La Génomique Biologie, informatique, évolution. Hugues Roest Crollius Dyogen Group L3 Introduction aux sciences du vivant

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1 La Génomique Biologie, informatique, évolution Hugues Roest Crollius Dyogen Group L3 Introduction aux sciences du vivant

2 La «génomique fonctionnelle»

3 La «génomique évolutive» human baboon mouse dog cat cow pig chicken TAATGGTACCAGTTAGCAGAGT TAATGGTACCGGTTAACAGAGT CGATGGTGCCGGTCGACAGAGC CTATGGTCCCTGTTATCAGAGC GTATGGTCCCTGTCGTCAGAGC CCATGGTTCCCGTAGCCAGAGT CCATGGTTCCCGTAGCCAGAGT TTATGGTACCTGTTAACAGAGT human mouse rat dog

4 La production des données de génomique Séquençage manuel par radioactivité 100 b / jour Applied Biosystems 3730 (ici au Broad Institute (USA)) 1 Mb / jour Illumina MySeq2500 Capable de re-séquencer 1 génome humain / jour (40X; 135 Gb) 2013

5 La production des données de séquençage 326 millions 686 milliards

6 Bactérie Levure Nématode Drosophile 98 Humain Souris 02 Chimpanzee J.C. Venter Poule Cartographie génétique Cartographie physique Human Genome Project (HGP) Projet Celera Projet HapMap Séquençage très haut débit Aujourdhui l information issue du génome humain et du génome d espèces modèles nous permet de mieux comprendre certains processus biologiques Bientôt, l information issue de milliers de génomes humains, intégrée à des données épidémiologiques et de structure de la population, seront la base d une nouvelle médecine «personnalisée».

7 Whole genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenza Rd Fleischmann et al. (1995) Science 269: ! Preuve par l exemple: assembler un génome à partir d un séquençage aléatoire est possible (14 pages /17)! 1,830,137 bases! 38% GC! 6 opérons ARNr! Origine de réplication trouvée! 1743 gènes annotés! 736 gènes sans rôle assigné! ~50% des protéines connues de E. coli n ont pas de similarité! Quelques conclusions biologiques générales:! voies métaboliques absentes et présentes! gènes de pathogénicité!

8 Life with 6000 genes Science (1996) Vol. 274: (Saccharomyces cerevisae)! 1 er génome eucaryote séquencé! 600 chercheurs, 100 laboratoires, le plus grand projet décentralisé de la biologie moléculaire!!! Seules 43,3 % des protéines ont une fonction connue ou «suggérée»! Beaucoup de régions du génome sont dupliquées! Tous les gènes d histones sont présents (dont H1)!

9 Genome Sequence of the Nematode C. elegans: A Platform for Investigating Biology Science (1998) vol. 282: Conséquences politiques!! Un génome eucaryote complexe peut-être séquencé.! le projet a révélé l importance de la bioinformatique (AceDB, GeneFinder)! Un modèle de projet «ouvert»: accès libre au matériel et aux données! Résultats scientifiques!! gènes, trois fois plus que la levure! La densité en gène est plus importante près des centromères (sauf sur le X)! Les éléments répétés sont plus nombreux vers les télomères! Les extrémités des chromosomes seraient des régions à évolution plus rapide! 32 % des protéines de C. elegans sont similaires à des protéines humaines, 70% des protéines humaines sont similaires à celles de C. elegans!

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11 Initial sequence of the chimpanzee genome and comparison with the human genome Nature (2005) vol 439:69-87! 1,23 % de divergence nucléotidique avec l espèce humaine sous forme de SNPs, dont 1,06% fixé au cours de l évolution (ce qui fait ~ 30 millions de bases).! 1,5 % de la séquence euchromatique de chaque espèce lui est spécifique (insertions ou délétions; ~45 Mb)! 29% des protéines sont identiques entre les 2 espèces, la plupart des autres ne divergent que par 2 acides aminés! Les protéines de la réponse immunitaire, de la reproduction et de l olfaction divergent plus vite que les autres! De nombreuses «pépites» sur les gènes spécifiques à l espèce humaine (éliminé du chimpanzé) ou vice-versa, parfois en liaison avec des maladies humaines. Certaines mutations humaines causant des maladies sont en fait l allèle sauvage «ancestral» (ex: predisposition au diabète de type 2)!

12 Le génome Humain ~ Tout un symbole

13 Un symbole de l opposition «privé - public»!! Celera (Craig Venter)!! Human Genome Project (F. Collins, R. Waterston, J. Sulston, P. Green!!!Opposition!!!- sur les finalités!!!- l accès aux données!!!- la stratégie! Un symbole de la médiatisation de la science!! Course à la (aux) publication(s)! battage médiatique intense! Reconnaissance par le monde politique!

14 La variabilité génétique «La» séquence du génome humain disponible dans les bases de données représente en réalité un génome fictif: il s agit d un assemblage de l ADN obtenus de plusieurs individus. Cette séquence ne contient pas de variabilité (polymorphisme allélique). Cette séquence est conventionnellement utilisée comme référence. Mais la population humaine est composée de > 6 milliards d individus, chacun avec un génome qui lui est unique. En plus des influences de l environnement, cette variabilité entre individus est l un des déterminants majeurs de la morphologie, des propriétés physiologique, du comportement, de la santé des individus. Comment se manifeste cette variabilité génétique?

15 A haplotype map of the human genome Nature (2005) vol 437: ! Nous ignorons encore les causes génétiques de la plupart des maladies humaines: troubles maniaco-depressifs, réponses aux anti-hypertensenseurs, etc! Nous savons que probabement la moitié des facteurs de risques à la racine de ces maux sont d origine génétique.! SNPs ont été testés dans 269 individus appartenant à 4 groupes:! population des Yoruba (Ibadan) au Niger! familles du CEPH (Utah, USA)! population chinoise (Han) de Beijing! population japonaise de Tokyo!

16 A haplotype map of the human genome Nature (2005) vol 437: ! Des confirmations:!! Les échantillons ne sont pas homogènes!!- la population du Niger est plus riche en SNPs de faible fréquence!!! Mais nous sommes bien de la même espèce :-)!!- seulement 16 SNPs sur 1 million sont «fixés» dans une population par! rapport aux autres!! Quelques! surprises:!! La plupart des variants dans la population sont rares:!!- 46 % des SNPs ont une fréquence d allèle minoritaire (FAM) < 0.05!!- 9% ne sont vus que dans un seul individu.!! La plupart des variants sont largement partagés!!- 90% des variants observés dans un individu sont des SNPs! «communs»!

17 Séquençage par synthèse (SBS)

18 Le séquençage des génomes Il a fallu créer une nouvelle division dans les bases de données: Short Read Archives (SRA) 4,5 trillions 573 trillions

19 Le séquençage des génomes La séquence d un génome est donc une succession de condgs organisés en scaffolds. Selon le degré de finidon, les scaffolds peuvent être ancrés sur une carte génédque, ordonnés et orientés, et les trous de séquence entre les condgs et scaffolds peuvent être bouchés. Les génomes eucaryotes séquencé à très haut niveau de qualité (< erreurs/base) Saccharomyces cerevisiae Caenorhabdi2s elegans Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana Homo sapiens Mus musculus Danio rerio Levure de boulanger Ver nématode Mouche à vinaigre ArabeTe Humain Souris Poisson zèbre

20 Le séquençage des génomes Le «N50», une mesure devenue classique pour évaluer la condnuité d un assemblage. Le N50 est la taille du scaffold (ou condg) tel que 50% des bases de l assemblage sont comprises dans des scaffolds de taille supérieures à cete taille. Trier par taille Scaffolds de l assemblage 50% des bases N50 50% des bases La taille du segment (scaffold) telle que la moitié de la somme des bases de tous les segments (assemblage) soit compris dans des segments de taille supérieure.

21 Le génome humain en 2013

22 Le génome du cheval (Equus caballus) Un génome à l état de «brouillon» L assemblage actuel (2013) est la version version EquCab2, obtenu par la technique Whole Genome Shotgun (WGS) avec une couverture de 6.79x en lecture «Sanger». Une jument appelée "Twilight" fut sélecdonnée pour obtenir le génome référence de l espèce. Le projet fut coordonné et le génome séquencé par Le Broad InsDtute (USA). La taille N50 des condgs est de kb, et la somme totale des condgs est de 2.43 Gb. En incluant la taille esdmé des trou entre les condgs dans les scaffolds, l assemblage couvre 2.68 Gb.

23 Un génome à l état de «brouillon» Platyfish (Xiphophorus maculatus) L assemblage (version XipMac4.4.2) a été produit par The Genome InsDtute, Washington University School of Medicine (USA). Cet assemblage a été réalisé par whole genome shotgun à pardr de séquences produites par la technologie 454 et Illumina, pour une couverture totale du génome de ~19.6X.

24 Le séquençage du génome humain Les gènes. Après le séquençage, la première étape de «valorisadon» de la séquence est d y idendfier (annoter) les régions foncdonnelles, principalement les gènes codant les protéines. Chaque génome eucaryote condent des milliers de gènes. On ne peut pas envisager de faire une «expérience» pour idendfier chaque gène: il faut recourir à des logiciels pour réaliser une annotadon automadque, ou à des ressources génomiques. Annoter les gènes automadquement est une tâche difficile et un champs encore très «ouvert» de la bioinformadque. Dans les génomes eucaryotes, les gènes ont des structures extrêmement variables: il difficile d établir des «règles».

25 Combien(y(a(t,il(de(gènes(dans(le(génome(humain?( Premières(estimations((année(2000)( ( Chr. 20 Chr. 21 Chr. 22 Taille chromosome 59,42 Mb 33,54 Mb 33,46 Mb Gènes connus Autres Pseudogènes 168 (18,7%) 59 (20,7%) 134 (19,1%) Densité en gènes 12,2 g./mb 6,7 g./mb 17,0 g./mb Tailles des gènes Connus 51,3 kb 57,0 kb kb Pseudogènes 1,9 kb Taille des exons Connus 294 bp bp Pseudogènes 499 bp Nombre d exons Connus 10,3 Pseudogènes 1,

26 EsDmaDons du nombre de gènes dans le génome EsDmaDons publiées (Fields et al.) (Antequera and Bird) (Lander et al.) (Liang et al.) (Ewing and Green et al.) (Roest Crollius et al.)

27 BLAST Altschul et al. (1990) Basic Local Alignment Search Tool. J. Mol. Biol. 215: Nombre total de citations : (en novembre 2013) L article le plus cité en sciences du vivant 27

28 Query: RYKELTEQQMPGALPPECTPNMDGPHARSVRREQSLHSFHTLFCRRCFKYDRFLH +YKELTEQQ+PGALPPECTPN+DGP+A+SV+REQSLHSFHTLFCRRCFKYD FLH Sbjct: KYKELTEQQLPGALPPECTPNIDGPNAKSVQREQSLHSFHTLFCRRCFKYDCFLH Query: LLFQLFLALSDLKQLRILHTDLKPDNVMLVD--EKELKIKLMDFGLALLTHEAKT--GTI +L Q+ AL LK L ++H DLKP+N+MLVD + ++K++DFG A +H +KT T Sbjct: ILQQVATALKKLKSLGLIHADLKPENIMLVDPVRQPYRVKVIDFGSA--SHVSKTVCSTY Query: SPWTFPS*FLMSSSMKVPSWSRISSPM*GIL*STVSSST SPWTFPS* L+SSS+KV S S SSPM*GIL T SSST Sbjct: SPWTFPS*LLISSSIKVSSSSFTSSPM*GILHKTXSSST Query: VNALAQYSHNEDEEEEEEHDFKVDKT-DLCDSKKHPE VNAL QY+ ++D K DL D + E Sbjct: VNALGQYNDDDDDDDGDDPEEREEKQKDLEDHRDDKE 28

29 BLAST Query mot de taille W = 11 bases A T T G C G T A T G C A G C G T A G C A A T T G C G A T A C! Subject Match exact T T A C G C G A T G T A G A C A G C G T A G C A A T G T T G C A! 29

30 Blast: W Query A T T G C G T A T G C A G C G T A G C A A T T G C G A T A C! Subject T T A C G C G A T G T A G A C A G C G T A G C A A T G T T G C T A T G C A G C G T A G C A A T! ! - 8 < X! X = seuil maximal de mismatch autorisé = 21 par défaut Matrice de score NUC.4.4 A T G C N! A ! T ! G ! C ! N ! 30

31 TBLASTX, BLASTP, BLASTX Mot W = 3 a. a. L E C N Q L I P I A H K T C P E G K N L H K T! H L T! H V T! H Y T! Y K T! N K T! Automate (Seuil T ) L K C H N T Q L P F I Y K T C P E G K N Extension (Seuil X ) 31

32 Matrice de score BLOSUM62 A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z X * A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z X *

33 Nombre de gènes dans les génomes eucaryotes Levure 6000 Nematode Drosophile Arabidopsis Humain

34 EVOLUTION MOLECULAIRE Quelques principes 34

35 MutaDon Délétère Neutre Avantageuse SélecDon négadve Dérive génédque SélecDon posidve DispariDon 0% Fréquence Intermédiaire 0-100% FixaDon 100%

36 Evolution moléculaire Les fréquences des variations au sein d une population fluctuent au cours du temps. Les variations NEUTRES fluctuent de manière aléatoire Les variations AVANTAGEUSES sont sélectionnées et augmentent en fréquence Les variations DELETERES sont éliminées et diminuent en fréquence 1 P 0 Générations (temps) Pour estimer les fréquences dans une population, il faut échantillonner de nombreux individus

37 La sélection naturelle

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39 Cys Ser Arg Cys Lys Gly His Cys Arg Ala Arg! TGT TCG AGA TGT AAG GGC CAT TGT CGA GCA AGA!!!! Cys Leu Arg Cys Lys Arg His Cys Arg Ala Lys! TGT TTG AGA TGT AAA CGC CAT TGT AGA GCT AAA!!!! Observé Attendu neutre Substitutions synonymes 3 Substitutions non-synonymes 3 ~3 X 4 = 12 è 75% des mutations sont délétères

40 d S : taux de substitution synonyme (K s ) d N: taux de substitution non-synonymes (K a ) ω = d N / d S ω ~ 1 ω << 1 ω >> 1 è è evolution sous sélection négative è evolution sous sélection positive

41 Fréquence des valeurs de ω pour 835 paires de gènes orthologues ratsouris (les valeurs indiquées en abscisse sont la moyenne de la classe) Hurst DL (2002) TIGS 18:

42 Génomique Comparative L alignement multiple entre génome est un outil fondamental pour identifier des régions conservées au cours de l évolution (par sélection négative) UCSC Genome Browser : Une région de 100 pb sur Xq26:

43 Génomique ComparaDve: Annoter les Gènes Tous les mammifères possèdent à peu près le même nombre de gènes, et partagent les mêmes grandes fonctions de la vie - reproduction - développement - système nerveux central - système digestif - système musculaire -. On estime que les gènes présents dans le génome de la souris ou du chien peuvent être informatifs pour identifier les gènes humains (ou vice-versa) simplement par alignement de séquence. Généralisation: Toutes les informations importantes contenues dans le génome (codage des protéines et autres ) sont susceptibles d êtres partagées entre espèces différentes et donc d être découvertes par alignement de séquences.

44 Génomique Comparative (5) Les séquences fonctionnelles les mieux connues dans le génome humain sont les exons des gènes codant les protéines. On peut les comparer par paires, mais les comparer toutes ensemble est plus informatif, à l aide d un alignement multiple Les exons codant sont particulièrement ben conservés, à travers l ensemble des vertébrés (sélection négative). Les régions «UTRs» évoluent plus vite. Les introns ne montrent pas de conservation particulière (évolution neutre) Les espèces trop proches de l homme sont peu informatives (ex: Macaque)

45 Migration, adaptation et selection naturelle Les variations génétiques qui confèrent un avantage pour une meilleure adaptation seront sélectionnés

46 Different types de sélection naturelle SELECTION POSITIVE Ex. G6PD, CD40 protection contre la malaria en Afrique SELECTION PURIFICATRICE Ex. Beaucoup de gènes humain SELECTION BALANCEE Ex. MHC worldwide, HbS en Afrique (malaria) Mutation avantageuse Mutation délétère mutation balancée Mutation neutre

47 La cas de la lactase La plupart des adultes ne peuvent métaboliser le lactose, sucre principal du lait, car la fonction de l enzyme lactase-phlorizin hydrolase diminue après le sevrage. Mais certaines population, principalement celles descendantes de population ayant pratiqué la domestication du bétail, maintiennent cette possibilité à l âge adulte. Fréquences de la «persistance de la lactase» > 90% chez les suédois et les danois ~ 50% chez les français et les espagnols 5% - 20% chez les africains de l ouest «non-pastoraux» 1 % chez les chinois Mais 90% chez les Tutsis, Fulani, populations africaines «pastorales». Certains SNPs ont été retrouvés dans les introns d un gènes voisin de la lactase, et sont associé au phénotype «persistance de la lactase»

48 La cas de la lactase Distribution du phénotype «persistance de la lactase» dans le monde

49 S. A. Tishkoff et al., Convergent adaptation of human lactase persistence in Africa and Europe. Nature genetics 39, 31 (2007). La cas de la lactase Intron 13 Europe du sud Danois et Suédois

50 La cas de la lactase Afrique Danois et Suédois Europe du sud S. A. Tishkoff et al., Convergent adaptation of human lactase persistence in Africa and Europe. Nature genetics 39, 31 (2007).

51 La cas de la lactase Conclusions: Les mutations de la lactase sont un cas classique d évolution convergente: le même phénotype est sélectionné de manière indépendante dans des populations différentes, mais pas par le biais du même génotype. Les mutations favorables sont dans les introns d un gènes voisin du gène dont la protéine confère l avantage Les mutations augmentent la production de lactase au cours de la vie adulte (modification de l expression du gène)