl-ammonium (6.1.11) 20 ml d'acétonitrile (6.1.12) 160 ml environ d'eau pure (6.1.13) Agiter jusqu'à complète dissolution (si besoin placer dans un bain à ultrasons pour éliminer les agrégats) Amener à ph 5.64 avec tout d'abord de la solution d'hydroxyde de sodium M ( ) puis avec de la solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M ( ) Compléter à 200 ml avec de l'eau pure (6.1.13) Homogénéiser par agitation Solution à préparer chaque mois. Conservation à la température du laboratoire. Ce tampon peut être remplacé par un produit équivalent disponible sur le marché. 7. Appareillage Un équipement d' nécessaire pour ces dosages contient essentiellement : Un passeur d'échantillons Deux flacons (vials) contenant du tampon Un capillaire de silice non revêtue de 50 µm de diamètre interne et de OIV-MA-AS : R2011 4
5 60 cm de longueur entre l'entrée du capillaire et la cellule de détection. De 7 à 15 cm, suivant les appareils, supplémentaires sont nécessaires pour que la sortie du capillaire soit immergée au centre d'un autre flacon Une alimentation haute tension de courant continu capable de délivrer des tensions de 30 à + 30 kv. Les électrodes immergées dans les deux flacons où débouchent les extrémités du capillaire sont reliées aux bornes du générateur Un système de pressurisation capable de faire circuler le tampon dans le capillaire et permettre l'injection de la prise d'essai Un détecteur UV Un système d'acquisition des données 8. Préparation des échantillons pour essai 8.1 Dégazage et filtration Les échantillons riches en gaz carbonique sont dégazés pendant 2 min aux ultrasons. Les échantillons troubles sont filtrés sur une membrane dont le diamètre des pores moyen est de 0,45 µm. 8.2 Dilution et ajout d'étalon interne Placer 2 ml d'échantillon dans une fiole jaugée de 50 ml. Ajouter 1 ml de solution d'étalon interne (6.2.2). Compléter à 50 ml avec de l'eau pure (6.1.13) Homogénéiser. 9. Mode opératoire 9.1 Conditionnement d un capillaire neuf (á titre indicatif) Circulation d'eau pure (6.1.13) en sens inverse (de la sortie du capillaire vers le flacon d'entrée) pendant 5 mn avec une pression de 40 psi environ (2,76 bar ou 276 kpa) Circulation d'hydroxyde de sodium 0,1 M ( ) en sens inverse pendant 5 mn à la même pression Circulation d'eau pure (6.1.13) en sens inverse (de la sortie du capillaire vers le flacon d'entrée) pendant 5 mn à la même pression Recommencer ce cycle : passages d'eau pure, d'hydroxyde de sodium 0,1 M, eau pure Circulation du tampon électrophorétique (6.2.5) en sens inverse pendant 10 mn. OIV-MA-AS : R2011 5
6 9.2 Reconditionnement d un capillaire en cours d utilisation (facultatif) Lorsque que la qualité des séparations devient insuffisante un nouveau conditionnement du capillaire s'impose. Si les résultats obtenus ne sont toujours pas satisfaisants, changer le capillaire et le conditionner. 9.3 Vérification de la qualité du capillaire (facultatif) Analyser à 5 reprises la solution d'étalonnage (6.2.3) dans les conditions d'analyses préconisées. 9.4 Conditions de séparation et de détection (à titre indicatif) Allumage de la lampe du détecteur 1 heure avant le début des analyses Rinçage du capillaire par circulation du tampon électrophorétique (6.2.5) pendant 3 mn en sens inverse sous une pression de 40 psi Injection par pression à 0,5 psi pendant 6 à 15 secondes des échantillons préparés en 8.1 La polarité est réglée afin que l'anode soit du côté du détecteur Appliquer une tension de 0 à 16 Kv en 1 mn puis de 16 Kv pendant 18 mn environ (la durée de la séparation peut légèrement varier en fonction de la qualité du capillaire) La température est maintenue à + 25 C La détection dans l'ultra violet est faite à 254 nm Rinçage du capillaire par circulation du tampon électrophorétique (6.2.5) pendant 2 mn en sens inverse sous une pression de 40 psi Changer le du tampon électrophorétique (6.2.5) contenu dans flacons d'entrée et de sortie tous les 6 injections au minimum. 9.5 Ordre dans lequel les analyses doivent être effectuées (à titre indicatif) Changer le tampon électrophorétique (6.2.5) à chaque nouvelle série d'analyses La séquence des analyses contient dans l'ordre : Analyse de la solution d'étalonnage (6.2.3) Analyse du matériau de référence (échantillon externe de OIV-MA-AS : R2011 6
7 concentration connue pour les différents acides à doser) Analyse des échantillons préparés en 8.2, les chromatogrammes devraient ressembler à ceux présentés en annexe A. A la fin des analyses effectuer un rinçage à l'eau pure (6.1.13) de 10 mn en sens inverse, (de la sortie du capillaire vers l'entrée), Eteindre la lampe du détecteur. 10. Calculs des résultats Les calculs sont faits à partir des surfaces des pics obtenues après intégrations. Les surfaces des pics de solutés de la solution d'étalonnage (6.2.3) sont corrigées en tenant compte des variations de surfaces des pics de l'étalon interne. Le coefficient de réponse pour chaque acide est calculé. Les surfaces des pics de l'étalon interne et des pics des solutés sont relevées pour chaque échantillon. Les surfaces des solutés à doser sont recalculées en tenant compte de nouveau des variations de surfaces des pics de l'étalon interne pour obtenir des surfaces dites "corrigées". Les surfaces corrigées sont ensuite multipliées par la valeur du coefficient de réponse correspondant. Il est possible d'utiliser un système automatisé de gestion des données, pour autant que celles-ci puissent être contrôlées conformément aux principes décrits ci-dessus et aux bonnes pratiques (calcul du facteur de réponse et/ou établissement d une courbe d étalonnage). FORMULE DE CALCULS Les abréviations utilisées pour le calcul de la concentration d'un acide sont données dans le tableau suivant: Les surfaces sont exprimées par les nombres entiers d'unités d'intégration. Les concentrations sont données en g/l. (ne conserver que deux décimales). OIV-MA-AS : R2011 7
8 ABREVIATIONS SOLUTION DE ECHANTILLON REFERENCE SURFACES DU PIC DOSE S AR S AE PICS D'ETALON S EIR S EIE INTERNE CONCENTRATION C AR C E La formule de calcul est: CAR SAE SEIR CE = SAR SEIE Chaque fois que cela est possible, l'analyse en double exemplaire permet de mettre en évidence une erreur éventuelle dans la reconnaissance des pics ou une imprécision des intégrations. Le passeur d'échantillons permet de réaliser les analyses en mode automatique tout au long du jour et de la nuit. 11. Fidélité 11.1 Organisation des essais Les essais interlaboratoires et leurs résultats sont décrits dans les annexes B1 et B Mesure de la fidélité ESTIMATION DE LA FIDELITE APRES ANALYSES INTERLABORATOIRES Nombre de laboratoires participants: 5 Résultats donnés en mg / l OIV-MA-AS : R2011 8
9 Acide tartrique Acide malique Acide lactique valeurs moyennes des concentrations valeurs moyennes des écarts types de répétabilité valeurs moyennes des écarts types de réproductibilité OIV-MA-AS : R2011 9
10 12. ANNEXES ANNEXE A ELECTROPHOREGRAMME D'UNE SOLUTION ETALON D'ACIDES OIV-MA-AS : R
11 ELECTROPHOREGRAMME D'UN VIN OIV-MA-AS : R
12 ANNEXE B1 Données statistiques obtenues à partir des résultats des essais interlaboratoire (2006) Conformément à l'iso :1994, les paramètres suivants ont été définis au cours d'un essai interlaboratoire. Cet essai a été conduit par le laboratoire de la Direction Générale de la Consommation et de la Répression des Fraudes de Bordeaux (France). Année de l'essai interlaboratoire : 2006 Nombre de laboratoires : 5 Nombre d'échantillons : 8 en double aveugle (2 vins blancs secs, 2 vins blancs liquoreux, 2 vins rosés et 2 vins rouges) OIV-MA-AS : R
13 ESSAIS INTERLABORATOIRES Dosage de l'acide TARTRIQUE par Identification de l'échantillon vins blancs vins blancs vins rosés vins rouges secs liquoreux A et D B et C E et F G et H I et J K et L M et N O et P Nombre de laboratoires participants Nombre de résultats acceptés Valeur moyenne en mg/l Valeur acceptée en mg/l Ecart-type de répétabilité (Sr) Coefficient de variation de répétabilité 1,4 1 7,7 1 2,2 1,9 1,8 1,3 Limite de répétabilité ( r ) Ecart-type de reproductibilité (SR) Coefficient de variation de reproductibilité 4,9 5 12,6 3,6 3 3,5 3,8 2,9 en % Limite de reproductibilité ( R ) OIV-MA-AS : R
14 Dosage de l'acide MALIQUE par Identification de l'échantillon vins blancs vins blancs vins rosés vins rouges secs liquoreux A et D B et C E et F G et H I et J K et L M et N O et P Nombre de laboratoires participants Nombre de résultats acceptés Valeur moyenne en mg/l Valeur acceptée en mg/l Ecart-type de répétabilité (Sr) Coefficient de variation de répétabilité 2,1 1,2 6,7 1,4 1,7 5,2 4,1 3,7 Limite de répétabilité ( r ) Ecart-type de reproductibilité (SR) Coefficient de variation de reproductibilité 13,6 9, ,6 14,7 9 14,1 7,6 en % Limite de reproductibilité ( R ) OIV-MA-AS : R
15 Dosage de l'acide LACTIQUE par Identification de l'échantillon vins blancs vins blancs vins rosés vins rouges secs liquoreux A et D B et C E et F G et H I et J K et L M et N O et P Nombre de laboratoires participants Nombre de résultats acceptés Valeur moyenne en mg/l Valeur acceptée en mg/l Ecart-type de répétabilité (Sr) Coefficient de variation de répétabilité 3,1 3,2 7,8 15,1 4,8 5,3 3,7 16 Limite de répétabilité ( r ) Ecart-type de reproductibilité (SR) 20,357 41, ,57 26,786 99,29 75,36 16,429 Coefficient de variation de reproductibilité 13,6 9, ,6 14,7 9 14,1 7,6 en % Limite de reproductibilité ( R ) OIV-MA-AS : R
16 ANNEXE B2 Données statistiques obtenues à partir des résultats des essais interlaboratoire (sulfates 2010) Conformément à l'iso :1994, les paramètres suivants ont été définis au cours d'un essai interlaboratoire. Cet essai a été conduit par le laboratoire Instituto dos Vinhos do Douro e do Porto (Portugal). Années de l'essai interlaboratoire : Nombre de laboratoires : 7 (un laboratoire a envoyé deux séries de résultats obtenus avec deux appareils différents) Nombre d'échantillons : 6 en double aveugle OIV-MA-AS : R
17 Indicateurs Nombre de groupes Nombre de répétitions Minimum (g/l K 2 SO 4 ) Maximum (g/l K 2 SO 4 ) variance de répétabilité s r 2 variance intergroupe s L 2 variance de reproductibil 2 ité s R Moyenne générale (g/l K 2 SO 4 ) Ecart-type de répétabilité (g/lk 2 SO 4 ) Limite r (g/l K 2 SO 4 ) CV de répétabilité Ecart-type de reproductibil ité (g/l K 2 SO 4 ) Limite R (g/l K 2 SO 4 ) CV de reproductibil ité Vin blan c (A/ G) Ros é (B/F ) Ros é (C/ O) Vin Rou ge (D/ M) Vin liqu eur (E/ N) Vin liqu eur (I/K ) Vin blan c (H/ Q) Vin roug e (J/P ) Vin liqu eur (L) ,71 0,34 0,40 0,62 1,79 1,06 1,38 1,96 2,17 0,88 0,54 0,52 0,75 2,40 1,35 1,70 2,30 2, , , , , , , , , , ,78 0,43 0,44 0,69 2,01 1,19 1,49 2,15 2,41 0,04 0,03 0,01 0,04 0,08 0,04 0,06 0,04 0,07 0,10 0 0,09 3 0,03 1 0,11 5 0,22 4 0,10 3 0,17 0 0,10 9 0,20 6 5% 8% 3% 6% 4% 3% 4% 2% 3% 0,05 0,06 0,04 0,05 0,16 0,11 0,10 0,14 0,20 0,14 8 0,16 5 0,11 8 0,13 2 0,45 4 0,31 2 0,28 7 0,38 9 0,57 2 7% 14% 10% 7% 8% 9% 7% 6% 8% HORRAT 1,1 2,1 1,5 1,1 1,6 1,7 1,3 1,3 1,7 OIV-MA-AS : R
18 13. Bibliographie ARELLANO M., COUDERC F. et PUIG.L ( 1997 ) : Simultaneous separation of organic and inorganic acids by capillary zone electrophoresis. Application to wines and fruit juices. Am. J. Enol. Vitic., 48, KANDL T. et KUPINA S. ( 1999 ): An improved capillary electrophoresis procedure for the determination of organics acids in grape juices and wine. Am. J. Vitic., 50, KLAMPF C.F. ( 1999 ): Analysis of organics acids and inorganics anions in different types of beer using capillary zone electrophoresis. J. Agric. Food Chem., 47, OIV-MA-AS : R
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