Statistical analysis of microbiology data 1 : optimal conditions for culturing different strains of Staphylococcus aureus

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1 Statistique 3 ème année INSA-ICBE /9 3ICBE - Statistique Contrôle du jeudi 9 avril Statistical analysis of microbiology data : optimal conditions for culturing different strains of Staphylococcus aureus Nota Bene : La totale compréhension de la présentation en anglais n est pas indispensable à la bonne résolution des questions. A person may have a boil or an infected wound from an operation. If it is not responding to antibiotics, they will often be required to supply a swab from the wound for a medical laboratory to investigate. A sterile cotton bud swab is wiped across the wound and wetted with the pus that contains myriads of bacteria cells. The cotton bud is then swirled in a salt enrichment broth and incubated for a period of time. This broth may then be diluted and a drop wiped across the surface of a solid nutritive medium so that bacteria are transferred to the medium surface. The laboratory cultures the sample on a variety of media one of which is suitable for the growth of Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). The aim is to culture the offending bacterium quickly so that it can be identified and susceptibility testing performed so that a suitable antibiotic can be used. MRSA is a bacterium, whose strains are resistant to penicillin and sensitive only to the expensive antibiotic vancomycin. This bacterium is cultured in a.5% (by weight) sodium chloride enrichment broth. The salt in the broth inhibits the growth of most normal flora that may be present at the site from which the specimen was collected. This ensures that it will be easier to identify the Staphylococcus aureus if it is present. Tryptone is a source of amino acids derived from casein, which is included in the broth as a nutrient. It contains nitrogen, in a form readily available to the bacteria, which encourages growth. The current protocol requires tryptone to be included in the broth at a concentration of.% (by weight) and cultured at 35 degrees Celsius for 4 hours. The goal is to decide if these are the best conditions for culturing the MRSA. Five strains of MRSA were used so that the conditions for optimum growth could be investigated for each strain separately. These strains were WSPP MRSA, WSPP MRSA, Akh MRSA, Phage pattern 5/5A/79/.., and Phage pattern 9/5/77/+. Because of these curious names they are simply referred to in the data as strain,, 3, 4 and 5 respectively. En résumé : Le staphylocoque doré est une bactérie pathogène responsable d infections nosocomiales. En cas d infection postopératoire, une culture en laboratoire est réalisée afin de préciser le diagnostic et prescrire le bon antibiotique. Le jeu de données contient les comptages des 5 souches mises en culture. Pour chaque souche on a essayé une fois chacune des différentes combinaisons possibles des 3 conditions expérimentales : le temps : (Times) 4h et 48h la température : (Temp) 7, 35 et 43 la concentration du gel en nutriment (Tryptone) :,6%,8%,%,% et,4% L objectif est de trouver les conditions optimales de culture de ces souches. Aidez vous des tableaux et figures de l annexe pour répondre aux questions suivantes. Chaque réponse doit être justifiée à partir d un résultat numérique fourni par le logiciel Minitab ou en précisant le numéro de la figure concernée. Données décrites par Neil Binnie (4) in Journal of Statistics Education Volume, Number.

2 Statistique 3 ème année INSA-ICBE /9 Etude exploratoire. Quelle est la population étudiée? Quel est l échantillon, quelle est sa taille?. Commentez les graphiques de la figure. Que dire sur la distribution de la variable Count?.3 Un test apparaît dans cette figure. Quelle est l hypothèse testée? Que faut-il en conclure?.4 Quel est l écart-type de la variable Count? L écart-type de l estimation de sa moyenne?.5 Cette variable a été transformée par la fonction racine (SqrtCount, figure ). Cette transformation vous semble-t-elle appropriée?.6 On s intéresse à l influence du temps d incubation sur l évolution de la population bactérienne. Que représente la figure 3? Quel commentaire suggère ce graphique?.7 Même chose pour la température (figure 4). Que penser de la liaison entre l effectif de la colonie et la température?.8 Même chose pour la concentration de Tryptone (figure 5). Comment interpréter la 78 ème observation qui prend les valeurs : Strain= Count=69 Time=48 Temp=35 Tryptone=, Test de Comparaison. On s intéresse tout d abord à la question biologique suivante : globalement, les souches se comportentelles différemment? Quelle méthode permet de répondre à cette question?. Quelles propriétés doivent être vérifiées par les données pour que cette méthode soit applicable?.3 Justifier avec les résultats de l annexe (quels tests, quelles hypothèses H) que ces propriétés sont bien vérifiées..4 Répondre à la question biologique. : poser l hypothèse H, écrire l hypothèse alternative..5 Quelle conclusion? 3 Modèles de régression linéaire et quadratique Dans tout ce qui suit et par souci de simplicité des modèles, les souches de bactéries ne sont plus distinguées. 3. Un premier modèle est considéré pour expliquer la variable Count en fonction de la température, du temps d incubation et de la concentration de Tryptone. Le jugez vous valide? (figures 7 et Table ). 3. Compte tenu des commentaires des questions.7 et.8, un modèle quadratique est envisagé. De nouvelles variables sont calculées avec Minitab, elles contiennent les carrés des variables Tryptone** et Temp** ainsi que les produits Temp*Tryptone, Temp*Time et Time*Tryptone. Ecrire l équation du modèle obtenu (table 3). Le considérez vous valide (figure 8)? Que devient l ajustement par rapport au modèle précédent? 3.3 La variable Count est remplacée par SqrtCount. Que pensez-vous de la validité du modèle obtenu (figures 9 et )? 3.4 L objectif est de rechercher l optimum de la fonction SqrtCount telle qu elle est approchée par le modèle. On cherche donc le meilleur modèle prédictif. Que penser des modèles des tables 4, 5 et 6. Ecrire l équation du «meilleur» modèle. 3.5 En cas de maladie nosocomiale, le temps est un facteur important pour la santé du patient. On choisit de se limiter à un temps d incubation de 4h. Que devient le modèle? (On considèrera que les coefficients des termes qui restent n ont pas été modifiés par la réduction du nombre de comptage.) 3.6 Calculer les dérivées de ce modèle par rapport à la variable «Tryptone» puis par rapport à «Temp». 3.7 Quelles sont les conditions optimales de culture proposée par ce modèle, c est-à-dire celles qui conduisent à la plus forte croissance des populations bactériennes?

3 Statistique 3 ème année INSA-ICBE 3/9 Annexe Summary for Count A nderson-darling Normality Test A-Squared,43 P-Value,3 Mean,5 StDev 63,67 V ariance 453,93 Skew ness,459 Kurtosis -, N Minimum 3, st Q uartile 76,75 Median 3, 3rd Q uartile 6, Maximum 84, 95% C onfidence Interv al for Mean,4 3,79 95% C onfidence Interv al for Median,54 3, Mean 95% Confidence Intervals 95% C onfidence Interv al for StDev 57,9 7,8 Median Figure Summary for SqrtCount A nderson-darling Normality Test A-Squared,74 P-Value <,5 Mean,59 StDev 3,5 V ariance,4 Skew ness -, Kurtosis -,663 N Minimum,73 st Q uartile 8,76 Median,9 3rd Q uartile,78 Maximum 6,85 95% C onfidence Interv al for Mean,7, 95% C onfidence Interv al for Median,54,489 Mean 95% Confidence Intervals 95% C onfidence Interv al for StDev,897 3,638 Median,,5,5,75,,5,5 Figure

4 Statistique 3 ème année INSA-ICBE 4/9 3 Boxplot of Count vs Time 5 Count Time 48 Figure 3 3 Boxplot of Count vs Temp 5 Count Temp 43 Figure 4

5 Statistique 3 ème année INSA-ICBE 5/9 3 Boxplot of Count by Tryptone 5 Count 5 5,6,8, Tryptone,,4 Figure 5 Test for Equal Variances for Count Bartlett's Test Test Statistic,5 P-Value,83 Levene's Test Test Statistic,8 P-Value,89 Strain % Bonferroni Confidence Intervals for StDevs Figure 6

6 Statistique 3 ème année INSA-ICBE 6/9 Table : One-way ANOVA: Count versus Strain Source DF SS MS F P Strain ,3,879 Error Total S = 64,8 R-Sq =,8% R-Sq(adj) =,% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ,5 67,75 ( * ) 3,7 64,89 ( * ) 3 3 3,4 7, ( * ) 4 3 6,7 6,48 ( * ) 5 3 7,33 57,33 ( * ) Table : Regression Analysis: Count versus Time; Temp; Tryptone Count = ,35 Time +, Temp + 9,9 Tryptone Constant -68,49 3, -7,3, Time 3,358,679,5, Temp,5,49 4,49, Tryptone 9,87,37 8,7, S = 39,3794 R-Sq = 6,5% R-Sq(adj) = 6,7% Residual Plots for Count Normal Probability Plot of the Residuals Residuals Versus the Fitted Values Percent 99, , Fitted Value Histogram of the Residuals Residuals Versus the Order of the Data Frequency ,6 -,8,,8,6 Figure 7, Observation Order Count vs. Time, Temp and Tryptone 3 4 5

7 Statistique 3 ème année INSA-ICBE 7/9 Table 3 : Regression Analysis: Count versus Time; Temp; Count = ,9 Time + 53, Temp + 9 Tryptone -,7 Time*Temp +,69 Time*Tryptone +,6 Temp*Tryptone -,64 Temp** - 7 Tryptone** Constant -88, 6, -,4, Time 8,9,55 7,, Temp 5,997 5,633 9,4, Tryptone 8,93 85,98,66,9 Time*Temp -,79,956-7,, Time*Tryptone,686,687,47,5 Temp*Tryptone,69,54,8, Temp** -,6487,768-8,36, Tryptone** -6,55 34,6-3,66, S = 8,3787 R-Sq = 8,% R-Sq(adj) = 8,% Analysis of Variance Source DF SS MS F P Regression ,3, Residual Error Total Residual Plots for Count Normal Probability Plot of the Residuals Residuals Versus the Fitted Values Percent 99, , ,,5, -,5-3, 5 5 Fitted Value Frequency 3 Histogram of the Residuals ,,5, -,5-3, Figure 8 Modèle quadratique de Count Residuals Versus the Order of the Data Observation Order 3 4 5

8 Statistique 3 ème année INSA-ICBE 8/9 Residual Plots for SqrtCount Normal Probability Plot of the Residuals Residuals Versus the Fitted Values Percent 99, , , 7,5, Fitted Value,5 5, Frequency 5 5 -,5 Histogram of the Residuals -,5 -,75,,75,5, Figure 9 : Modèle quadratique de SqrtCount - - Residuals Versus the Order of the Data Observation Order Summary for s A nderson-darling Normality Test A-Squared,3 P-Value,54 Mean -,44 StDev,5 V ariance,4 Skew ness,688 Kurtosis -,3954 N 5 -,5 -,5 -,75,,75,5,5 Minimum -,53 st Q uartile -,784 Median -,45 3rd Q uartile,654 Maximum, % C onfidence Interv al for Mean -,6,63 95% C onfidence Interv al for Median -,546,39 Mean 95% Confidence Intervals 95% C onfidence Interv al for StDev,94,333 Median -, -,,,, Figure : distribution des résidus

9 Statistique 3 ème année INSA-ICBE 9/9 Table 4 : Regression Analysis: SqrtCount versus Time; Temp;... SqrtCount = - 65, +,66 Time +,93 Temp + 4,9 Tryptone -,33 Time*Temp +,59 Time*Tryptone +,357 Temp*Tryptone -,334 Temp** - 6,8 Tryptone** Constant -65,76 5,87 -,55, Time,664,56,99, Temp,976,59,6, Tryptone 4,95 3,845 3,88, Time*Temp -,359,3 -,3, Time*Tryptone,594,353,5,6 Temp*Tryptone,3573,569,64,55 Temp** -,3343,3435-9,73, Tryptone** -6,76,548-3,99, S =,69 R-Sq = 85,3% R-Sq(adj) = 84,5% PRESS = 55,85 R-Sq(pred) = 83,49% Table 5: Regression Analysis: SqrtCount versus Time; Temp;... SqrtCount = - 65,7 +,63 Time +,93 Temp + 5,5 Tryptone -,33 Time*Temp +,357 Temp*Tryptone -,334 Temp** - 6,8 Tryptone** Constant -65,65 5,56 -,98, Time,6335,4695 3,47, Temp,976,53,65, Tryptone 5,479 3,675 4,, Time*Temp -,359,39 -,6, Temp*Tryptone,3573,5594,64,54 Temp** -,3343,346-9,75, Tryptone** -6,76,544-4,, S =,6585 R-Sq = 85,3% R-Sq(adj) = 84,6% PRESS = 5,867 R-Sq(pred) = 83,68% Table 6: Regression Analysis: SqrtCount versus Time; Temp;... SqrtCount = - 66,9 +,63 Time +,96 Temp + 6,7 Tryptone -,33 Time*Temp -,334 Temp** - 6,8 Tryptone** Constant -66,9 4,65-4,38, Time,6335,4685 3,5, Temp,9634,445,, Tryptone 6,73 3,3 5,39, Time*Temp -,359,36 -,8, Temp** -,3343,349-9,77, Tryptone** -6,76,54-4,, S =,633 R-Sq = 85,3% R-Sq(adj) = 84,7% PRESS = 5,36 R-Sq(pred) = 83,85%