TUTORIAL VIDEO-MICROSCOPE 1

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1 TUTORIAL VIDEO-MICROSCOPE 1 TUTORIAL VIDEO-MICROSCOPE Préparation du système (respecter l ordre d installation)... 2 Installation blocs filtres de fluorescence (Possibilité d installer 4 blocs filtres maximum)... 2 Installation d un objectif... 3 Initialisation de la platine XY... 3 Installation et mise en route de la chambre d incubation... 4 Arrivée CO Allumage du système... 6 Acquisitions Acquisition mono-couleur mono-plan sans timelapse Acquisition mono-couleur mono-plan avec timelapse Acquisition mono-couleur multi-plans sans timelapse Acquisition mono-couleur multi-plans avec timelapse Acquisition multi-couleurs mono-plan sans timelapse Acquisition multi-couleurs mono-plan avec timelapse Acquisition multi-couleurs multi-plans sans timelapse Acquisition multi-couleurs multi-plans avec timelapse Balayage d une série de champs (multiposition XY) Visualisation des acquisitions multiparamétriques Extinction du système

2 Préparation du système (respecter l ordre d installation) Installation blocs filtres de fluorescence (Possibilité d installer 4 blocs filtres maximum) 1. Eteindre le shutter de fluorescence, en le débranchant 2. Sortir complètement le tiroir des blocs filtres, mettre en place ou retirer les blocs filtres nécessaires en les tirant ou en appuyant dessus. Pour savoir où insérer votre filtre choisissez, dans la boite «illumination» de l onglet «wavelenght» de Metamorph, le fluorophore correspondant au filtre à insérer. La roue de filtre va tourner et la position à utiliser va se caler au dessus d un trou dans la roue. 3. Remettre le tiroir de filtre RMQ : Il existe sur le tiroir de filtres de très fragiles petits capteurs. Il faut impérativement ménager ces capteurs en évitant soigneusement de les cogner contre le statif lors de la remise en place. Un choc dérèglerait le passage des filtres et entraînerait une immobilisation du système de plusieurs jours. Les traces de doigt sur les filtres n aident pas à l obtention d images de bonne qualité. 2

3 Installation d un objectif Soyer attentif au type d objectif utilisé (type d immersion, présence d un anneau de phase, de bague correctrice...). En cas de doute adressez-vous à l un des ingénieurs de la plate-forme. Initialisation de la platine XY 1. Baisser la tourelle d objectifs à fond. 2. Basculer la potence transmission en arrière. L oubli de la tourelle, ou de la potence lors de l initialisation de la platine a des conséquences dramatiques pour l objectif en place! 3. Au démarrage de Metamorph cliquer sur "oui" lors de la demande d initialisation de la platine 3

4 Installation et mise en route de la chambre d incubation 1. Installer le support chauffant noir sur la platine du microscope. Si nécessaire brancher le câble à l arrière du boîtier 37-2 et le visser. 2. Installer le support de lamelle ou de boite de Petri contenant l échantillon dans le support chauffant. ( ationechantillon) 3. Installer le couvercle de la chambre d incubation sur le boîtier chauffant, visser la vis rouge devant, brancher les tuyaux d air. RMQ : pour faire des mesures en transmission, remplacer le couvercle plastique par une plaque en verre 4. Allumer le boîtier de température (tempcontrol 37-2) et de régulation du CO 2 (CTI controler) (boutons verts). La température affichée est la température réelle. 5. Pour modifier les valeurs de consignes de température appuyez sur les boutons "1" (ou "2" : 1 indique les valeurs de température pour le support et 2 indique les valeurs de la température de l air (dans la chambre). Appuyer une première fois sur "1" (ou "2"): montre si le chauffage est ON ou OFF. Pour passer de l un a l autre appuyez sur +. Appuyer une deuxième fois : montre la température de consigne (température désirée). Utilisez les boutons + et - pour régler cette température de consigne. Appuyez une troisième fois : montre la température réelle. 4

5 Arrivée CO 2 1. Ouvrir la bouteille de CO 2 jusqu à avoir 1 bar affiché sur le manomètre de droite. 2. Réglage pression de consigne CO 2 : Boîtier CTI (régulation CO 2 ): une pression sur display bascule l affichage soit sur la pression de CO 2 de consigne (nom), soit sur la pression réelle (real). Avec «CO2 set point up/down» régler la consigne de pression de CO 2 à 5%. Une pression sur «valve» met en route l ouverture automatique de la valve d arrivée CO 2. Le voyant rouge devient vert quand la valve s ouvre (avec un bruit sec caractéristique). Si la pression réelle ne monte pas, vérifier que la vanne est ON, que les tuyaux sont bien branchés et que la pression en sortie de bouteille est d environ 1 bar. Vérifier la pression CO 2 quelques minutes après le début de la perfusion. 5

6 Allumage du système 1. Allumer la lampe de fluorescence "LEICA EL6000" 0 12, % Transmission 2. Si besoin allumer le système d illumination rapide DG4 2 1 Il est impératif de commencer par l interrupteur de la lampe puis l interrupteur "main" situés à l arrière du boîtier (et inversement pour l extinction)! 3. Allumez la prise multiple marquée "vidéo" sur laquelle est branchée la platine motorisée, le boîtier de commande du bloc filtre, le microscope, le piezzo, la caméra. 4. Si besoin mettez en place la thermostatisation et la régulation de CO2 (Cf mise en place) 5. Allumer le PC 6. «Loggez» vous en utilisant la session de votre groupe. S il n en existe pas, adressez vous à l équipe de la Plate-forme 7. Lancez Metamorph. Metamorph vous propose d initialiser la platine. Ceci n est nécessaire que si vous faites des acquisitions sur plusieurs champs. Dans ce cas vérifiez que l objectif est bien baissé, que la potence du 6

7 microscope est relevée et que la chambre d incubation n est pas en place! 8. Vérifier que la barre de journaux est apparente, si elle ne l est pas, aller sur : "Journal/Show Taskbar" ou "F4" 9. Lancer la boite " Apps/Multidimensionnal Acquisition" : 10. Afficher la boite "Display/Scale Image" 7

8 11. Afficher la boite "Devices/Focus" 12. Dans la fenêtre "Current Position" de la boîte "Focus" vérifiez que la valeur affichée est 0, sinon, la modifier. 13. Passez sur l onglet Focus de la boite focus (si ce n est pas celui-ci qui est actif) et choisissez l incrément de votre choix (1 µm par exemple) 8

9 Mise en place de l échantillon, positionnement de l optovar 1. Vérifier que l objectif en place est celui dont vous avez besoin (Cf. installation d un objectif). 2. Si vous utilisez un objectif 100X ou 63X tournez l optovar (côté droit du microscope) en position 1X. Si vous utilisez un objectif 40X ou 20X, tournez l optovar en position 1,5X. 3. Mettre en place l échantillon en utilisant le support approprié (sans oublier le milieu d immersion si nécessaire entre l échantillon et l objectif!!) Passage du système en mode oculaire-transmission 1. Vérifiez que la tirette située sur le côté droit du microscope est en position enfoncée, au besoin la pousser (délicatement!!) jusqu à la butée. 9

10 2. Mettez la roue de filtres sur une position vide grâce au boîtier de commande. 3. Ouvrir le shutter de transmission. 4. Allumez la transmission (mollette à gauche du microscope Passage du système en mode oculaires-fluorescence 1. Tournez la roue de filtres jusqu à la position voulue grâce au boîtier de commande. 2. Ouvrir le shutter de fluorescence grâce au boîtier de commande (lorsqu il est fermé le voyant rouge est allumé). 10

11 Pensez à fermer le shutter de fluorescence quand vous n observez pas votre échantillon afin de le préserver du photoblanchiment. Remarque importante : Régler la lampe fluo au minimum afin de diminuer le photoblanchiment. En mode DG4 pensez à ajouter des densités optiques sur le trajet de la fluorescence et ouvrir la tirette située à l arrière gauche du statif. N hésitez pas à demander conseil aux ingénieurs de la plate-forme. Passage du système en mode acquisition 1. Vérifiez que le shutter de fluorescence est fermé (voyant rouge allumé). 2. Basculez (doucement!!) la tirette située sur le côté droit du microscope en position tirée 11

12 Acquisitions Acquisition mono-couleur mono-plan sans timelapse 1. Ouvrir la boite "Apps/ Multi Dimensional Acquisition". 2. Dans l onglet "Main" décochez tout. 3. Sélectionnez le nom de vos données et leur emplacement pour l enregistrement : users / «année» / «mois en cours» / «jour de la manip» / «dossier à votre nom». 4. Dans la Taskbar choisissez le mode lent (le mode lent permet une meilleure dynamique que le mode rapide). 5. Atténuer le signal de fluorescence directement sur l EL6000 ou insérer des filtres de densité optique (DO) en illumination DG4 sur le trajet optique de la fluorescence. Vous pouvez également insérer des filtres en lumière transmise. Il en existe 6 DO % T Commencer par une forte atténuation pour éviter de photoblanchir votre échantillon. Si le signal est trop faible, essayer d augmenter le temps d exposition avant de changer le filtre d atténuation. Plus vous éclairez un échantillon, plus vous le détruisez. 6. Selon l objectif utilisé définissez le binning et l optovar approprié Objectif 100X : binning de 2, optovar de 1X Objectif 63X : binning de 1, optovar de 1X Objectif 40X : binning de 1, optovar de 1.5X Objectif 20X : binning de 1, optovar de 1.5X 12

13 7. Dans l onglet "Wavelength" choisir le fluorophore à imager et le temps d exposition (entre 20 et 500ms). 8. Cliquer sur "Snap" pour faire une image de ce fluorophore. 9. Ouvrir le menu "Display/ Scale Image". Ce menu donne la dynamique de l image. Le maximum de l image ne doit jamais atteindre Plus la dynamique de l image (différence entre intensité maximum et intensité minimum) (dans cet exemple : =671 niveaux) meilleur est l image. Une dynamique de 300 niveaux est suffisante en cellule vivante. Une dynamique de 100 niveaux est suffisante en cellule fixée. Remarques : Si la dynamique de l image est trop faible, augmenter le temps d acquisition. Plus on éclaire un échantillon, plus on le détruit. Pour choisir le bon compromis, n hésitez pas à demander conseil à un ingénieur de la plate-forme. Il est possible d acquérir qu une partie du champ en définissant une région d intérêt Choisir une forme Dans le menu "Apps/ Multi Dimensional Acquisition" cliquer sur "Active Region". Cliquer sur "Live" ou "Snap" pour avoir l image votre zone d intérêt. Pour revenir région entière cliquez sur "full chip". 16. Cliquer sur "Snap". 17. Cliquez sur "Save Image" pour sauvegarder vos données en format.tif. 13

14 Acquisition mono-couleur mono-plan avec timelapse 1. Ouvrir la boite "Apps/ Multi Dimensional Acquisition". 2. Dans l onglet "Main" cochez "Time Lapse". RMQ : le mode "Stream" permet de faire des acquisitions plus rapides mais plus bruitées (cf "Mode Rapide"). 3. Sélectionnez le nom de vos données et leur emplacement pour l enregistrement : users / «année» / «mois en cours» / «jour de la manip» / «dossier à votre nom». 4. Dans la Taskbar choisissez le mode lent ou rapide (uniquement pour le mode Stream). 5. Atténuer le signal de fluorescence directement sur l EL6000 ou insérer des filtres de densité optique (DO) en illumination DG4 sur le trajet optique de la fluorescence. Vous pouvez également insérer des filtres en lumière transmise. Il en existe 6 DO % T Commencer par une forte atténuation pour éviter de photoblanchir votre échantillon. Si le signal est trop faible, essayer d augmenter le temps d exposition avant de changer le filtre d atténuation. Plus vous éclairez un échantillon, plus vous le détruisez. 6. Selon l objectif utilisé définissez le binning et l optovar approprié Objectif 100X : binning de 2, optovar de 1X Objectif 63X : binning de 1, optovar de 1X Objectif 40X : binning de 1, optovar de 1.5X Objectif 20X : binning de 1, optovar de 1.5X 14

15 7. Vérifier la configuration du piezzo et au besoin la rétablir. Ouvrir la boite "Display/Focus ". Aller dans l onglet "Configure ". Dans la boite "Current Position " taper 50 (pour le piezzo 100) ou 175 (pour le piezzo 350) et valider en cliquant sur «Set To Top». Taper ensuite 0 et "Set Home" puis -50 (ou -175) et " Set Bottom". Refaire la mise au point au microscope. 8. Dans l onglet "Wavelength" choisir le fluorophore à imager et le temps d exposition (entre 20 et 500ms). 9. Cliquer sur "Snap" pour faire une image de ce fluorophore. 10. Ouvrir le menu "Display/ Scale Image". Ce menu donne la dynamique de l image. Le maximum de l image ne doit jamais atteindre Plus la dynamique de l image (différence entre intensité maximum et intensité minimum) (dans cet exemple : =671 niveaux) meilleur est l image. Une dynamique de 300 niveaux est suffisante en cellule vivante. Une dynamique de 100 niveaux est suffisante en cellule fixée. 15

16 Remarques : Si la dynamique de l image est trop faible, augmenter le temps d acquisition. Plus on éclaire un échantillon, plus on le détruit. Pour choisir le bon compromis, n hésitez pas à demander conseil à un ingénieur de la plateforme. Il est possible d acquérir qu une partie du champ en définissant une région d intérêt Choisir une forme Dans le menu "Apps/ Multi Dimensional Acquisition" cliquer sur "Active Region". Cliquer sur "Live" ou "Snap" pour avoir l image votre zone d intérêt. Pour revenir en région entière cliquez sur "full chip". 11. Dans l onglet "Timelapse" choisissez l intervalle entre 2 points de temps (Time Interval), le nombre de points de temps (nombre d images) ou la durée totale de l acquisition (duration). 18. La sauvegarde est automatique dans le mode "Timelapse" vérifiez que vous avez bien choisi l emplacement de vos données. 19. Cliquer sur "Acquire" Le stack est en format stk. 16

17 Mode Rapide Vous pouvez augmenter la cadence des acquisitions en choisissant le mode "Stream" au détriment de la dynamique. 1. Dans l onglet "Main" cochez "Stream" en plus des autres paramètres. 2. Cochez "Stream" en haut de l onglet "Wavelength". 3. Dans l onglet "Stream" cochez "Stream Time" et déterminez le temps d exposition dans "Stream Exposure Time". 17

18 Acquisition mono-couleur multi-plans sans timelapse 1. Ouvrir la boite "Apps/ Multi Dimensional Acquisition". 2. Dans l onglet "Main" cochez "Do Z series". RMQ : le mode "Stream" permet de faire des acquisitions plus rapides mais plus bruitées (cf "Mode Rapide"). 3. Sélectionnez le nom de vos données et leur emplacement pour l enregistrement : users / «année» / «mois en cours» / «jour de la manip» / «dossier à votre nom». 4. Dans la Taskbar choisissez le mode lent ou rapide (uniquement pour le mode Stream). 5. Atténuer le signal de fluorescence directement sur l EL6000 ou insérer des filtres de densité optique (DO) en illumination DG4 sur le trajet optique de la fluorescence. Vous pouvez également insérer des filtres en lumière transmise. Il en existe 6 DO % T Commencer par une forte atténuation pour éviter de photoblanchir votre échantillon. Si le signal est trop faible, essayer d augmenter le temps d exposition avant de changer le filtre d atténuation. Plus vous éclairez un échantillon, plus vous le détruisez. 6. Selon l objectif utilisé définissez le binning et l optovar approprié Objectif 100X : binning de 2, optovar de 1X Objectif 63X : binning de 1, optovar de 1X Objectif 40X : binning de 1, optovar de 1.5X Objectif 20X : binning de 1, optovar de 1.5X 18

19 7. Vérifier la configuration du piezzo et au besoin la rétablir. Ouvrir la boite "Display/Focus ". Aller dans l onglet "Configure ". Dans la boite "Current Position " taper 50 (pour le piezzo 100) ou 175 (pour le piezzo 350) et valider en cliquant sur «Set To Top». Taper ensuite 0 et "Set Home" puis -50 (ou -175) et " Set Bottom". Refaire la mise au point au microscope. 8. Dans l onglet "Wavelength" choisir le fluorophore à imager et le temps d exposition (entre 20 et 500ms). 9. Cochez "Do Z serie" en bas de la fenêtre. 10. Cliquer sur "Snap" pour faire une image de ce fluorophore. 11. Ouvrir le menu "Display/ Scale Image". Ce menu donne la dynamique de l image. Le maximum de l image ne doit jamais atteindre Plus la dynamique de l image (différence entre intensité maximum et intensité minimum) (dans cet exemple : =671 niveaux) meilleur est l image. Une dynamique de 300 niveaux est suffisante en cellule vivante. Une dynamique de 100 niveaux est suffisante en cellule fixée. 19

20 Remarques : Si la dynamique de l image est trop faible, augmenter le temps d acquisition. Plus on éclaire un échantillon, plus on le détruit. Pour choisir le bon compromis, n hésitez pas à demander conseil à un ingénieur de la plate-forme. Il est possible d acquérir qu une partie du champ en définissant une région d intérêt Choisir une forme Dans le menu "Apps/ Multi Dimensional Acquisition" cliquer sur "Active Region". Cliquer sur "Live" ou "Snap" pour avoir l image votre zone d intérêt. Pour revenir région entière cliquez sur "full chip". 12. Ouvrir l onglet "Z series". 20

21 2 possibilités s offrent à vous pour imager un stack : choisir le haut et la bas de la zone à imager ou centrer le stack sur un plan et définir le nombre de plans. Choisir le haut et le bas de la zone à imager 13. Choisir "Acquire Wavelength Set at Each Z" ou "Acquire Z Series for One Wavelength at a Time". La deuxième solution ne nécessitant pas de changement de filtres entre chaque image, l acquisition sera plus rapide. 14. Se mettre en mode live pour repérer la structure à imager. 15. Vérifiez que "Current Position" est à 0 (sinon cf 7.) 16. Choisir le haut de votre stack en vous déplaçant grâce aux flèches de la case "Current Position". 17. Dés que vous avez repéré une position validez là en cliquant sur "Set Top To Current". 18. Procéder de façon identique pour définir la limite inférieure de la région d acquisition (cliquez sur "Set Bottom to Current"). 19. Choisir le "Step Size". Il dépend de l objectif utilisé. Il est important de bien choisir cette distance entre deux coupes en vue de faire des reconstructions 3D ou de déconvoluer vos images Si vous travaillez au 100x ou au 63x à huile (NA : 1.4) vous devez échantillonner à 0.2 µm Si vous travaillez au 63 à eau vous devez échantillonner à 0,350 µm Si vous travaillez au 63 sec vous devez échantillonner à 1,3 µm Si vous utilisez un 40 à huile vous devez échantillonner à 0,3 µm Si vous utilisez un 20 multi immersion, vous devez échantillonner à 1,3 µm. 20. Cliquer sur "Acquire" 21. Cliquez sur "Save Image" pour sauvegarder vos données. 21

22 Centrer le stack sur un plan 13. Choisir "Acquire Wavelength Set at Each Z" ou "Acquire Z Series for One Wavelength at a Time". La deuxième solution ne nécessitant pas de changement de filtres entre chaque image, l acquisition sera plus rapide. 14. Se mettre en mode live pour repérer la structure à imager. 15. Vérifiez que "Current Position" est à 0 (sinon cf 7.) 16. Cochez "Range Around Current". Le stack sera centré sur le plan actuel (ou sur le plan renvoyé par l autofocus ou sur celui déterminé à chaque position lors d une acquisition multi-champs) 17. Choisissez le "Step Size" et le nombre de coupes ("Number of Step") ou l épaisseur d échantillon ("Range") que vous souhaitez acquérir. Il est très important de bien choisir le "step size" en vue de faire des reconstructions 3D ou de déconvoluer vos images. Il dépend de l objectif que vous utilisez. Les valeurs optimales sont les suivantes : Si vous travaillez au 100x ou au 63x à huile (NA : 1.4) vous devez échantillonner à 0.2 µm Si vous travaillez au 63 à eau vous devez échantillonner à 0,350 µm Si vous travaillez au 63 sec vous devez échantillonner à 1,3 µm Si vous utilisez un 40 à huile vous devez échantillonner à 0,3 µm Si vous utilisez un 20 multi immersion, vous devez échantillonner à 1,3 µm. 22

23 18. Cliquer sur "Acquire". 19. Cliquez sur "Save Image" pour sauvegarder vos données. Mode Rapide Vous pouvez augmenter la cadence des acquisitions en choisissant le mode "Stream" ce qui augmente le bruit progressivement. 1. Dans l onglet "Main" cochez "Stream" en plus des autres paramètres. 2. Cochez "Stream" en haut de l onglet "Wavelength". 3. Dans l onglet "Stream" cochez "Stream Z". Déterminez le temps d exposition dans "Stream Exposure Time" 23

24 Acquisition mono-couleur multi-plans avec timelapse 1. Ouvrir la boite "Apps/ Multi Dimensional Acquisition". 2. Dans l onglet "Main" cochez "Time Lapse", "Do Z series". RMQ : le mode "Stream" permet de faire des acquisitions plus rapides mais plus bruitées (cf "Mode Rapide"). 3. Sélectionnez le nom de vos données et leur emplacement pour l enregistrement : users / «année» / «mois en cours» / «jour de la manip» / «dossier à votre nom». 4. Dans la Taskbar choisissez le mode lent ou rapide pour le mode Stream. 5. Atténuer le signal de fluorescence directement sur l EL6000 ou insérer des filtres de densité optique (DO) en illumination DG4 sur le trajet optique de la fluorescence. Vous pouvez également insérer des filtres en lumière transmise. Il en existe 6 DO % T Commencer par une forte atténuation pour éviter de photoblanchir votre échantillon. Si le signal est trop faible, essayer d augmenter le temps d exposition avant de changer le filtre d atténuation. Plus vous éclairez un échantillon, plus vous le détruisez. 6. Selon l objectif utilisé définissez le binning et l optovar approprié Objectif 100X : binning de 2, optovar de 1X Objectif 63X : binning de 1, optovar de 1X Objectif 40X : binning de 1, optovar de 1.5X Objectif 20X : binning de 1, optovar de 1.5X 24

25 7. Vérifier la configuration du piezzo et au besoin la rétablir. Ouvrir la boite "Display/Focus ". Aller dans l onglet "Configure ". Dans la boite "Current Position " taper 50 (pour le piezzo 100) ou 175 (pour le piezzo 350) et valider en cliquant sur «Set To Top». Taper ensuite 0 et "Set Home" puis -50 (ou -175) et " Set Bottom". 8. Dans l onglet "Wavelength" choisir le fluorophore à imager et le temps d exposition (entre 20 et 500ms). 9. Cochez "Do Z serie" 10. Cliquer sur "Snap" pour faire une image de ce fluorophore. 11. Ouvrir le menu "Display/ Scale Image". Ce menu donne la dynamique de l image. Le maximum de l image ne doit jamais atteindre Plus la dynamique de l image (différence entre intensité maximum et intensité minimum) (dans cet exemple : =671 niveaux) meilleur est l image. Une dynamique de 300 niveaux est suffisante en cellule vivante. Une dynamique de 100 niveaux est suffisante en cellule fixée. Remarques : Si la dynamique de l image est trop faible, augmenter le temps d acquisition. 25

26 Plus on éclaire un échantillon, plus on le détruit. Pour choisir le bon compromis, n hésitez pas à demander conseil à un ingénieur de la plateforme. Il est possible d acquérir qu une partie du champ en définissant une région d intérêt Choisir une forme Dans le menu "Apps/ Multi Dimensional Acquisition" cliquer sur "Active Region". Cliquer sur "Live" ou "Snap" pour avoir l image votre zone d intérêt. Pour revenir région entière cliquez sur "full chip". 12. Dans l onglet "Timelapse" choisissez l intervalle entre 2 points de temps (Time Interval), le nombre de points de temps (nombre d images) ou la durée totale de l acquisition (duration). 13. Ouvrir l onglet "Z series". 26

27 2 possibilités s offrent à vous pour imager un stack : choisir le haut et la bas de la zone à imager ou centrer le stack sur un plan et définir le nombre de plans. Choisir le haut et le bas de la zone à imager 14. Choisir "Acquire Wavelength Set at Each Z" ou "Acquire Z Series for One Wavelength at a Time". La deuxième solution ne nécessitant pas de changement de filtres entre chaque image, l acquisition sera plus rapide. 15. Se mettre en mode live pour repérer la structure à imager. 16. Vérifiez que "Current Position" est à 0 (sinon cf 7.) 17. Choisir le haut de votre stack en vous déplaçant grâce aux flèches de la case "Current Position". 18. Dés que vous avez repéré une position validez là en cliquant sur "Set Top To Current". 19. Procéder de façon identique pour définir la limite inférieure de la région d acquisition (cliquez sur "Set Bottom to Current"). 20. Choisir le "Step Size". Il dépend de l objectif utilisé. Il est important de bien choisir cette distance entre deux coupes en vue de faire des reconstructions 3D ou de déconvoluer vos images Si vous travaillez au 100x ou au 63x à huile (NA : 1.4) vous devez échantillonner à 0.2 µm Si vous travaillez au 63 à eau vous devez échantillonner à 0,350 µm Si vous travaillez au 63 sec vous devez échantillonner à 1,3 µm Si vous utilisez un 40 à huile vous devez échantillonner à 0,3 µm Si vous utilisez un 20 multi immersion, vous devez échantillonner à 1,3 µm. 21. La sauvegarde est automatique dans le mode "Timelapse" vérifiez que vous avez bien choisi l emplacement de vos données. 22. Cliquer sur "Acquire" Le stack est en format stk. 27

28 Centrer le stack sur un plan 14. Choisir "Acquire Wavelength Set at Each Z" ou "Acquire Z Series for One Wavelength at a Time". La deuxième solution ne nécessitant pas de changement de filtres entre chaque image, l acquisition sera plus rapide. 15. Se mettre en mode live pour repérer la structure à imager. 16. Vérifiez que "Current Position" est à 0 (sinon cf 7.) 17. Cochez "Range Around Current". Le stack sera centré sur le plan actuel (ou sur le plan renvoyé par l autofocus ou sur celui déterminé à chaque position lors d une acquisition multi-champs) 18. Choisissez le "Step Size" et le nombre de coupes ("Number of Step") ou l épaisseur d échantillon ("Range") que vous souhaitez acquérir. Il est très important de bien choisir le "step size" en vue de faire des reconstructions 3D ou de déconvoluer vos images. Il dépend de l objectif que vous utilisez. Les valeurs optimales sont les suivantes : Si vous travaillez au 100x ou au 63x à huile (NA : 1.4) vous devez échantillonner à 0.2 µm Si vous travaillez au 63 à eau vous devez échantillonner à 0,350 µm Si vous travaillez au 63 sec vous devez échantillonner à 1,3 µm Si vous utilisez un 40 à huile vous devez échantillonner à 0,3 µm Si vous utilisez un 20 multi immersion, vous devez échantillonner à 1,3 µm. 19. Cliquer sur "Acquire" 28

29 20. La sauvegarde est automatique dans le mode "Timelapse". Vérifiez que vous avez bien choisi l emplacement de vos données. 21. Cliquer sur "Acquire" Le stack est en format stk. Mode Rapide Vous pouvez augmenter la cadence des acquisitions en choisissant le mode "Stream" au détriment de la dynamique. 20. Dans l onglet "Main" cochez "Stream" en plus des autres paramètres. 21. Cochez "Stream" en haut de l onglet "Wavelength". 22. Dans l onglet "Stream" cochez "Stream Z" et "Stream Time". Déterminez le temps d exposition dans "Stream Exposure Time". 29

30 Acquisition multi-couleurs mono-plan sans timelapse 1. Ouvrir la boite "Apps/ Multi Dimensional Acquisition". 2. Dans l onglet "Main" cochez "Multiple Wavelenght" RMQ : le mode "Stream" permet de faire des acquisitions plus rapides mais plus bruitées (cf "Mode Rapide"). 3. Sélectionnez le nom de vos données et leur emplacement pour l enregistrement : users / «année» / «mois en cours» / «jour de la manip» / «dossier à votre nom». 4. Dans la Taskbar choisissez le mode lent ou rapide (le mode lent permet une meilleure dynamique que le mode rapide). 5. Atténuer le signal de fluorescence directement sur l EL6000 ou insérer des filtres de densité optique (DO) en illumination DG4 sur le trajet optique de la fluorescence. Vous pouvez également insérer des filtres en lumière transmise. Il en existe 6 DO % T Commencer par une forte atténuation pour éviter de photoblanchir votre échantillon. Si le signal est trop faible, essayer d augmenter le temps d exposition avant de changer le filtre d atténuation. Plus vous éclairez un échantillon, plus vous le détruisez. 6. Selon l objectif utilisé définissez le binning et l optovar approprié Objectif 100X : binning de 2, optovar de 1X Objectif 63X : binning de 1, optovar de 1X Objectif 40X : binning de 1, optovar de 1.5X Objectif 20X : binning de 1, optovar de 1.5X 30

31 7. Vérifier la configuration du piezzo et au besoin la rétablir. Ouvrir la boite "Display/Focus ". Aller dans l onglet "Configure ". Dans la boite "Current Position " taper 50 (pour le piezzo 100) ou 175 (pour le piezzo 350) et valider en cliquant sur «Set To Top». Taper ensuite 0 et "Set Home" puis -50 (ou - 175) et " Set Bottom". Refaire la mise au point au microscope 8. Dans l onglet "Wavelength" choisir le nombre de fluorophores à imager. 9. Dans la boîte "Current Wavelength" du même onglet choisir : 1, sans tenir compte du nom du fluorophore qui suit. 10. Dans la boîte "illumination" choisir le premier fluorophore d intérêt (GFP, DsRed, Cy5) et le temps d exposition voulu pour ce fluorophore. 11. Dans la boîte "Current Wavelength" du même onglet choisir : 2, sans tenir compte du nom du fluorophore qui suit et dans la boîte "Illumination" choisir le deuxième fluorophore d intérêt (GFP, DsRED, Cy5) et le temps d exposition correspondant. Idem s il existe un autre fluorophore. 31

32 RMQ : Votre acquisition se fera selon l ordre que vous avez choisit et avec le temps d exposition indiqué pour chaque fluorochrome. 12. Cliquer sur "Snap" pour faire une image de chaque fluorophore. 13. Ouvrir le menu "Display/ Scale Image". Ce menu donne la dynamique de l image. Le maximum de l image ne doit jamais atteindre Plus la dynamique de l image (différence entre intensité maximum et intensité minimum) (dans cet exemple : =671 niveaux) meilleur est l image. Une dynamique de 300 niveaux est suffisante en cellule vivante. Une dynamique de 100 niveaux est suffisante en cellule fixée. Remarques : Si la dynamique de l image est trop faible, augmenter le temps d acquisition. Plus on éclaire un échantillon, plus on le détruit. Pour choisir le bon compromis, n hésitez pas à demander conseil à un ingénieur de la plate-forme. Il est possible d acquérir qu une partie du champ en définissant une région d intérêt Choisir une forme Dans le menu "Apps/ Multi Dimensional Acquisition" cliquer sur "Active Region". Cliquer sur "Live" ou "Snap" pour avoir l image votre zone d intérêt. Pour revenir région entière cliquez sur "full chip". 14. Cliquer sur "Acquire" 15. Cliquez sur "Save Image" pour sauvegarder vos données. 32

33 Mode Rapide Vous pouvez augmenter la cadence des acquisitions en choisissant le mode "Stream" au détriment de la dynamique. 1. Dans l onglet "Main" cochez "Stream" en plus des autres paramètres. 2. Pour chaque fluorochromes que vous souhaitez acquérir en mode "Stream" vous devez cochez "Stream" en haut de l onglet "Wavelength". 3. Dans l onglet "Stream" cochez "Stream Multiple Wavelenght". Déterminez le temps d exposition dans "Stream Exposure Time". Le temps est le même pour tous les fluorochromes. 33

34 Acquisition multi-couleurs mono-plan avec timelapse 1. Ouvrir la boite "Apps/ Multi Dimensional Acquisition". 2. Dans l onglet "Main" cochez "Time Lapse", "Multiple Wavelenght" RMQ : le mode "Stream" permet de faire des acquisitions plus rapides mais plus bruitées (cf "Mode Rapide"). 3. Sélectionnez le nom de vos données et leur emplacement pour l enregistrement : users / «année» / «mois en cours» / «jour de la manip» / «dossier à votre nom». 4. Dans la Taskbar choisissez le mode lent ou rapide (uniquement pour le mode Stream). 5. Atténuer le signal de fluorescence directement sur l EL6000 ou insérer des filtres de densité optique (DO) en illumination DG4 sur le trajet optique de la fluorescence. Vous pouvez également insérer des filtres en lumière transmise. Il en existe 6 DO % T Commencer par une forte atténuation pour éviter de photoblanchir votre échantillon. Si le signal est trop faible, essayer d augmenter le temps d exposition avant de changer le filtre d atténuation. Plus vous éclairez un échantillon, plus vous le détruisez. 6. Selon l objectif utilisé définissez le binning et l optovar approprié Objectif 100X : binning de 2, optovar de 1X Objectif 63X : binning de 1, optovar de 1X Objectif 40X : binning de 1, optovar de 1.5X Objectif 20X : binning de 1, optovar de 1.5X 34

35 7. Vérifier la configuration du piezzo et au besoin la rétablir. Ouvrir la boite "Display/Focus ". Aller dans l onglet "Configure ". Dans la boite "Current Position " taper 50 (pour le piezzo 100) ou 175 (pour le piezzo 350) et valider en cliquant sur «Set To Top». Taper ensuite 0 et "Set Home" puis -50 (ou - 175) et " Set Bottom". Refaire la mise au point au microscope 8. Dans l onglet "Wavelength" choisir le nombre de fluorophores à imager. 9. Dans la boîte "Current Wavelength" du même onglet choisir : 1, sans tenir compte du nom du fluorophore qui suit. 10. Dans la boîte illumination choisir le premier fluorophore d intérêt (GFP, DsRed, Cy5) et le temps d exposition voulu pour ce fluorophore. 11. Dans la boîte "Current Wavelength" du même onglet choisir : 2, sans tenir compte du nom du fluorophore qui suit et dans la boîte "Illumination" choisir le deuxième fluorophore d intérêt (GFP, DsRED, Cy5) et le temps d exposition correspondant. Idem s il existe un autre fluorophore. RMQ : Votre acquisition se fera selon l ordre que vous avez choisit et avec le temps d exposition indiqué pour chaque fluorochrome. 35

36 12. Cliquer sur "Snap" pour faire une image de chaque fluorophore. 13. Ouvrir le menu "Display/ Scale Image". Ce menu donne la dynamique de l image. Le maximum de l image ne doit jamais atteindre Plus la dynamique de l image (différence entre intensité maximum et intensité minimum) (dans cet exemple : =671 niveaux) meilleur est l image. Une dynamique de 300 niveaux est suffisante en cellule vivante. Une dynamique de 100 niveaux est suffisante en cellule fixée. Remarques : Si la dynamique de l image est trop faible, augmenter le temps d acquisition. Plus on éclaire un échantillon, plus on le détruit. Pour choisir le bon compromis, n hésitez pas à demander conseil à un ingénieur de la plateforme. Il est possible d acquérir qu une partie du champ en définissant une région d intérêt Choisir une forme Dans le menu "Apps/ Multi Dimensional Acquisition" cliquer sur "Active Region". Cliquer sur "Live" ou "Snap" pour avoir l image votre zone d intérêt. Pour revenir région entière cliquez sur "full chip". 36

37 14. Dans l onglet "Timelapse" choisissez l intervalle entre 2 points de temps (Time Interval), le nombre de points de temps (nombre d images) ou la durée totale de l acquisition (duration). 15. La sauvegarde est automatique dans le mode "Timelapse". Vérifiez que vous avez bien défini l emplacement de vos données 16. Cliquer sur "Acquire" Le stack est en format stk. Mode Rapide Vous pouvez augmenter la cadence des acquisitions en choisissant le mode "Stream" au détriment de la dynamique. 17. Dans l onglet "Main" cochez "Stream" en plus des autres paramètres. 18. Pour chaque fluorochromes que vous souhaitez acquérir en mode "Stream" vous devez cochez "Stream" en haut de l onglet "Wavelength". 19. Dans l onglet "Stream" cochez "Stream Multiple Wavelenght" et "Stream Time". Déterminez le temps d exposition dans "Stream Exposure Time". Le temps est le même pour tous les fluorochromes. 37

38 38

39 Acquisition multi-couleurs multi-plans sans timelapse 1. Ouvrir la boite "Apps/ Multi Dimensional Acquisition". 2. Dans l onglet "Main" cochez "Do Z series", "Multiple Wavelenght" RMQ : le mode "Stream" permet de faire des acquisitions plus rapides mais plus bruitées (cf "Mode Rapide"). 3. Sélectionnez le nom de vos données et leur emplacement pour l enregistrement : users / «année» / «mois en cours» / «jour de la manip» / «dossier à votre nom». 4. Dans la Taskbar choisissez le mode lent ou rapide (le mode lent permet une meilleure dynamique que le mode rapide). 5. Atténuer le signal de fluorescence directement sur l EL6000 ou insérer des filtres de densité optique (DO) en illumination DG4 sur le trajet optique de la fluorescence. Vous pouvez également insérer des filtres en lumière transmise. Il en existe 6. DO % T Commencer par une forte atténuation pour éviter de photoblanchir votre échantillon. Si le signal est trop faible, essayer d augmenter le temps d exposition avant de changer le filtre d atténuation. Plus vous éclairez un échantillon, plus vous le détruisez. 6. Selon l objectif utilisé définissez le binning et l optovar approprié Objectif 100X : binning de 2, optovar de 1X Objectif 63X : binning de 1, optovar de 1X Objectif 40X : binning de 1, optovar de 1.5X Objectif 20X : binning de 1, optovar de 1.5X 39

40 7. Vérifier la configuration du piezzo et au besoin la rétablir. Ouvrir la boite "Display/Focus ". Aller dans l onglet "Configure ". Dans la boite "Current Position " taper 50 (pour le piezzo 100) ou 175 (pour le piezzo 350) et valider en cliquant sur «Set To Top». Taper ensuite 0 et "Set Home" puis -50 (ou - 175) et " Set Bottom". Refaire la mise au point au microscope. 8. Dans l onglet "Wavelength" choisir le nombre de fluorophores à imager. 9. Dans la boîte "Current Wavelength" du même onglet choisir : 1, sans tenir compte du nom du fluorophore qui suit. 10. Dans la boîte illumination choisir le premier fluorophore d intérêt (GFP, DsRed, Cy5) et le temps d exposition voulu pour ce fluorophore. 11. Dans la boîte "Current Wavelength" du même onglet choisir : 2, sans tenir compte du nom du fluorophore qui suit et dans la boîte "Illumination" choisir le deuxième fluorophore d intérêt (GFP, DsRED, Cy5) et le temps d exposition correspondant. Idem s il existe un autre fluorophore. 40

41 RMQ : Votre acquisition se fera selon l ordre que vous avez choisit et avec le temps d exposition indiqué pour chaque fluorochrome. 12. Pour chaque fluoroflore que vous souhaitez acquérir en stack cochez "Do Z serie" 13. Cliquer sur "Snap" pour faire une image de chaque fluorophore. 14. Ouvrir le menu "Display/ Scale Image". Ce menu donne la dynamique de l image. Le maximum de l image ne doit jamais atteindre Plus la dynamique de l image (différence entre intensité maximum et intensité minimum) (dans cet exemple : =671 niveaux) meilleur est l image. Une dynamique de 300 niveaux est suffisante en cellule vivante. Une dynamique de 100 niveaux est suffisante en cellule fixée. Remarques : Si la dynamique de l image est trop faible, augmenter le temps d acquisition. Plus on éclaire un échantillon, plus on le détruit. Pour choisir le bon compromis, n hésitez pas à demander conseil à un ingénieur de la plateforme. Il est possible d acquérir qu une partie du champ en définissant une région d intérêt Choisir une forme Dans le menu "Apps/ Multi Dimensional Acquisition" cliquer sur "Active Region". Cliquer sur "Live" ou "Snap" pour avoir l image votre zone d intérêt. 41

42 Pour revenir région entière cliquez sur "full chip". 15. Ouvrir l onglet "Z series". 2 possibilités s offrent à vous pour imager un stack : choisir le haut et la bas de la zone à imager ou centrer le stack sur un plan et définir le nombre de plans. Choisir le haut et le bas de la zone à imager 16. Choisir "Acquire Wavelength Set at Each Z" ou "Acquire Z Series for One Wavelength at a Time". La deuxième solution ne nécessitant pas de changement de filtres entre chaque image, l acquisition sera plus rapide. 17. Se mettre en mode live pour repérer la structure à imager. 18. Vérifiez que "Current Position" est à 0 (sinon cf 7.) 19. Choisir le haut de votre stack en vous déplaçant grâce aux flèches de la case "Current Position". 20. Dés que vous avez repéré une position validez là en cliquant sur "Set Top To Current". 42

43 21. Procéder de façon identique pour définir la limite inférieure de la région d acquisition (cliquez sur "Set Bottom to Current"). 22. Choisir le "Step Size". Il dépend de l objectif utilisé. Il est important de bien choisir cette distance entre deux coupes en vue de faire des reconstructions 3D ou de déconvoluer vos images Si vous travaillez au 100x ou au 63x à huile (NA : 1.4) vous devez échantillonner à 0.2 µm Si vous travaillez au 63 à eau vous devez échantillonner à 0,350 µm Si vous travaillez au 63 sec vous devez échantillonner à 1,3 µm Si vous utilisez un 40 à huile vous devez échantillonner à 0,3 µm Si vous utilisez un 20 multi immersion, vous devez échantillonner à 1,3 µm. 23. La sauvegarde est automatique dans le mode "Timelapse". Vérifiez que vous avez bien défini l emplacement de vos données. 24. Cliquer sur "Acquire" Le stack est en format stk. Centrer le stack sur un plan 16. Choisir "Acquire Wavelength Set at Each Z" ou "Acquire Z Series for One Wavelength at a Time". La deuxième solution ne nécessitant pas de changement de filtres entre chaque image, l acquisition sera plus rapide. 17. Se mettre en mode live pour repérer la structure à imager. 18. Vérifiez que "Current Position" est à 0 (sinon cf 7.) 19. Cochez "Range Around Current". Le stack sera centré sur le plan actuel (ou sur le plan renvoyé par l autofocus ou sur celui déterminé à chaque position lors d une acquisition multi-champs). 43

44 20. Choisissez le "Step Size" et le nombre de coupes ("Number of Step") ou l épaisseur d échantillon ("Range") que vous souhaitez acquérir. Il est très important de bien choisir le "step size" en vue de faire des reconstructions 3D ou de déconvoluer vos images. Il dépend de l objectif que vous utilisez. Les valeurs optimales sont les suivantes : Si vous travaillez au 100x ou au 63x à huile (NA : 1.4) vous devez échantillonner à 0.2 µm Si vous travaillez au 63 à eau vous devez échantillonner à 0,350 µm Si vous travaillez au 63 sec vous devez échantillonner à 1,3 µm Si vous utilisez un 40 à huile vous devez échantillonner à 0,3 µm Si vous utilisez un 20 multi immersion, vous devez échantillonner à 1,3 µm. 21. Cliquer sur "Acquire" 22. Cliquez sur "Save Image" pour sauvegarder vos données. Mode Rapide Vous pouvez augmenter la cadence des acquisitions en choisissant le mode "Stream" au détriment de la dynamique. 1. Dans l onglet "Main" cochez "Stream" en plus des autres paramètres. 44

45 2. Pour chaque fluorochromes que vous souhaitez acquérir en mode "Stream" vous devez cochez "Stream" en haut de l onglet "Wavelength". 3. Dans l onglet "Stream" cochez "Stream Z" et "Stream Multiple Wavelenght" Déterminez le temps d exposition dans "Stream Exposure Time". Le temps est le même pour tous les fluorochromes. 45

46 Acquisition multi-couleurs multi-plans avec timelapse 1. Ouvrir la boite "Apps/ Multi Dimensional Acquisition". 2. Dans l onglet "Main" cochez "Time Lapse", "Do Z series", "Multiple Wavelenght" RMQ : le mode "Stream" permet de faire des acquisitions plus rapides mais plus bruitées (cf "Mode Rapide"). 3. Sélectionnez le nom de vos données et leur emplacement pour l enregistrement : users / «année» / «mois en cours» / «jour de la manip» / «dossier à votre nom». 4. Dans la Taskbar choisissez le mode lent ou rapide (uniquement pour le mode Stream). 5. Atténuer le signal de fluorescence directement sur l EL6000 ou insérer des filtres de densité optique (DO) en illumination DG4 sur le trajet optique de la fluorescence. Vous pouvez également insérer des filtres en lumière transmise. Il en existe 6. DO % T Commencer par une forte atténuation pour éviter de photoblanchir votre échantillon. Si le signal est trop faible, essayer d augmenter le temps d exposition avant de changer le filtre d atténuation. Plus vous éclairez un échantillon, plus vous le détruisez. 6. Selon l objectif utilisé définissez le binning et l optovar approprié Objectif 100X : binning de 2, optovar de 1X Objectif 63X : binning de 1, optovar de 1X Objectif 40X : binning de 1, optovar de 1.5X Objectif 20X : binning de 1, optovar de 1.5X 46

47 7. Vérifier la configuration du piezzo et au besoin la rétablir. Ouvrir la boite "Display/Focus ". Aller dans l onglet "Configure ". Dans la boite "Current Position " taper 50 (pour le piezzo 100) ou 175 (pour le piezzo 350) et valider en cliquant sur «Set To Top». Taper ensuite 0 et "Set Home" puis -50 (ou - 175) et " Set Bottom". Refaire la mise au point au microscope 8. Dans l onglet "Wavelength" choisir le nombre de fluorophores à imager. 9. Dans la boîte "Current Wavelength" du même onglet choisir : 1, sans tenir compte du nom du fluorophore qui suit. 10. Dans la boîte illumination choisir le premier fluorophore d intérêt (GFP, DsRed, Cy5) et le temps d exposition voulu pour ce fluorophore. 11. Dans la boîte "Current Wavelength" du même onglet choisir : 2, sans tenir compte du nom du fluorophore qui suit et dans la boîte "Illumination" choisir le deuxième fluorophore d intérêt (GFP, DsRED, Cy5) et le temps d exposition correspondant. Idem s il existe un autre fluorophore. RMQ : Votre acquisition se fera selon l ordre que vous avez choisit et avec le temps d exposition indiqué pour chaque fluorochrome. 47

48 12. Pour chaque fluoroflore que vous souhaitez acquérir en stack cochez "Do Z serie" 13. Cliquer sur "Snap" pour faire une image de chaque fluorophore. 14. Ouvrir le menu "Display/ Scale Image". Ce menu donne la dynamique de l image. Le maximum de l image ne doit jamais atteindre Plus la dynamique de l image (différence entre intensité maximum et intensité minimum) (dans cet exemple : =671 niveaux) meilleur est l image. Une dynamique de 300 niveaux est suffisante en cellule vivante. Une dynamique de 100 niveaux est suffisante en cellule fixée. Remarques : Si la dynamique de l image est trop faible, augmenter le temps d acquisition. Plus on éclaire un échantillon, plus on le détruit. Pour choisir le bon compromis, n hésitez pas à demander conseil à un ingénieur de la plateforme. Il est possible d acquérir qu une partie du champ en définissant une région d intérêt Choisir une forme Dans le menu "Apps/ Multi Dimensional Acquisition" cliquer sur "Active Region". Cliquer sur "Live" ou "Snap" pour avoir l image votre zone d intérêt. Pour revenir région entière cliquez sur "full chip". 48

49 15. Dans l onglet "Timelapse" choisissez l intervalle entre 2 points de temps(time Interval), le nombre de points de temps (nombre d images) ou la durée totale de l acquisition (duration). 16. Ouvrir l onglet "Z series". 2 possibilités s offrent à vous pour imager un stack : choisir le haut et la bas de la zone à imager ou centrer le stack sur un plan et définir le nombre de plans. Choisir le haut et le bas de la zone à imager 17. Choisir "Acquire Wavelength Set at Each Z" ou "Acquire Z Series for One Wavelength at a Time". La deuxième solution ne nécessitant pas de changement de filtres entre chaque image, l acquisition sera plus rapide. 18. Se mettre en mode live pour repérer la structure à imager. 49

50 19. Vérifiez que "Current Position" est à 0 (sinon cf 7.) 20. Choisir le haut de votre stack en vous déplaçant grâce aux flèches de la case "Current Position". 21. Dés que vous avez repéré une position validez là en cliquant sur "Set Top To Current". 22. Procéder de façon identique pour définir la limite inférieure de la région d acquisition (cliquez sur "Set Bottom to Current"). 23. Choisir le "Step Size". Il dépend de l objectif utilisé. Il est important de bien choisir cette distance entre deux coupes en vue de faire des reconstructions 3D ou de déconvoluer vos images Si vous travaillez au 100x ou au 63x à huile (NA : 1.4) vous devez échantillonner à 0.2 µm Si vous travaillez au 63 à eau vous devez échantillonner à 0,350 µm Si vous travaillez au 63 sec vous devez échantillonner à 1,3 µm Si vous utilisez un 40 à huile vous devez échantillonner à 0,3 µm Si vous utilisez un 20 multi immersion, vous devez échantillonner à 1,3 µm. 24. La sauvegarde est automatique dans le mode "Timelapse" : vérifiez que vous avez bien choisi l emplacement de vos données 25. Cliquer sur "Acquire". Le stack est en format stk. Centrer le stack sur un plan 17. Choisir "Acquire Wavelength Set at Each Z" ou "Acquire Z Series for One Wavelength at a Time". La deuxième solution ne nécessitant pas de changement de filtres entre chaque image, l acquisition sera plus rapide. 18. Se mettre en mode live pour repérer la structure à imager. 50

51 19. Vérifiez que "Current Position" est à 0 (sinon cf 7.) 20. Cochez "Range Around Current". Le stack sera centré sur le plan actuel (ou sur le plan renvoyé par l autofocus ou sur celui déterminé à chaque position lors d une acquisition multi-champs) 21. Choisissez le "Step Size" et le nombre de coupes ("Number of Step") ou l épaisseur d échantillon ("Range") que vous souhaitez acquérir. Il est très important de bien choisir le "step size" en vue de faire des reconstructions 3D ou de déconvoluer vos images. Il dépend de l objectif que vous utilisez. Les valeurs optimales sont les suivantes : Si vous travaillez au 100x ou au 63x à huile (NA : 1.4) vous devez échantillonner à 0.2 µm Si vous travaillez au 63 à eau vous devez échantillonner à 0,350 µm Si vous travaillez au 63 sec vous devez échantillonner à 1,3 µm Si vous utilisez un 40 à huile vous devez échantillonner à 0,3 µm Si vous utilisez un 20 multi immersion, vous devez échantillonner à 1,3 µm. 22. La sauvegarde est automatique dans le mode "Timelapse" : vérifiez que vous avez bien choisi l emplacement de vos données 23. Cliquer sur "Acquire". Le stack est en format stk. 51

52 Mode Rapide Vous pouvez augmenter la cadence des acquisitions en choisissant le mode "Stream" au détriment de la dynamique. 1. Dans l onglet "Main" cochez "Stream" en plus des autres paramètres. 2. Pour chaque fluorochromes que vous souhaitez acquérir en mode "Stream" vous devez cochez "Stream" en haut de l onglet "Wavelength". 3. Dans l onglet "Stream" cochez "Stream Z", "Stream Multiple Wavelenght" et "Stream Time". Déterminez le temps d exposition dans "Stream Exposure Time". Le temps est le même pour tous les fluorochromes. 52

53 Balayage d une série de champs (multiposition XY) Cette possibilité s ajoute à tout type d acquisition: un ou plusieurs fluorochromes (mono ou multi-couleurs), un ou plusieurs plans (mono ou multi-plans), avec ou sans timelapse. Les réglages à effectuer pour chaque combinaison de ces paramètres sont expliqués précédemment (cf table des matières en première page du tutorial). Il est préférable de choisir des positions peu éloignées les unes des autres. Voici maintenant les explications pour le repérage des positions des différents champs que vous voulez imager. 1. Ouvrir le menu "Apps/ Multi Dimensional Acquisition ". 2. Dans l onglet " Main " cochez "Multiple Stage Positions ". 3. Sélectionner le nom des données et leur emplacement pour l enregistrement : users / «année» / «mois en cours» / «jour de la manip» / «dossier à votre nom». RMQ : La sauvegarde est automatique. 4. Dans la Taskbar choisissez le mode lent ou rapide (le mode lent permet une meilleure résolution que le mode rapide). 53

54 5. Mettez vous en "Live". 6. Choisir un champ grâce au joystick 7. Dans l onglet " Stage ", mettez au point grâce au piezzo (flèches après l encadré Z) et valider votre position en cliquant sur " Add". Pour supprimer une position, sélectionnez la et cliquez sur "Remove". Vous ne devez absolument plus modifier la mise au point sur le microscope. Vous devez impérativement utiliser le piezzo pour ajuster la mise au point selon les positions. Vous pouvez sélectionner jusqu à 20 positions avec le joystick. RMQ : Vous pouvez aussi choisir l option «Autofocus» dans le menu «Wavelength». A ce moment là le focus sera fait à chaque plan et à chaque position. 54

55 8. Dans le cas d une acquisition d un stack en Z vous devez utiliser l option "Range Around Current" dans l onglet Z. La valeur Z enregistrée pour chaque position (c est-à-dire le focus) sera prise en compte comme étant le plan médian du stack c est-à-dire le plan autour duquel sera centré le stack. Si vous faites une acquisition en transmission avec un autofocus à chaque position, Metamorph prendra en compte la valeur du plan choisi par l autofocus et centrera le stack en fluorescence sur ce plan. Ex 1: vous faites un timelapse sur 10 positions de champs, avec acquisition d un stack en GFP et d un stack en DAPI. Pour chaque position les stacks seront centrés sur la valeur Z correspondante au champ en cours. Ex 2: vous faites un timelapse sur 10 positions de champs, avec l acquisition d un plan en transmission avec autofocus et une acquisition GFP en stack. Pour chaque position vous aurez un autofocus en transmission qui déterminera le plan avec la meilleure mise au point. Puis vous aurez un stack en GFP centré sur le plan déterminé par l autofocus. 55

56 9. Choisissez le "Step Size" et le nombre de coupes ("Number of Step") ou l épaisseur d échantillon ("Range") que vous souhaitez acquérir. Il est très important de bien choisir le "step size" en vue de faire des reconstructions 3D ou de déconvoluer vos images. Il dépend de l objectif que vous utilisez. Les valeurs optimales sont les suivantes : Si vous travaillez au 100x ou au 63x à huile (NA : 1.4) vous devez échantillonner à 0.2 µm Si vous travaillez au 63 à eau vous devez échantillonner à 0,350 µm Si vous travaillez au 63 sec vous devez échantillonner à 1,3 µm Si vous utilisez un 40 à huile vous devez échantillonner à 0,3 µm Si vous utilisez un 20 multi immersion, vous devez échantillonner à 1,3 µm. 10. Choisissez "Acquire Wavelength Set at Each Z" ou "Acquire Z Series for One Wavelength at a Time". La deuxième solution ne nécessitant pas de changement de filtres entre chaque image, l acquisition sera plus rapide. 11. La sauvegarde est automatique. Vérifiez que vous avez bien défini l emplacement de vos données. 12. Cliquer sur "Acquire" Le stack est en format stk. 56

57 Visualisation des acquisitions multiparamétriques 1. Ouvrir le menu "Apps/ Review Multi Dimensional data/select Base File". La fenêtre "Multi Dimensional Data Set Utilities " s ouvre automatiquement : choisissez le dossier que vous voulez visionner. 2. Allez dans "Select Directory" pour sélectionnez l acquisition que vous voulez visionner. 3. Dans "Data Set " cochez une image ou un stack et cliquez sur "View " pour afficher son contenu à l écran. 4. Dans "Wavelenghts " choisissez les longueurs d onde que vous voulez. 5. Chaque image du stack est représentée dans un tableau selon sa position en Z et dans le temps. Les curseurs Z et Time permettent de visualiser les images une à une ou de les faire défiler. Pour créer le stack correspondant à un plan ou à un point de temps, faites un clic droit sur le numéro du plan ou du point de temps et cliquez sur "Load Images". Vous pouvez aussi cliquez sur "Select Best Focus" puis sur "Load Images". Metamorph fera un stack avec le meilleur focus pour chaque points de temps. 57

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