Séquençage haut débit (Next Generation Sequencing) 12/03/2012 Pascal Le Bourgeois, M1BBT, EM8BTGM 1

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1 Séquençage haut débit (Next Generation Sequencing) 1

2 Pyroséquençage (454) Margulies M. et al. (2005). Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437: Pas de banques dans E. coli Genome Sequencer FLX titanium 700 Mb- 1 Gb (140 x le génome d E. coli) / run 10 6 sequences de bases / run ( 2

3 Pyroséquençage (454) 1) Préparation de la librairie d ADN simple brin Cassure aléatoire (nébulisation) du génome en fragments d environ 500 pb - Réparation des extrémités (bouts francs) -Phosphorylation du 5 -Sélection de la taille des fragments d ADN 12/03/2012 ( Pascal Le Bourgeois, M1BBT, EM8BTGM 3

4 Pyroséquençage (454) 1) Préparation de la librairie d ADN simple brin Ligature de 2 adaptateurs (double brins) 5 L adaptateur B possède un groupement biotine en types de fragments générés Seuls les fragments de type A-B/B-A sont conservés 12/03/2012 ( Pascal Le Bourgeois, M1BBT, EM8BTGM 4

5 Pyroséquençage (454) 1) Préparation de la librairie d ADN simple brin Couplage ADN biotinylé billes magnétiques Streptavidine Le type A-A est éliminé par rinçage 5 5 Dénaturation (ph 12) de l ADN double brin Récupération de l ADN simple brin de type A-B /B-A par élimination des billes 12/03/2012 ( Pascal Le Bourgeois, M1BBT, EM8BTGM 5

6 Pyroséquençage (454) 2) PCR en émulsion (empcr) Couplage (par hybridation) de l ADN simple brin billes contenant l amorce A fixée en ADN par bille (dilution) Incubation des billes dans un mélange réactionnel (constituants PCR + huile + eau) Emulsion PCR (~10 6 copies par bille) 12/03/2012 ( Pascal Le Bourgeois, M1BBT, EM8BTGM 6

7 Pyroséquençage (454) 2) PCR en émulsion (empcr) 7

8 Pyroséquençage (454) 2) PCR en émulsion (empcr) 5 5 A A 8

9 Pyroséquençage (454) 2) PCR en émulsion (empcr) 9

10 Pyroséquençage (454) 2) PCR en émulsion (empcr) B A B B A 10

11 Pyroséquençage (454) 2) PCR en émulsion (empcr) 11

12 3) Pyroséquencage Pyroséquençage (454) Répartition des billes contenant les produits PCR sur la plaque de séquençage (PicoTiterPlate) ~ 1,6 millions de trous 1,6 millions de réactions de séquençage en parallèle (en théorie). Addition des constituants de séquençage (ADN polymérase, sulfurylase, luciférase, apyrase, amorce ADN ) sur nanobilles ( Introduction de la plaque dans l appareil 12

13 3) Pyroséquencage Pyroséquençage (454) (Svantesson A. et al., Biophys. Chem., 2004) (Margulies M. et al., Nature 2005) 13

14 3) Pyroséquencage Pyroséquençage (454) Svantesson A. et al., Biophys. Chem.,

15 Le système Illumina (Séquençage par Synthèse, SBS) HiSeq 2000 (Solexa/Illumina) Read Length Single Flow Cell Run Time Dual Flow Cell Run Time Dual Flow Cell Output 1 x 36 bp ~ 1.5 days ~ 2 days Gb 2 x 50 bp ~ 4.5 days ~ 5.5 days Gb 2 x 100 bp ~ 8.5 days ~ 11 days Gb 15

16 Le système Illumina 1) Préparation de la librairie d ADN simple brin Fragmentation-réparation de l ADN génomique Ligature adaptateur par «TA cloning» Sélection de la taille des fragments d ADN 16

17 Le système Illumina 2) Amplification sur lame de verre (bridge-pcr) P5 P7 17

18 Le système Illumina 3) Séquençage par synthèse (SBS) Terminateurs réversibles CATAGT CCCCCC 18

19 Des «lectures» (reads) aux génomes Il existe différentes stratégies de séquençage Taille 1 20 kb 20

20 Des «lectures» (reads) aux génomes Shotgun read (single ou paired-end) - Alignement multiple des «lectures» - Construction des séquences consensus (contigs) Séquences sans ambigüités (pas de N) L obstacle majeur à l assemblage : les séquences répétées - Les opérons ribosomiques. 5 kb, présents de 1 à 10 copies par chromosome - Les IS (séquences d insertions) pb, présentes de 1 à > 20 copies - BIMES (Bacterial interspersed mosaic elements, pb) - MITES (Miniature inverted repeat transposable elements, pb) - RUP / BOX ( 100 pb, > 100 copies, spécifique de S. pneumoniae) - La taille des «reads» influence le nombre de contigs obtenus. Plus les «reads» sont courts, plus il est difficile de «passer» les séquences répétées et obtenir un nombre minimum de contigs. 21

21 Des «lectures» (reads) aux génomes Les parades: - Ordonner et orienter les contigs sur un génome de référence (re-séquençage ou génomes peu variables) 22

22 Des «lectures» (reads) aux génomes Les parades: - Ordonner et orienter par librairies «mate-pair» ( Long Paired End) 23 P. Le Bourgeois, oct 2011

23 Puces à ADN 24

24 Deux Classes de Puces Par greffage : on synthétise les sondes on les fixe tour à tour Avantages : pas de restriction de longueur procédé flexible Inconvénients : densité «moyenne» pas encore d industrialisation Coût moyen Par synthèse in situ : on synthétise directement les sondes sur la surface Avantages : haute densité industrialisable Inconvénients : procédé rigide seulement oligomères Coût dégressif 25

25 Puces par greffage («inkjet printing») - Fragments PCR, cdna, ou oligonucléotides (25-80 mers) - Densité moyenne (< points) 26

26 Puces par synthèse in situ 3 systèmes commercialisés Affymetrix Oligonucléotides de 25 mers < 1, sondes par puce Agilent Oligonucléotides de 60 mers 10 6 sondes par puce Nimblegen (Roche) Oligonucléotides de mers < 1, sondes par puce 27

27 Puces par synthèse in situ Affymetrix Photolithographie par masques 1) 2) (Miller M B, Tang Y Clin. Microbiol. Rev. 2009;22: ) 1) Silanisation de la lame de verre 2) Addition «linker» photosensible ( ) 3) 1 er cycle de déprotection 3) 28

28 Puces par synthèse in situ Affymetrix 29

29 Nimblegen Puces par synthèse in situ Photolithographie par micromiroirs (Maskless Array Synthetiser) (Miller M B, Tang Y Clin. Microbiol. Rev. 2009;22: ) 30

30 Puces par synthèse in situ Agilent Synthèse base par base (impression «jet-d encre») 31