INTERET DES MARQUEURS MOLECULAIRES DANS LE SUIVI DES LEUCEMIES AIGUES MYELOIDES A CARYOTYPE NORMAL

Transcription

1 INTERET DES MARQUEURS MOLECULAIRES DANS LE SUIVI DES LEUCEMIES AIGUES MYELOIDES A CARYOTYPE NORMAL Delphine LEBON, DES Hématologie Clinique CHU Amiens Congrès de la SFH, 2012 Société Française d Hématologie Association des internes d hématologie

2 PLAN Introduction Les différents marqueurs moléculaires utilisés dans le suivi Mutation NPM1 Expression du gène WT1 FLT3-ITD Nouveaux marqueurs Discussion et perspectives Conclusion

3 INTRODUCTION Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) constituent un groupe hétérogène d hémopathies malignes : clinique, cytogénétique, moléculaire 40 50% des patients présentent un caryotype normal au diagnostic (LAM CN) Marqueurs moléculaires nombreux : Impact pronostique au diagnostic (transcrits de fusion) Impact dans le suivi (maladie résiduelle) Mutation de gène Hyperexpression de gène

4 Fréquence des mutations dans les LAM CN % D après A. Renneville

5 Concept de maladie résiduelle (MRD) Définition MRD : persistance de cellules tumorales dans l organisme en nombre inférieur au seuil de détection des techniques conventionnelles (cytologie et cytogénétique) = 1-5% Nb de blastes Clinique Cytologie MRD RCH Chimiothérapie Temps

6 Sensibilité des différentes techniques Cytologie Caryotype FISH 10-4 CMF RQ-PCR RQ-PCR = seule technique utilisée en routine dans la quantification de la MRD dans les LAM

7 Applications possibles de la MRD dans les LAM CN Mesure de la réponse précoce / évaluation de la chimiorésistance stratification thérapeutique? Evaluation en fin de consolidation envisager un traitement d entretien? Détection précoce des rechutes envisager une allogreffe? Suivi post-allogreffe moduler l immunosuppression, envisager DLI?

8 Critères de choix d un marqueur de MRD Principaux critères : - Technique de quantification du marqueur la plus SENSIBLE possible - Marqueur le plus SPECIFIQUE possible des cellules malignes Autres considérations : - STABILITE du marqueur à la rechute - APPLICABILITE au plus grand nombre de patients possible - FAISABILITE technique en pratique de routine - COUT acceptable

9 PLAN Introduction Les différents marqueurs moléculaires utilisés dans le suivi Mutation NPM1 Expression du gène WT1 FLT3-ITD Nouveaux marqueurs Discussion et perspectives Conclusion

10 MUTATION DE NPM1 Gène NPM1 en 5q35, code pour 3 isoformes Nombreuses fonctions Mutation découverte en 2005 dans les LAM Mutation NPM1 = 25 30% des LAM 45 60% dans les LAM CN > 40 types de mutations décrits 3 mutations plus fréquentes (A, B, D) = 95% cas Falini, NEJM, 2005 Falini, Blood, 2007 Krönke, JCO, 2011

11 Intérêt pronostique de la MRD NPM1 Après induction Fin de traitement 245 patients LAM avec NPM1 muté 83% LAM CN Age médian 49 ans Etude sur sang et moelle Seuil MRD Krönke, JCO, 2011

12 Intérêt pronostique de la MRD NPM1 Fin de traitement Krönke, JCO, 2011

13 En analyse multivariée Krönke, JCO, 2011

14 MRD NPM1 et détection précoce des rechutes Pour au moins 1 prélèvement Copies/10 4 copies ABL n = 36 Krönke, JCO, 2011

15 MRD NPM1 et détection précoce des rechutes 184 patients NPM1 mutés 1661 échantillons Sang et moelle RQ PCR sur cdna Détection des 3 mutants plus communs (A, B, D) 18 non répondeurs moléculaires = pas de rémission complète (RC) durable 28 rechutes avec suivi moléculaire suffisant : rechute moléculaire précédant de 66 jours la rechute clinique 1 rechute parmi les 121 patients en RC moléculaire Thiede, EHA,2011

16 Après allogreffe : intérêt pronostique de la MRD NPM1 252 patients LAM avec NPM1 muté (17 mutations) 1227 échantillons 83% LAM CN Age médian 58,9 ans Etude sur moelle RQ PCR sur cdna ; seuil MRD EFS après allogreffe n= 53 (25 en RC1) % NPM/ABL Schnittger, Blood, 2009

17 Après allogreffe : MRD NPM1 et détection précoce des rechutes Etude rétrospective 137 patients LAM dont 13 NPM1 muté (mutation A) Etude sur sang et moelle avant et après allogreffe RQ PCR sur ADN génomique Seuil MRD allogreffes : - 10/14 : PCR négative dont 4 rémissions prolongées - 4/14 : PCR positive après allogreffe = 4 rechutes - 9/14 rechutes : ascension de la MRD NPM1 précédant rechute cytologique (24 jours) et baisse du chimérisme (15 jours) Bacher, Experimental Hematology, 2009

18 PLAN Introduction Les différents marqueurs moléculaires utilisés dans le suivi Mutation NPM1 Expression du gène WT1 FLT3-ITD Nouveaux marqueurs Discussion et perspectives Conclusion

19 EXPRESSION DE WT1 Gène WT1 en 11p13 Cloné en 1990 Code pour une protéine WT1 impliquée dans la régulation transcriptionnelle de gènes de la croissance cellulaire, du métabolisme (composants de la matrice extracellulaire, facteurs de croissance ) Mutation retrouvée dans 10 15% des LAM (hotspot exons 7 et 9) Surexpression dans 70-90% des LAM Quantification de l expression du gène par RQ-PCR sur c-dna Système de RQ-PCR (2 amorces et sonde Taqman) Mutations Gaidzik, Blood, 2009 Cilloni, JCO, 2009 Renneville, Cancer, 2009

20 Méthode standardisée d évaluation de l expression de WT1 Contrairement à ce qui est observé avec les autres marqueurs de MRD dans les LAM : le sang est plus informatif que la moelle D après Cilloni, JCO, 2009 et A.Renneville

21 Intérêt pronostique de la MRD WT1 Etude rétrospective 91 patients avec WT1 hyperexprimé Etude sur sang et/ou moelle Avant traitement et après induction Seuil 2 log Cilloni, JCO, 2009

22 PLAN Introduction Les différents marqueurs moléculaires utilisés dans le suivi Mutation NPM1 Expression du gène WT1 FLT3-ITD Nouveaux marqueurs Discussion et perspectives Conclusion

23 FLT3 ITD Gène FMS-Like Tyrosine Kinase 3 en 13q12 Code pour un récepteur membranaire tyrosine kinase appartenant à la famille des récepteurs à tyrosine kinase (sous-groupe 3) exprimé par les progéniteurs myéloïdes et lymphoïdes. Rôle dans la prolifération, la différenciation et la survie des cellules souches multipotentes Mutation FLT3-ITD = 25 30% des LAM CN Evaluation par RQ PCR sur ADN génomique Schnittger, Blood, 2002 Abdelhamid, Leukemia Research, 2011

24 Intérêt pronostique de la MRD FLT3-ITD Etude rétrospective 20 patients LAM avec FLT3-ITD 94% LAM CN 116 échantillons au diagnostic et pendant le suivi Etude sur sang et/ou moelle (seuil 10-4 ) Abdelhamid, Leukemia Research, 2011

25 Intérêt de la MRD FLT3-ITD précoce Survie globale Survie globale 55 patients LAM avec 493 échantillons 44 patients : cytogénétique intermédiaire MRD après induction et post-consolidation n 1 Seuil 3 log Chou, Annals of Oncology, 2011

26 Difficultés et limites de la MRD FLT3-ITD - Ratio ITD/WT suffisamment élevé - Problème des clones multiples - Nécessité d utiliser des amorces patient-spécifiques - Duplication instable avec variation de la taille et de la séquence au cours de l évolution - Perte complète de l ITD au cours de l évolution Intérêt en MRD précoce?

27 Synthèse Applicabilité Sensibilité Spécificité/LAM Stabilité à la rechute Difficulté technique NPM1 50 % 10-4 à 10-6 oui % ** WT1 80 % 10-3 NON > 95 % * FLT3-ITD 25 % 10-4 oui %? ***

28 PLAN Introduction Les différents marqueurs moléculaires utilisés dans le suivi Mutation NPM1 Expression du gène WT1 FLT3-ITD Nouveaux marqueurs Discussion et perspectives Conclusion

29 IDH1 et IDH2 Gène IDH1 situé en 2q33.3 Gène IDH2 en 15q26.1 Mutation IDH1 = 10% des LAM CN avec 50% de mutation R132C Mutation IDH2 = 13 14% des LAM CN avec mutations en R172K et R140Q Perte de la capacité de la protéine de convertir l isocitrate en α-kétoglutarate et production de 2 hydroxyglutarate Evaluation par RQ PCR sur cdna Narahara, Hum Genet, 1985 Mardis, NEJM, 2009 Yan, NEJM, 2009 Ward, Cancer Cell, 2010

30 Mutation IDH persistante en rémission 46 patients diagnostic, RC, rechute 19 patients IDH1 R132 : 114 échantillons 18 patients IDH2 R140 : 114 échantillons 9 patients IDH2 R172 : 72 échantillons Chou, Leukemia, 2011

31 Mutation IDH persistante en rémission Chou, Leukemia, 2011

32 DNMT3A Gène sur le chromosome 2 Code pour une DNA Méthyl Transférase responsable de la méthylation de novo ( DNMT1) Mutation DNMT3A = 40% des LAM (mutation hotspot en arginine 882) Ley, NEJM, 2010

33 Stabilité de la mutation DNMT3A en rémission 500 patients LAM Mutations DNMT3A = 23% LAM CN Analyse séquentielle de la stabilité de DNMT3A (RQ-PCR sur c-dna) sur 138 patients (316 échantillons) : 35 mutés versus 103 non mutés 29/34 RC perdent la mutation en rémission mais 5/34 la gardent et rechutent dans un délai médian de 3.5 mois (persistance de cellules leucémiques) Mutation initiale retrouvée pour 12/13 rechutes Perte de la mutation initiale pour 1/13 Pas d acquisition de la mutation à la rechute pour les 103 patients non mutés (évolution cytogénétique dans 39% des cas) Hou, Blood, 2011

34 PLAN Introduction Les différents marqueurs moléculaires utilisés dans le suivi Mutation NPM1 Expression du gène WT1 FLT3-ITD Nouveaux marqueurs Discussion et perspectives Conclusion

35 DISCUSSION - PERSPECTIVES Marqueurs moléculaires de plus en plus nombreux Questions actuelles : - Quel marqueur? Combinaison de marqueurs (exemple : NPM1, IDH1 et DNMT3A)? - Quelle technique? - Quel seuil décisionnel? - Quels échantillons (sang ou moelle)? - A quels stades du traitement? Conséquences : - Que faire d une MRD positive avec rémission cytologique? - Que faire devant un patient FLT3-ITD au diagnostic qui négative sa MRD (allogreffe?)? - Quid d un patient en RC qui positive sa MRD (thérapies précoces? wait and see?)?

36 Traitement préemptif selon MRD Etude 10 patients avec LAM CN et mutation NPM1 en RC1 ou RC2 MRD NPM1 positive Traitement préemptif par 5 AZA (75mg/m²/j SC J1-7/28j) Suivi médian = 10 mois 7 réponses moléculaires (réduction 1 Log par rapport au taux avant traitement) dont 4 réponses prolongées Sockel, Haematologica, 2011

37 PLAN Introduction Les différents marqueurs moléculaires utilisés dans le suivi Mutation NPM1 Expression du gène WT1 FLT3-ITD Nouveaux marqueurs Discussion et perspectives Conclusion

38 CONCLUSION Investigations en cours Marqueurs : NPM : marqueur moléculaire de suivi des LAM CN le plus prometteur Les autres marqueurs restent à évaluer par des études prospectives Stabilité de certains marqueurs : sous-clonalité des LAM et niveau d atteinte leucémique? Techniques : RQ-PCR A l avenir : séquençage haut-débit Recherches ciblées sur la ou les mutation(s) identifiée(s) au diagnostic Combinaison de marqueurs Limite de détection beaucoup plus basse Autre approche de suivi des LAM CN : la cytométrie de flux Conséquences thérapeutiques