Diagnostic prénatal non invasif : Du GénotypageRhésus Fœtal au Diagnostic de la Trisomie 21

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1 Diagnostic prénatal non invasif : Du GénotypageRhésus Fœtal au Diagnostic de la Trisomie 21 Dr. A. Levy-Mozziconacci UniteFonctionnelle de Biologie Materno-Fœtale et Centre de Médecine Fœtale, APHM, AMU, Marseille

2 LE DIAGNOSTIC PRENATAL Diagnostic Prénatal Invasif: Ex : Amniocentèse, Placentocentèse, sang de cordon Diagnostic prénatal non invasif Isolement de l ADN fœtal dans le sang maternel Depuis 1975 Risque de perte fœtale : > 1% des grossesses Depuis 2000 Risque de perte fœtale : 0 13

3 GRAAL pour certain COUPE DU MONDE pour d autres L enjeu est majeur!!! Mais la difficulté d y arriver aussi

4 Quelles doivent être les caractéristiques de ce diagnostic? FIABILITE : 100% APPLICABLE A TOUTES LES FEMMES UTILISABLE EN ROUTINE COUT RAISONNABLE

5 Isolement de l ADN fœtal dans le sang maternel Centrifugation Culot cellulaire Cellules Foetales

6 Quels sont les sources non invasives de matériel fœtal? LES CELLULES FŒTALES? ETUDE NIFTY (2002) Taux d echec : 17% Taux de détection : 74,4% Prélèvement ENDOCERVICAL Sifakis et al., Early Human Development, 2010 SANG MATERNEL Paterlini-Brechot et al., Lancet 2003

7 Quels sont les sources non invasives de matériel fœtal? ADN/ARN FŒTAL EXTRACELLULAIRE DANS LE SANG MATERNEL

8 Isolement de l ADN fœtal dans le sang maternel Centrifugation Culot cellulaire Cellules Foetales Plasma ou Sérum ADN Fœtal «libre» Lo et al., 1998

9 Acides nucléiques libres circulants 1948: présence d ADN et D ARN libre plasmatique (Mandel et al.,) : augmentation ADN sérique chez des patients porteurs de tumeur solide 1994 : découverte de mutation oncogène à partir de l ADN sérique 1998 : Mise en évidence de l ADN Fœtal circulant dans le sang maternel (Lo et al., 1998) Foetus

10 Analyse quantitative de l ADN Fœtal dans le Sang Maternel Terme ADN Fœtal/ Plasma maternel ADN Fœtal/ Culot cellulaire SA 3,4 % 0,001% X SA 6,2 % 0,01 % X 620 Lo et al., 1998

11 Lo et al., 1999 PCR quantitative en temps réel : RQPCR

12 ANEC : Origine placentaire Microparticules 500 nm Exosomes 100 nm Hahn S et al. Placenta Aug. Review. Bonello N.et al 2010

13 Isolement de l ADN fœtal dans le sang maternel Centrifugation ADN Maternel: 94 à 97% ADN Fœtal: 3 à 6 % Culot cellulaire Plasma ou Sérum Cellules Foetales ADN Fœtal «libre» Lo et al., 1998

14 Acides nucléiques circulants extracellulaires (ANEC) 2 Approches PCR quantitative Tps réel ( 2000) Séquenceur très haut débit (2014) Identification d un GENE fœtal non présent chez la mère Sexe gène SRY -Maladie liée à l X:Hyperplasie des surrénales, Quantification de l ADN fœtal Trisomie 21 et autres Aneuploïdies Rhésus gènes Rhésus Alloimmunisation foeto-maternelle

15 RhD- FREQUENCE EN FRANCE Population caucasienne : 15% Population Afrique subsaharienne : 7% Population asiatique : 0,3% En France : RHD-femmes enceintes/an femmes RHD-enceintes d un fetusrhd + : Risque d immunisation

16 RhD Négatif et génotype RhD Pos RHD Neg Fréquence du Phénotype RhD- Caucasiens : 15% ( délétion RHD >96%)

17 Prévention de l allo-immunisation RhD foeto-maternelle «Lorsque le génotypage fœtal RhD sur sang maternel peut être réalisé, ilest recommandé de l appliquer afin de limiter la prophylaxie Rhaux seules femmes enceintes d enfant RhD positif» (Grade C)

18 < 12 SA SA Injection d IgG anti -D ciblée En cas d évènements cliniques sensibilisants Patiente RhD négatif non immunisée 60% Fœtus RhD positif ou indéterminé Génotypage RhD fœtal 40% Fœtus RhD négatif Injection d IgG anti -D ciblée En cas d évènements cliniques sensibilisants SA RAI SA Injection systématique IgG anti-d : 300 µg IM Pas de prophylaxie Ni ciblée Ni systématique Accouchement Bilan Immuno-Hématologique Mère et Enfant

19 Représentation de l organisation génomique des haplotypes RH D + et RH D - RhD Pos RHD psy RhD variant RHD Neg Caucasiens : 15% ( délétion RHD >96%) Africains : 3-5% ( 67% sont RHD psy, 18% délétion RHD)

20 Quelles doivent être les caractéristiques de ce diagnostic? FIABILITE : 100% APPLICABLE A TOUTES LES FEMMES UTILISABLE EN ROUTINE COUT RAISONNABLE

21 Structure du gène et de la protéine RH D RHD SMP1 RHCE

22 Corrélation génotype/phénotype Classification Phénotype Protéine Gène RhD neg Rh D neg Absence Deletion D faible Anomalie quantitative Rh - ou douteux avec Du+ Subst. a.aminé Tmemb ou Intra Cell ( Anti-D : 0) Mutation gène présent Anomalie qualitative D partiel Rh - ou douteux ou Rh D + avec Du douteux Recherche D partiel ( EFS) Subst. a.aminé Surface GR ( Anti-D possible) Mutation gène présent D ψ Rh D Neg Absence (Anti-D +) Insertion 36pb (intron4-exon5) gène présent *

23 Type Allèle RHD(V270G) RHD (L18V, V270G) RHD (T201R, F223V) Nucléotide changé T G en 809 C G en 52 G A en 809 C G en 602 T G en 667 G A en 819 Densité en ag/ cellule Haplotype CDe cde cde Risque d immunisation Pas d allo-anti-d documenté Peut causer une immunisation anti-d Des allo-anti anti D peuvent être observé 5 RHD (A149D) C A en cde? 11 RHD (M295) G T en cde ou CDe Allo-anti-D à titre élévé documenté avec l haplotype cde 17 RHD (R114W) C T en CDe Pas d allo-anti-d documenté Rhesusbase

24 Partenariat avec la Tunisie

25 VP 1994 FP 32 VN 777 VN FN 7 (n= 2810) sensibilité 99,65% spécificité 96,04% VPP 98,42% VPN 99,11% exactitude 98,61% 2% de cas où le génotypage Rhesus foetal sur sangmaternel n a pas pu être conclu

26 CREATION D UNE PLATEFORME PACA DE DPNI : Diffusion des analyses de DPNI dans toute la région PACA ( financement ARS) : Création d un réseau de soin PACA autour d un seul laboratoire REFERENT (APHM) -750 prescripteurs PACA -Toutes les maternités publiques et privées -Les PMI Laboratoires privés 20

27 Acides nucléiques circulants extracellulaires (ANEC) 2 approches PCR quantitative Tps réel ( 2000) Séquenceur très haut débit (2014) Identification d un GENE fœtal non présent chez la mère Sexe gène SRY -Maladie liée à l X:Hyperplasie des surrénales, Quantification de l ADN fœtal Trisomie 21 et autres Aneuploïdies Rhésus gènes Rhésus Alloimmunisation foeto-maternelle

28 Prénatal diagnosis, 2012,32:1-2

29 Séquençage à très haut débit (Technologie Illumina) Norwitz, Rev Obstet Gynecol. 2013;6(2):48-62

30 Publications 2012 Populations à haut risque Etude N N aneuploidies Sens. Spéc. Sparks 167 T21 : 36 T18 : 8 T21 : 100% T18 : 100% T21 : 100% T18 : 100% Aschoor 397 T21: 50 T18 : 50 T21 : 100% T18 : 98% T21 : 100% T18 : 100% Bianchi 532 T21 : 89 T18 : 36 T13 : 14 XO : 16 T21 : 100 % T18 : 97,2 % T13 : 78,6% XO : 93,8% T21 : 100% T18 : 100% T13 :100 % XO :99,8 % Norton 3228 T21 : 81 T18 : 38 T21 : 100% T18 : 97,4% T21 : 99,97% T18 : 99,93%

31 Conclusions sur l évolution du dépistage de la trisomie 21 Période Type de dépistage Sensibilité Faux + Années 70 Age maternel 30% 5% Années 80 Age + MS 2è T 70% 5% Années 90 Age + CN 80% 5% Années 2000 Age + CN + MS 1 er T 85-90% 3-5% Années 2010 DPNI > 99% <1%

32 Trisomie 21: avis favorable du comité d'éthique sur le nouveau test de diagnostic LEXPRESS.fr, publié le 25/04/2013 Le Comité d'éthique a indiqué que le nouveau test de dépistage de la trisomie 21 "correspond à une amélioration technique du dépistage" actuel, par sa "plus grande facilité" et avec "moins d'effet secondaires".

33 ACTUEL MST1 AVENIR MST1 >1/250 5% des grossesses >1/250 Recherche T21 sur ADN fœtal/ Sg maternel Si positif 1% des grossesses Prélèvement invasif FISH, Caryotype foetal

34 Insertion dans le dépistage actuel? Option 1 Option 2 Option 3 Test combiné DPNI DPNI à 10 SA DPNI Confirmation par Test invasif Confirmation par Test invasif Echo 12 SA Test combiné si échec DPNI Test invasif pour confirmation ou signe d appel écho

35 Et demain

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