VECTEURS ET BANQUES VECTEURS ET BANQUES. Définitions. DEFINITIONS VECTEURS et CLONAGE BANQUES. Utilité Principe Différents vecteurs / différents usage

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1 VECTEURS ET BANQUES VECTEURS ET BANQUES Yann audic _ DEFINITIONS VECTEURS et CLONAGE Utilité Principe Différents vecteurs / différents usage BANQUES Principe Banques génomiques Banques d'adnc Normalisation 2 Définitions Un vecteur est une séquence d'adn permettant la propagation, la sélection, la modification d'une séquence d'adn d'intérêt. En bref l'étude et la manipulation d'une séquence d'adn isolée. Le clonage est l'action d'isoler et d'insérer dans un vecteur un fragment d'adn d'intérêt pour le multiplier à l'identique. L'ADN génomique est le support physique de l'ensemble des gènes de la cellule l'adn complémentaire (ADNc) est la copie en ADN des ARNm. AAAAAAA...AAA Transcription Epissage AAAAAAA...AAA ADN génomique pre-arnm ARNm ARNm Transcriptase inverse ADNc 3 IN VITRO 4 1

2 AAAAAAAAAAAAA OLIGOdT VECTEURS ET BANQUES Reverse Transcriptase NNNNNN Reverse Transcriptase AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTT Oligonucleotide aleatoire : un mélange d'oligonucleotides de 6 nucleotides de toutes les séquences possibles : 4 6 = VECTEURS et CLONAGE Utilité Principe Différents vecteurs / différents usage BANQUES Principe Banques génomiques Banques d'adnc Normalisation 6 UTILITE Permet de conserver une séquence d'adn donnée. Permet de la multiplier pour en accroître la quantité. Permet de la modifier pour y introduire des mutations, déletions. Permet de la réintroduire dans des cellules. Principes Un Vecteur Une Cellule hôte Un fragment d'adn d'intérêt. Circulaire Linéaire Procaryote Eucaryote ADN génomique ADNc 7 8 2

3 pg-ng d'adn Différents vecteurs pour différentes utilisations VECTEURS HOTE INSERT (Kb) Plasmide Bactérie 20 Phage Lambda Bactérie 25 BAC Bactérie 300 YAC Levure 1000 BAC µg-mg d'adn 9 10 plasmide Les plasmides sont des molécules d'adn circulaires naturellement présentes dans les bactéries en plus des chromosomes bactérien. Ils ne contiennent généralement pas de gènes indispensables à la survie de la cellule. Ils apportent des gènes pouvant présenter un avantages dans des conditions de cultures particulières (antibiotique, métaux lourd, hyper salinité,...) où ils vont apporter un avantage pour la croissance de la cellule les possédant. 11 Plasmide Type Origine de replication (E.Coli) Gene de résistance a un Antibiotique Site de clonage Gène de sélection négative Origine de réplication (Phage) 12 3

4 Bacteriophage Lambda (λ) MCS Sites pour enzymes de restriction uniques. Site pour primer de séquencage. Promoteurs pour RNA polymerase phagiques (Phages T7,T3). Bacteriophage M13 Bacterial Artificial Chromosomes BAC para,parb and repe sont des genes requis pour la stabilité du BAC. OriS est une origine de réplication CM : gène de résistance au chloramphenicol 7.4kb

5 BACs YAC Avantages : Grande capacité d'insertion Facilité de manipulation (comme plasmide) Hôte bactérien Copie unique Pas (peu) de réarrangement VECTEURS ET BANQUES VECTEURS et CLONAGE Utilité Principe Différents vecteurs / différents usage BANQUES Définition Banques génomiques Banques d'adnc Normalisation Définition Une banque d'adn est une POPULATION de vecteurs contenant des fragment d'adn divers représentatif d'un type cellulaire, d'un génome, d'un stade particulier de développement. Une Banque est caractérisée par : - le type de vecteur - la nature des inserts (ADN genomique, ADNc), leur origine - le pourcentage de vecteurs possédant un insert - la taille moyenne des inserts - la taille de la banque c.a.d la quantité de clones / ml de banque

6 Construction d'une banque d'adn genomique dans un BAC Construction d'une banque d'adn genomique dans un BAC ADN Génomique fragmenté ADN Génomique fragmenté Banque non ordonnée vs banque ordonnées Exemple une banque d'adn génomique humain Chaque colonie est repiquée individuellement Segment 1 Vector Restriction Enzyme ptarbac1.3 MboI DNA Source blood Plate Numbers 1 to 384 Plate Count 384 Empty Wells Non-Recombinant Clones 1917 (1.3%) 70 (0.05%) Non-Insert Clones Approx (2.1%) Recombinant Clones Average Insert Size 156 Kbp Genomic Coverage 6.7X 1, X = 2, bp HG = 3, bp Couverture = 6.7 X dans un puit de la plaque de 384 puits

7 Banque ADNc Banque ADNc Synthese ADNc Clonage bout franc Clonage / linker Clonage directionel Les ESTs Criblage différentiel Polishing of cdna ends Clonage bout franc Clonage avec linker

8 Clonage avec linker Que faire pour éviter de digérer les ADNc? 4 6 = Clonage directionnel Reverse transcriptase,methyl-dctp datp,dgtp,dttp MCS Rnase H, DNA pol I, dntps EcoRI adaptateurs Digestion XhoI EcoRI Xho I ADNc permettant clonage directionnel

9 Les EST Une banque permet d'avoir une image des ADNc présents dans le tissu étudié. Pour cela, le séquencage partiel de l'ensemble des clones de la banques permet d'obtenir des EST ou Expressed Sequence Tag. c.a.d des étiquettes des séquences exprimées. Celle-ci permettent Les EST 1) l'identification des ARNm exprimés. 2) l'attribution d'une identiité à chaque clone. 2) Une estimation du niveau d'expression par comptage des EST correspondant à un ARNm donné Une banque d'adnc va donc normalement représenter sous forme de clones l'ensemble des ARNm présent dans le tissus initial. La représentation de chaque clone représentant en proportion la quantité d'arnm dans la cellule. Ceci pose le problème des ARNm rares qui peuvent n'être représentés que par 1 clone ou même aucun tandis que des ARNm très abondant peuvent représenter une proportion importante des clones de la banque

10 Criblage differentiel Pour déterminer quels sont les gènes différentiellement exprimés entre 2 tissus. Par exemple, tissus sains versus tissu cancéreux Criblage differentiel Maspin, a Serpin with Tumor-Suppressing Activity in Human Mammary Epithelial Cells (Science, 1994) LA NORMALISATION DES BANQUES BUT : Faire que chaque ARNm de la cellule quelque soit son nombre de copie dans le tissus étudiés soient représentés en nombre de clones identique dans la banque. Banque ADN simple brin Banque partiellement double brin Sélection vecteur avec double brin Les clones dont la concentration est importante reforment du double brin ceux dont la concentration est faible, non. Sélection vecteur simple brin = Banque Normalisé

11 Pour Quoi Faire? Pour les organiser et automatiser la gestion Pour Quoi Faire? Analyses fonctionnelles : - Vecteurs d'expression : étude du rôle de la protéine X sur tel ou tel mécanisme cellulaire. Pour les analyses fonctionnelles (postgénomique) Neomycin pcmv Criblage fonctionnel : ou QUI FAIT QUOI?

12 Lecture? Visiter le site du NCBI Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) 45 12

13 Yann audic _2006 VECTEURS ET BANQUES

14 VECTEURS ET BANQUES DEFINITIONS VECTEURS et CLONAGE Utilité Principe Différents vecteurs / différents usage BANQUES Principe Banques génomiques Banques d'adnc Normalisation

15 Définitions Un vecteur est une séquence d'adn permettant la propagation, la sélection, la modification d'une séquence d'adn d'intérêt. En bref l'étude et la manipulation d'une séquence d'adn isolée. Le clonage est l'action d'isoler et d'insérer dans un vecteur un fragment d'adn d'intérêt pour le multiplier à l'identique. L'ADN génomique est le support physique de l'ensemble des gènes de la cellule l'adn complémentaire (ADNc) est la copie en ADN des ARNm.

16 AAAAAAA...AAA Transcription Epissage AAAAAAA...AAA ARNm pre-arnm ADN génomique ARNm Transcriptase inverse ADNc IN VITRO

17 AAAAAAAAAAAAA OLIGOdT AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTT Reverse Transcriptase Oligonucleotide aleatoire : un mélange d'oligonucleotides de 6 nucleotides de toutes les séquences possibles : 4 6 = 4096 NNNNNN Reverse Transcriptase

18 VECTEURS ET BANQUES VECTEURS et CLONAGE Utilité Principe Différents vecteurs / différents usage BANQUES Principe Banques génomiques Banques d'adnc Normalisation

19 UTILITE Permet de conserver une séquence d'adn donnée. Permet de la multiplier pour en accroître la quantité. Permet de la modifier pour y introduire des mutations, déletions. Permet de la réintroduire dans des cellules.

20 Principes Un Vecteur Une Cellule hôte Un fragment d'adn d'intérêt. Circulaire Linéaire Procaryote Eucaryote ADN génomique ADNc

21 pg-ng d'adn µg-mg d'adn

22 Différents vecteurs pour différentes utilisations VECTEURS HOTE INSERT (Kb) Plasmide Bactérie 20 Phage Lambda Bactérie 25 BAC Bactérie 300 YAC Levure 1000 BAC

23 plasmide Les plasmides sont des molécules d'adn circulaires naturellement présentes dans les bactéries en plus des chromosomes bactérien. Ils ne contiennent généralement pas de gènes indispensables à la survie de la cellule. Ils apportent des gènes pouvant présenter un avantages dans des conditions de cultures particulières (antibiotique, métaux lourd, hyper salinité,...) où ils vont apporter un avantage pour la croissance de la cellule les possédant.

24 Plasmide Type Origine de replication (E.Coli) Gene de résistance a un Antibiotique Site de clonage Gène de sélection négative Origine de réplication (Phage)

25 MCS Sites pour enzymes de restriction uniques. Site pour primer de séquencage. Promoteurs pour RNA polymerase phagiques (Phages T7,T3).

26 Bacteriophage Lambda (λ)

27 Bacteriophage M13

28 Bacterial Artificial Chromosomes BAC para,parb and repe sont des genes requis pour la stabilité du BAC. OriS est une origine de réplication CM : gène de résistance au chloramphenicol 7.4kb

29 BACs Avantages : Grande capacité d'insertion Facilité de manipulation (comme plasmide) Hôte bactérien Copie unique Pas (peu) de réarrangement

30 YAC

31 VECTEURS ET BANQUES VECTEURS et CLONAGE Utilité Principe Différents vecteurs / différents usage BANQUES Définition Banques génomiques Banques d'adnc Normalisation

32 Définition Une banque d'adn est une POPULATION de vecteurs contenant des fragment d'adn divers représentatif d'un type cellulaire, d'un génome, d'un stade particulier de développement. Une Banque est caractérisée par : - le type de vecteur - la nature des inserts (ADN genomique, ADNc), leur origine - le pourcentage de vecteurs possédant un insert - la taille moyenne des inserts - la taille de la banque c.a.d la quantité de clones / ml de banque

33 Construction d'une banque d'adn genomique dans un BAC ADN Génomique fragmenté

34 Construction d'une banque d'adn genomique dans un BAC ADN Génomique fragmenté

35 Banque non ordonnée vs banque ordonnées Chaque colonie est repiquée individuellement dans un puit de la plaque de 384 puits.

36 Exemple une banque d'adn génomique humain Segment 1 Vector Restriction Enzyme ptarbac1.3 MboI DNA Source blood Plate Numbers 1 to 384 Plate Count 384 Empty Wells Non-Recombinant Clones 1917 (1.3%) 70 (0.05%) Non-Insert Clones Approx (2.1%) Recombinant Clones Average Insert Size 156 Kbp Genomic Coverage 6.7X 1, X = 2, bp HG = 3, bp Couverture = 6.7 X

37 Banque ADNc Synthese ADNc Clonage bout franc Clonage / linker Clonage directionel Les ESTs Criblage différentiel

38 Banque ADNc Polishing of cdna ends

39 Clonage bout franc

40 Clonage avec linker

41 Clonage avec linker 4 6 = 4096

42 Que faire pour éviter de digérer les ADNc?

43 Clonage directionnel Reverse transcriptase,methyl-dctp datp,dgtp,dttp Rnase H, DNA pol I, dntps EcoRI adaptateurs Digestion XhoI ADNc permettant clonage directionnel

44 MCS EcoRI Xho I

45 Les EST Une banque permet d'avoir une image des ADNc présents dans le tissu étudié. Pour cela, le séquencage partiel de l'ensemble des clones de la banques permet d'obtenir des EST ou Expressed Sequence Tag. c.a.d des étiquettes des séquences exprimées.

46 Les EST Celle-ci permettent 1) l'identification des ARNm exprimés. 2) l'attribution d'une identiité à chaque clone. 2) Une estimation du niveau d'expression par comptage des EST correspondant à un ARNm donné.

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48 Une banque d'adnc va donc normalement représenter sous forme de clones l'ensemble des ARNm présent dans le tissus initial. La représentation de chaque clone représentant en proportion la quantité d'arnm dans la cellule. Ceci pose le problème des ARNm rares qui peuvent n'être représentés que par 1 clone ou même aucun tandis que des ARNm très abondant peuvent représenter une proportion importante des clones de la banque.

49 Criblage differentiel Pour déterminer quels sont les gènes différentiellement exprimés entre 2 tissus. Par exemple, tissus sains versus tissu cancéreux

50 Criblage differentiel Maspin, a Serpin with Tumor-Suppressing Activity in Human Mammary Epithelial Cells (Science, 1994)

51 LA NORMALISATION DES BANQUES BUT : Faire que chaque ARNm de la cellule quelque soit son nombre de copie dans le tissus étudiés soient représentés en nombre de clones identique dans la banque.

52 Banque ADN simple brin Banque partiellement double brin Sélection vecteur avec double brin Les clones dont la concentration est importante reforment du double brin ceux dont la concentration est faible, non. Sélection vecteur simple brin = Banque Normalisé.

53 Pour Quoi Faire? Pour les organiser et automatiser la gestion Pour les analyses fonctionnelles (postgénomique)

54 Pour Quoi Faire? Analyses fonctionnelles : - Vecteurs d'expression : étude du rôle de la protéine X sur tel ou tel mécanisme cellulaire. Neomycin pcmv

55 Criblage fonctionnel : ou QUI FAIT QUOI?

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57 Lecture? Visiter le site du NCBI Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition)