Cours de Microbiologie Générale LV342 Cours 5 Chimiothérapie anti-bactérienne

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1 Cours de Microbiologie Générale LV342 Cours 5 Chimiothérapie anti-bactérienne Catherine Esnault, Maître de Conférences Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) UFR 927 Sciences de la Vie Licence de Sciences et Technologie Mention Sciences de la Vie L3 1

2 Introduction et Historique : toxicité sélective Paul Ehrlich ( ) - colorants (Rouge Trypan) colore fortement les protozoaires infectant des cellules eucaryotes alors que les cellules ont peu d affinité pour le colorant. - découverte d un composé à pouvoir trypanocide : la suramine, actif sur le trypanosome, agent de la maladie du sommeil. 2

3 Jacques et Thérèse Tréfouël 1937 : concept de prodrogue O H 2 N S N N NH 2 O Prontosil H 2 N O R HN S NH 2 O Sulfamides formule générale 3

4 Recherche de produits d origine naturelle à partir de micro-organismes 1896 Ernest Duchene. Antagonisme entre les moisissures et les microbes Résultat étrange d Alexander FLEMING. Le premier antibiogramme.pénicillum notatum contre Staphylocoques 1939 Howard FLOREY et Ernst CHAIN : purification de la pénicilline 1944 Selman WAKSMAN et beaucoup d autres : test de souches de bactéries du sol, les Streptomyces. Découverte de la streptomycine En parallèle, modification chimique de molécules d origine naturelle 4

5 Introduction des antibiotiques en clinique au cours du 20eme siècle C. Walsh, Antibiotics, 2003 Molécules d origine naturelle : b-lactams, tetracyclines, aminoglycosides Molécules d origine synthétique : sulfamides, quinolones Molécules conçues selon le concept de drug design: actuellement 5

6 Les classes d antibiotiques C. Walsh, Antibiotics,

7 Effets bactéricide, bactériostatique C. Walsh, Antibiotics,

8 Mesure de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) CMI 0 Concentrations croissantes de l agent inhibiteur Nombre de bactéries CMI [inhibiteur] 8

9 La Concentration Minimale Bactéricide (CMB) C est la plus petite concentration d'antibiotique laissant 0,01% ou moins de survivants de l'inoculum initial après 18 heures de culture à 37 C. Le temps requis pour la lecture peut varier comme pour les CMI en fonction des souches. 9

10 Antibiogramme standard : méthode des disques sur gélose Un milieu solide est ensemencé avec la bactérie à tester des disques en papier imprégnés chacun d'un antibiotique déposés stérilement. La bactérie ne se développe que là où la concentration de l'antibiotique est inférieure à la CMI 10

11 Index thérapeutique (IT) IT = dose minimum induisant des effets secondaires dose induisant un effet thérapeutique On recherche les médicaments dont l index thérapeutique est le plus élevé possible. 11

12 Les cibles des antibiotiques C. Walsh, Antibiotics,

13 Le peptidoglycane : des chaines de N-acétyl glucosamine N-acétyl muramique reliées par des liaisons peptidiques 13

14 Antibiotiques qui inhibent la synthèse de la paroi bactérienne Pénicillines et vancomycine inhibent la transpeptidase (6) qui permet de lier les oligopeptides des chaînes voisines de peptidoglycane. Réaction essentielle à la réticulation du peptidoglycane et à la rigidité de la paroi. C. Walsh, Antibiotics,

15 Mécanisme d action des antibiotiques de type b-lactame 15

16 Biosynthèse du peptidoglycane N-acétylglucosamine acide N-acétylmuramique substitué N-acétylglucosamine O HO acide N-acétylmuramique substitué HOH H HOH O O H O HO O H NH O O H COH H NH HC H COCH H CH 3 3 CO CH 3 NH L-Ala CH CH 3 CO D-Glu meso-a2pm D-Ala D-Ala H 3 C H 3 C NH HC COOH CH 2 CH 2 CO NH (L) CHC H 2 CO NH CH CO NH CH COOH H 2 C H 2 COOH CCH NH 2 HOH H H H O L-Ala D-Glu NH CO H CH 3 meso-a2pm D-Ala D-Ala H 3 C H 3 C HOH O O H HC H CO CH 3 NH CH CH 3 CO H O NH HC COOH CH 2 CH 2 CO NH (L) CHC H 2 CO NH CH CO NH CH COOH H 2 C O NH COCH H 3 H 2 COOH CCH NH 2 Transpeptidase C. Walsh, Antibiotics, 2003 H+ 16

17 Inhibition de la trans peptidase par le b - lactame C. Walsh, Antibiotics,

18 Différences entre vancomycine et b-lactame Vancomycine : molécule de grosse taille, inhibe la réaction de transpeptidation en se fixant par liaisons faibles sur l aa terminal de l oligopeptide. Ne peut pas accéder au peptidoglycane des bactéries Gram- C. Walsh, Antibiotics, 2003 b-lactame : inhibe l enzyme. Molécule de petite taille, peut accéder au peptidoglycane des Gram+ et Gram- 18

19 Antibiotiques impliqués dans la transcription et la réplication de l ADN bactérien Inhibition spécifique de la RNA-polymérase : la rifampicine. Trop toxique en clinique inhibiteurs de la DNA gyrase, une ADN-topoisomérase : fluoroquinolones (ciprofloxacine), coumarines et novobiocine. Quinolones d origine synthétique, largement utilisées en clinique. C. Walsh, Antibiotics,

20 Modification de la topologie de l ADN Pourquoi les 2 brins de la double hélice sont coupés : - Les 2 brins de la double hélice sont coupés : une brèche est créée. - Une autre partie de la double hélice passe à travers la brèche - La brèche est refermée. - Un super tour est ainsi créé Les réactions catalysées par la topoisomérase II -Relaxation et super enroulement - Nouage et dénouage - Caténation et décaténation 20

21 Formation d ADN caténé lors de la réplication Les 2 fourches de réplication se rencontrent Les molécules filles sont enchevêtrées A la fin de la réplication, les molécules filles sont caténées 21

22 Création de super-enroulement négatif et positif lors de la transcription de l ADN La RNA-polymérase (RNAP) se déplace et transcrit un ADN en ARN. Dans la bactérie, la traduction est couplée à la transcription. Un domaine topologique de l ADN est symbolisé par les barres verticales. Lors du déplacement de la RNAP, la double hélice se tord et engendre un super-enroulement positif (SE +) devant l enzyme. Derrière la RNAP, la double hélice est détordue et génère un super-enroulement négatif (SE-). La DNA-gyrase élimine le (SE+) La topoisomérase I élimine le (SE-) 22

23 TOPOISOMERASE II Bactérienne : DNA gyrase. Protéine tétramérique A2B2 Gène gyr A : sous unité A, 875 aa, responsable de la coupure/religature des brins de l ADN, contient la tyrosine du site actif. Coupure des 2 brins car 2 sites de coupure, contient le site d interaction avec les antibiotiques quinolones Gène gyr B : sous unité B, 804 aa, porte le site de fixation de ATP et le site d interaction avec les coumarines A 1 Site coupure/religature : 875 tyrosine en 122 Eucaryote : protéine dimérique A2, 2 sous unités de 1429 aa. Coupure des 2 brins car 2 sites de coupure. Le gène topoii contient les 2 domaines A et B. Pas de site de fixation aux antibiotiques. B 1 Site d interaction 804 avec ATP A Site d interaction Site coupure/religature : avec ATP tyrosine 23

24 Inhibiteurs du métabolisme des folates Le THF est un donneur de groupe méthyle indispensable à synthèse de la thymidine et donc de l ADN Biosynthèse du THF. La première étape est la synthèse du dihydroptéroate à partir du GTP et de l'acide para-aminobenzoique. Cette étape peut être inhibée par un sulfamide. C. Walsh, Antibiotics,

25 Mécanisme d'action d'un sulfamide. Le sulfamide est un analogue structural du substrat, le PABA. Le produit formé GTP-sulfamide est un complexe non reconnu par l'enzyme de la voie de biosynthèse du DHF. C. Walsh, Antibiotics,

26 La résistance bactérienne aux antibiotiques Ampleur du problème sanitaire Antibiotique Année de développement Année d'apparition de la thérapeutique résistance Sulfamides années 30 années 40 Penicillines Streptomycine Chhloramphénicol Tétracycline Erythromycine Vancomycine Methicilline Ampicilline Céphalosporines début des années 60 fin des années 60 26

27 Mécanismes de résistance aux antibiotiques 1 imperméabilité, efflux 2 inactivation de l antibiotique 3 modification ou substitution de la cible Antibiotique 1 2 Cible 3 27

28 Modification de la cible Diminution de l'affinité de l'érythromycine pour sa cible, l'adénine L'Adénine 2058 de l'arn 23S de la sous unité 50S du ribosome bactérien est méthylée par la méthyltransférase porté par le gène Erm. Erm, gène présent dans le génome de l'organisme producteur. SAM : S-adénosyl méthionine, SAH : S-adénosylhomocystéine. C. Walsh, Antibiotics,

29 Production d une forme inactive, efflux, sécrétion d une forme active à l extérieur Le précurseur actif est glycosylé par OleI R1 : monomère de N-acetyl glucosamine. R2 : dimère de N-acetyl glucosamine-glucose. Le donneur de glucose est l UDP-glucose Efflux vers le périplasme. Gène OleB OleR est une glycosidase. OleR et OleI, Ole B: génes présents sur le chromosome de la bactérie 29

30 30

31 Analogie entre les mécanismes de résistance des bactéries productrices et des bactéries pathogènes C. Walsh, Antibiotics,

32 Résistance par modification de l'antibiotique par une b-lactamase pour les b-lactames L acide clavulanique est inhibiteur de la b- lactamase (associé à l amoxicilline dans l augmentin) par des enzymes de modification des aminoglycosides C. Walsh, Antibiotics,

33 Exemple de résultat d antibiogramme d une bactérie prélevée chez un patient hospitalisé. Germe : Staphylococcus aureus Antibiotique Antibiogramme en solide Liquide Résultat interprété Cible de l antibiotique Diamètre mesuré (mm) Seuil Diamètre (mm) CMI (µg/ml) Seuil CMI (µg/ml) OXACILLINE >2 2-2 Résistant Peptidoglycane TOBRAMYCINE Résistant Ribosome GENTAMICINE > Résistant Ribosome AMIKACINE > Résistant Ribosome ERYTHOMYCINE > Résistant Ribosome PRISTINAMYCINE <0, Sensible Ribosome TRIMETHOPRIME <0, Sensible Folates + SULFAMIDES OFLOXACINE > Résistant DNA gyrase RIFAMPICINE > Résistant RNA polymérase ACIDE FUSIDIQUE > Intermédiaire Ribosome FOSFOMYCINE < Sensible Peptidoglycane VANCOMYCINE < Sensible Peptidoglycane TEICOPLANINE < Sensible Peptidoglycane Conclusions : Bactérie résistante aux b-lactamines : phénotype Methicilline Resistant Staphylococcus Aureus : MRSA Bactérie résistante aux aminosides : phénotype résistant Kanamycine Tobramycine Gentamycine : KTG 33

34 Streptomyces -Bactéries du sol, Gram-plus, filamenteuses. -Génome linéaire, haut pourcentage en G+C -Cycle de vie complexe. 34

35 Production de métabolites secondaires colorés par différents Streptomyces. Les antibiotiques sont des métabolites secondaires synthétisés par des bactéries à différentes étapes de la croissance, mais généralement en état de stress, carence en C ou P ou N. Observation de colonies de différentes espèces produisant des métabolites secondaires colorés. En (b) : Streptomyces coelicolor et production d actinorhodine. Organisme modèle des Streptomyces. 35

36 Biosynthèse des antibiotiques peptidiques non ribosomiques Exemple de la pénicilline Utilisation d acides aminés conventionnels et non conventionnels Double cyclisation de l'acv pour obtenir le noyau b-lactame de l'isopenicilline N C. Walsh, Antibiotics,

37 Système général de régulation chez les bactéries : système à 2 composants S et R Le domaine extra cytoplasmique est un senseur de l environnement : concentration en nutriments, densité cellulaire (quorum sensing) La transmission du signal par le domaine transmembranaire au domaine cytoplasmique provoque une auto phosphorylation des histidines avec des molécules d ATP. Le régulateur sous une forme non phosphorylée n a pas d affinité pour l ADN. Le régulateur est phosphorylé par transfert du phosphate du senseur vers le régulateur. Sous forme phosphorylée, le régulateur acquiert une affinité pour l ADN, en particulier pour la région promotrice d un gène. Cette fixation empêche la fixation de la RNA-polymérase et inhibe l expression de ce gène. 37

38 Biosynthèse des antibiotiques en relation avec le développement du mycélium bactérien et la disponibilité des sources nutritionnelles 38