OPTIMISATION DE LA PRODUCTION DE L HORMONE DE CROISSANCE HUMAINE CHEZ E.COLI

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1 CONFERE 17 6 ET 7 JUILLET 2017, SEVILLE, ESPAGNE. OPTIMISATION DE LA PRODUCTION DE L HORMONE DE CROISSANCE HUMAINE CHEZ E.COLI Amina BEN ABLA 1, Guilhem BŒUF 1, Baligh MILADI 2, Hassib BOUALLAGUI 2, Ahmed ELMARJOU 3 & Abdellatif ELM SEMI 1 1 Laboratoire de biologie Moléculaire, Ecole de Biologie Industrielle, 49 Avenue des Genottes, Cergy, France 2 Laboratoire d Ecologie et de Technologie Microbienne, INSAT, Centre Urbain Nord BP 676, 1080 Tunis Cedex, Tunisia 3 Plateforme de production d anticorps et de protéines recombinantes, Institut Curie/CNRS UMR144, 26 rue d UIM, Paris Cedex 5, France Résumé : L hormone de croissance humaine (hgh ;human Growth Hormone), hormone polypeptidique composée d une chaine de 191 acides aminés et de 22kDa de poids moléculaire, est synthétisée et secrétée par les cellules somatotropes de l hypophyse antérieure. Cette hormone est utilisée comme protéine thérapeutique pour la déficience en hgh et de diverses maladies tel que le syndrome de Prader Willi et le syndrome de Turner. Différents systèmes de production de hgh sous forme recombinante ont été développés mais le système de production dans E.coli reste le plus avantageux en terme de cout et de rendement. Cependant une production efficace de hgh dans Escherichia coli (E. coli) s'est révélée difficile car l'hormone exprimée par E. coli a tendance à s'accumuler sous forme insoluble et inactive dans des corps d'inclusion, ce qui entraîne une faible solubilité. Dans la présente étude, nous avons mis en place un procédé de production de hgh sous forme soluble chez E.coli.Dans le but d atteindre des niveaux élevés de forme soluble d'hormone de croissance humaine recombinante (rhgh) nous avons mis en place la production de cette hormone en faisant variée différents paramètres : Souches, production de r-hgh en fusion avec un tag de solubilité et enfin l utilisation d agent chimique permettant l amélioration de la solubilité in bactério. Quatre variétés de E.coli : BL21 PlysS, BL21 prare, BL21 DsbC, et KRX ont été testées avec et sans tags de solubilité (SUMO :Small Ubiquitin-like Modifier)et d agent solubilisant.le procédé de production a été optimisé en faisant varié la température et la concentration d inducteur (IPTG).Les résultats montrent que ces paramètres influencent significativement sur le taux de r-hgh soluble produite. En utilisant cette stratégie, nous avons réussi à déterminer la meilleure souche productrice ainsi que les meilleures conditions de culture pour la production r-hgh avec un taux de solubilité de l ordre de 73%. Mots clés : hgh, protéine recombinante, E. Coli, cassette EBI 1. INTRODUCTION L Hormone de croissance humaine (hgh), aussi appelée somatotrophine ou somatropine, est une hormone peptidique qui stimule la croissance, la reproduction cellulaire et la régénération chez les humains. Cette hormone est constituée de 191 acides aminés et elle est synthétisée et sécrétée par des cellules somatotropes dans les ailes latérales de l'hypophyse antérieure. Son rôle principal est de favoriser et stimuler la croissance chez les enfants. Ses fonctions secondaires sont nombreuses et

2 complexes. L hgh est un facteur de croissance pour les os et les muscles, un facteur de différenciation et un régulateur métabolique pour le foie et le tissu adipeux. Cette hormone est nécessaire pour une croissance normale chez les enfants mais aussi pour la régulation métabolique et la réparation des tissus et des cellules usées chez les adultes. Elle est connue pour être l'hormone endocrine plus abondante produite par la glande pituitaire et sécrétée à un taux qui atteint un maximum au cours du développement. L altération de la production de hgh se traduit généralement par l apparition de différentes maladies : nanisme (en cas de déficit de sécrétion) et gigantisme, acromégalie (en cas d'excès de sécrétion). D autre maladies sont associées à cette altération tel que le syndrome de Prader Willi et le syndrome de Turner. Ces pathologies peuvent être traitées très efficacement par l'administration régulière de hgh. Avant les années 1985, cette hormone a été extraite à partir de l hypophyse prélevée à partir de cadavre humain. Le traitement par l hormone extraite par ce procédé s est traduit par l apparition de maladie mortelle à prion (Creutzfeldt-Jakob :58 % de tous les cas mondiaux). En France (2009), le bilan occasionné par ce type de contamination s'élevait à 117 décès, essentiellement chez des enfants. En plus de ce problème de contamination des lots extraits, le rendement d extraction par ce procédé est très faible et couteux (une hypophyse prélevée sur cadavre ne délivre en moyenne que 5 mg d'hgh) [1]. En 1979, la firme Genentech a réussi pour la premier fois le clonage et l expression du cdna de l hormone de croissance humaine dans une souche industrielle non pathogène d Escherichia coli et fut ainsi l une des premières protéines recombinantes thérapeutique à avoir reçu l AMM (autorisation de la mise sur le marché). Les méthodes de biologie moléculaire actuelles permettent de programmer les génomes des cellules et des organismes par insertion d un gène d intérêt en vue de faire exprimer par la cellule ou l organisme hôte la protéine correspondante d intérêt. Ces organismes permettent ainsi de produire fidèlement tous types de protéines, en grande quantité, avec des rendements importants et dépourvues de toute contamination. Différents systèmes de production de l hormone de croissance humaine recombinante (r-hgh) ont été développés en industrie pharmaceutique, chez de nombreux organismes : Escherichia Coli (e.coli)[2], Pichia pastoris [3], Lactococcus lactis [4], Bacillus subtilis[5], cellule de riz transgénique [6], cellules de tabac [7] et CHO [8]. Le système bactérien et en particulier E. coli restent le plus avantageux par la connaissance approfondie de son génétique et ses différentes voies métaboliques,sa croissance rapide et son coût de culture relativement faible[9] [10]. Le séquençage complet du génome de différentes souches ainsi que le développement de nombreux outils moléculaires pour induire une forte expression des gènes recombinants ont permis l optimisation de différentes souches de production. Cependant la production trop importante de protéines recombinante chez E.coli peut entrainer la dégradation et/ou l agrégation des protéines qui s accumulent alors sous forme d agrégats massifs de protéines mal repliées et en général inactives. Ces agrégats sont appelés corps d inclusion. Ils sont la cause de rendements de production faibles voire une absence de protéines solubles ce qui empêche toute purification des protéines d intérêt sous forme native [11]. De plus l accumulation de corps d inclusion entraine un ralentissement de la croissance bactérienne et à terme conduit à la mort cellulaire. Afin de pallier aux problèmes et limites préalablement discutés, notre objectif est de mettre en place un procédé de production de l r-hgh sous forme soluble dans E.coli afin d obtenir cette protéine sous forme active, identique à la forme native, avec un degré de pureté élevé et une quantité suffisante aux applications envisagées. Au cours de ce travail, nous avons utilisé un multitags, développé dans notre laboratoire (cassette EBI), en fusion avec r-hgh pour monitorer l expression de la protéine de fusion dans les différentes phases du procédé et accélérer ainsi l optimisation de la production et de la purification de cette protéine recombinante.

3 2. ETAT DE L ART ET OBJECTIF L hormone de croissance est une hormone polypeptidique secrétée par la partie antérieure de l hypophyse, située dans la selle turcique à la base du cerveau. Elle stimule la croissance et la reproduction cellulaire et humains et les autres vertébrés. Elle se compose d une chaine de 191 acides aminés et son poids moléculaire 22 kda avec deux ponts disulfures intramoléculaires [12]. La structure tridimensionnelle de l hormone de croissance humaine est simulable à deux spirales concentriques stabilisées par deux ponts disulfures entre la cystine en position 53, 165, 182 et 189 [13]. Elle est parmi les premières hormones hypophysaires dont la structure chimique a été identifié et aussi la première produite et commercialisée sous la forme recombinante [14]. 1.1.Historique A la fin du XIXe siècle, l hypophyse ou la glande pituitaire fut formellement mise en cause en 1886 dans la description d une pathologie causée par hypertrophie tumorale du lobe antérieur de l hypophyse (acromégalie) et une hypersécrétion de l hormone de croissance. Cette découverte est due à un neurologue à l hôpital de la Salpêtrière à Paris Pierre Marie ( ) [13]. En 1929, il y a eu lieu la première observation que la croissance pouvait être rétablie par administration d extrait de la glande hypophysaire chez un animal hypophysectomisé. A partir de cette date, la mise au point de technique de fractionnement d extraits protéiques et des tests biologiques sensibles a permis l obtention de l hormone de croissance bovine purifiée. En 1940, l usage combiné de techniques tinctoriales (fondées sur la différence d affinité des cellules vis-à-vis des colorants), histochimiques (basées sur l identification de la localisation des glycoprotéines), et l approche histophysiologiques avait permis à B.Romeis d établir la première nomenclature des types cellulaires de l antéhypophyse et les hormones qu ils produisent [14]. Grace aussi aux techniques immunologiques et cytoimmunologiques de mesure et de localisation de substance endogènes, mise au point dans les années soixante, ont permis l identification de l origine cellulaire de l hormone de croissance au sein du tissu glandulaire de l antéhypophyse [13]. L hormone de croissance humaine est alors localisée dans des cellules somatotropes colorées en orange par le tétrachrome de Herlant. 1.2.Production classique de hgh : La hgh a été utilisée comme protéine thérapeutique contre le déficit en hormone de croissance chez les enfants moins de 20 ans. Avant les années quatre-vingt, on ne pouvait obtenir la somatotropine qu à partir d hypophyse prélevée des cadavres humains. En 1985, il y a eu déclaration des cas atypiques de maladie de Creutzfeldt Jakob causé par l administration de cette hormone. Cette maladie est le résultat de contamination des lots par des prions lors de prélèvement. En outre, il existe d autres problèmes liés à de la préparation de cette protéine : risque d une contamination éventuelle par des virus (SIDA ), déclenchement des réponses immunitaires et les quantités des protéines préparées qui sont insuffisantes pour le traitement des différents cas du nanisme. Au cours de la même année, l organisation mondiale de la santé (OMS) a retiré du marché les produits correspondants [1]. 1.3.Procédés de production de l hormone de croissance humaine En 1979, la firme Genentech a réussi pour la premier fois le clonage et l expression du cdna de l hormone de croissance humaine dans une souche industrielle non pathogène d Escherichia coli et fut ainsi l une des premières protéines recombinantes thérapeutique à avoir reçu l AMM (autorisation de la mise sur le marché). Actuellement, différents systèmes microbiens et cellulaire sont utilisés pour

4 la production de r-hgh : E.coli BL21 [2], Pichia pastoris [3], Lactococcus lactis [4], Bacillus subtilis[5], cellule de riz transgénique [6], cellules de tabac [7] et CHO [8]. Escherichia coli se présente comme le système le plus utilisé pour la production à l échelle industrielle des protéines recombinantes [9] [10]. Cela est due à son faible coût de culture, sa rapidité de croissance cellulaire et la facilité de sa manipulation. 1.4.Problèmes rencontrés au cours de la production de l hormone de croissance humaine recombinante Le haut niveau d expression des protéines chez E. coli entraine souvent son agglomération sous forme de granules cytoplasmiques insolubles appelés corps d inclusion [11]. La formation de ces corps d inclusion est due à des interactions intermoléculaires bien spécifiques au niveau d un seul type de molécule protéique [15]. Il est généralement admis que les protéines hautement hydrophobes ont plus de tendance à s accumuler sous forme de corps d inclusion chez E. coli. Par ailleurs, Il n existe pas de corrélation directe entre la formation des corps d'inclusion d une certaine protéine et leurs propriétés intrinsèques comme le poids moléculaire, hydrophobicité et le repliement. D autre travaux ont montré que la surexpression et la concentration très élevée de la protéine recombinante d intérêt produite chez E. coli favorisent les réactions d agrégation aux dépens de la réaction productive vers l état actif de la protéine. 1.5.Stratégies de solubilisation de hgh : Les protéines produites sous forme des corps d inclusion sont dépourvues de toute activité biologique. Deux types de stratégies sont développées pour obtenir des protéines recombinantes soluble chez e.coli,soit en amont en diminuant la quantité de protéines produites dans la cellule, ou bien en aval par solubilisation corps d inclusion et le refolding : Solubilisation des corps d inclusion Les premières approches ont consisté à récupérer les protéines agrégées dans les corps d inclusion et de les ressolubiliser in vitro [16] en présence d agent dénaturant (l urée et gdivers détergents...) Et ensuite de les renaturer en baissant la concentration de cet agent dénaturant. Ces procédures de repliement sont longues, complexes, et impliquent de nombreuses dialyses successives ou procédés chromatographiques, et sans garantie de récupération d une protéine correctement repliée et active Prévention de la formation des corps d inclusion in vivo - Modifications des paramètres de culture Un des moyens le plus simple généralement utilisé pour tenter de diminuer la formation de corps d inclusion est de diminuer la température de culture de E. coli [17]. Cette méthode a été efficace pour de nombreuses protéines. La diminution de température permet une exposition moindre des régions hydrophobes des protéines qui participent à la formation des corps d inclusion, et également a pour conséquence une baisse de synthèse de protéines cellulaire qui participent à la formation des corps d inclusion. De plus, la baisse de température a pour effet un ralentissement du métabolisme cellulaire avec pour conséquence une production protéique moindre, ce qui en soit est un avantage pour un meilleur repliement des protéines produites. Cette approche basée sur une baisse de température de croissance pour les bactéries peut donner des résultats satisfaisants mais n est pas systématiquement la solution pour éviter la formation des corps d inclusion.

5 - Effet souches L utilisation intensive d E. coli pour la surproduction de protéines, a conduit à la sélection de souches spécifiques à ce type d utilisation comme les souches BL21pLysS(DE3) et KRK (DE3) qui ont montré de bons résultats bien que leurs mécanismes d actions ne soient pas connus. La stabilité des plasmides codant pour des protéines toxiques a même été améliorée chez ces deux souches [18]. Certaines souches commerciales de E. coli mutantes, comme la souche Origami (Novagen), ont été modifiées pour permettre un meilleur repliement des protéines et éviter la formation de corps d inclusion. Pour la souche Origami des mutations dans les gènes codant pour la thiorédoxine réductase trxb et glutathion réductase gor permettent une meilleure formation des ponts disulfures dans le cytoplasme et donc un meilleur repliement des protéines contenant des ponts disulfures. - Technologie des protéines de fusions Les protéines de fusion ont plusieurs avantages tels que l augmentation du taux d expression et de la solubilité de la protéine d intérêt en minimisant la formation des corps d inclusion. Toutefois, le grand avantage du développement de cet outil est qu il a permis d optimiser plusieurs tags qui sont utilisés à la fois dans le marquage, le contrôle de l expression et la purification de la protéine recombinante [19] L objectif de notre projet est le développement d un procédé de production de r-hgh sous forme soluble et active chez E.coli. Pour obtenir des niveaux élevés de forme soluble de cette protéine, nous avons étudié différents paramètres : Variation de souche : Différentes souches de E.coli ont été testé Tag de solubilité : utilisation de partenaire de fusion SUMO. Un agent chimique (AE1EBI) permettant la solubilisation in bactério. L étude a été réalisée par des plans d expériences. Dans chaque cas, l effet de la concentration de l inducteur Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside [IPTG] et la température de l induction, sur le taux de r-hgh soluble produite, ont été étudié. La figure ci-dessous résume la démarche expérimentale réalisée :

6 Afin d accélérer l optimisation de la production et la purification de la r-hgh, nous avons utilisé une cassette (fig.1), appelée multitags, développée dans notre laboratoire en fusion avec le r-hgh. Le multitags comporte à partir de son extrémité N-terminale : un double tag d affinité : 10-histidine, permettant une purification sur billes de Nickel, le Streptavidin-Binding Protein (SBP), pour faire la chromatographie sur colonne de streptavidin et le domaine de fixation de de l hème de cytochrome b5, permettant le monitoring de l expression de la protéine d intérêt au cours des différentes étapes de production. A la fin de la purification de notre protéine de fusion, le multitags est séparé de rhgh par le clivage au niveau du site TEV protéase. La cassette EBI permet ainsi de tracer l expression et la purification de la protéine recombinante et d améliorer leur solubilité et leur degré de pureté tout en maintenant des rendements de production élevés. Figure 1. Composition de la cassette d expression EBI

7 3. MATERIELS ET METHODES 3.1. MATÉRIELS MATERIEL BIOLOGIQUE Vecteur de production EBI On a utilisé le vecteur pet 15b pour l expression de la protéine de fusion (cassette multitagshormone de croissance humaine). Ce plasmide contient une origine de réplication E.coli et un gène de résistance à l ampicilline permettant la sélection de bactéries transformées. Il permet l expression de la protéine de fusion sous le contrôle du promoteur du bactériophage T7. Ce promoteur est activé par la T7 ARN polymérase dont le gène est situé au niveau de chromosome bactérien d E. coli. En amont du promoteur T7, on a l opérateur lactose responsable du catabolisme du lactose et permettant la fixation du répresseur de l opéron lactose. La représentation de ce vecteur est schématisée dans la figure : Figure 2. Carte de restriction du vecteur EBI Souches bactériennes de production E. coli KRX La souche E. coli KRX est utilisée comme une souche de production de l hgh fusionné à la cassette multitags. Elle contient un gène codant pour la T7 ARN polymérase, contrôlé par un promoteur inductible par le Rhamnose. La souche KRX permet d effectuer test de screening Blanc/bleu (35). D autre part, elle donne une expression pré-inductionelle plus faible que les autres souches d E. coli et une expression post-inductionelle plus élevé. E. coli BL21 plys Au cours de ce travail, on a utilisé aussi la souche E. coli BL21 (DE3) plyss comme une souche d expression la plus productrice de l hgh fusionné à la cassette multitags. Elle contienne le prophage λde3 contenant un gène de l'arn polymérase du bactériophage T7. Ce gène est contrôlé par le promoteur lacuv5 inductible par IPTG.

8 E. coli BL21 (DE3) plyss contienne le plasmide plyss contenant un gène de résistance au chloramphénicol permettant la sélection de bactéries transformées. Ce plasmide code aussi pour une protéine bi-fonctionnelle : le lysozyme. Cette dernière fixe l ARN polymérase et inhibe la transcription. En effet, la quantité de protéine produite sera plus faible, ce qui est intéressant pour l inhibition de la production des protéines toxiques pour la bactérie. BL21 DsbC Elle contient un vecteur d'expression contenant un poly nucléotide recombinant codant pour la DsbC (enzyme disulfure band) qui est une isomérase de liaison disulfure procaryotique ce qui permet le repliement des protéines dans une conformation active BL21 prare Elle contient un plasmide prare qui apporte sept codons d ARNt rares pour les bactéries (les codons AGA, AGG et CGA d arginine rare, le codon GGA de glycine, le codon d'isoleucine AUA, le codon de leucine CUA et le codon de proline CCC) afin améliorer les niveaux d'expression de nombreuses protéines recombinantes humaines dans E. coli MÉTHODES EXPRESSION DE r-hgh : Pré-cultures Les pré-cultures sont préparées dans des tubes de 50 ml en présence de 7.5 ml de milieu de culture LB additionnés d antibiotiques appropriés (Ampicilline 100 μg/ml pour les quatre souches à et 34 μg/ml chloramphénicol pour les souches BL21 plyss et prare).les différentes précultures sont incubées à 37 C sous 225 rpm d agitation toute la nuit dans un incubateur INFORS AG. Production de la protéine de fusion : cassette-hgh Après 16 h d incubation de la pré-culture, on mesure l absorbance à 600 nm afin de déterminer le volume d inoculation nécessaire pour réaliser une culture bactérienne de DO 600 nm égal à ml du milieu LB sont préparés dans un erlen de 250 ml. Les antibiotiques spécifiques et le volume d inoculum bactérien sont ensuite ajoutés (Ampicilline 100 μg/ml pour les quatre souches et 34 μg/ml chloramphénicol pour les souches BL21 plyss et prare). Enfin, la culture est incubée à la température désirée (37 C ou 25 C) sous agitation de 225 rpm. Le suivi de la cinétique de croissance est réalisé toutes les 30 minutes. Au début de la phase exponentielle de croissance (DO 600 nm de ), on induit la production de la cassette-hgh par l ajout de IPTG à la concentration désirée en présence de 2 mm acide aminolevulinique hydrochloride (précurseur d hème). Les cultures de KRX sont induites par 0.1% de Rhamnose en plus et les cultures de prare sont induit avec de l Arabinose 0.2%. Au cours des tests de solubilisation avec l agent chimique AE1EBI IN VIVO, on ajoute au moment d induction cet agent AE1EBI à différentes concentrations. La production dure 16 heures pour la culture à 25 C et 18 C et 6 heures pour la culture à 37 C.A la fin de l induction, on mesure l absorbance finale à 600 nm et on récupère les culots par centrifugation à 4000 rpm pendant 15 min (4 C). Les culots récupères sont lavés au PBS froid deux fois puis stockés à -80 C. Extraction par lyse enzymatique Les culots stockés à -80 C sont récupérés et décongelés dans la glace. On ajouter la solution de Lyse. 1/10ème du volume de la culture initiale. Les culots sont incubés 1h dans la glace, en

9 agitant toutes les 15min puis ils seront transférés dans des tubes eppendorf. Une centrifugation pendant 25min à 14000rpm, +4 C permet la séparation entre le culot (insoluble) et le surnageant (Soluble). Le surnageant est mis dans un tube à hémolyse identifié et l ensemble du culot et surnageant sont stockés dans la glace. PURIFICATION DE LA PROTEINE DE FUSION : Purification en batch sur bille de Nickel Le surnageant contenant la protéine recombinante est purifié en batch par chromatographie d affinité sur des billes de Nickel His-Select (Sigma). Après incubation une heure dans la glace, le mélange est lavé deux fois avec du PBS contenant 15 mm d imidazole. La protéine recombinante est éluée avec 250 mm d imidazole. Afin d éliminer l imidazole, les fractions contenant la cassette-hgh purifiée sont dialysées contre 10 mm Tris HCl ph 8.8 et 5% glycérol à 4 C. Purification sur colonne Strep-Tactin Les fractions contenant la protéine recombinante purifiée sur bille de Nickel sont regroupées et le pool est alors chargé sur une colonne Strep-Tactin (Novagen). Après incubation de la colonne pendant six minutes dans la glace, trois lavages sont effectués avec le tampon de lavage Strep- Tactin. Les protéines purifiées sont enfin éluées avec le tampon d élution Strep-Tactin. ANALYSES DE PROTEINE PRODUITE : Dosage BCA Le dosage de la quantité de protéines dans un échantillon est effectué avec un kit de dosage BCA de la Société PIERCE, avec des ajustements à leur protocole. La gamme étalon est préparée selon le tableau suivant : Tubes A B C D E F G H I Eau (µl) BSA (µl) 300 (sol. Stock) 375 (sol. Stock) 325 (sol. Stock) 175 (sol. B) 325 (sol. C) 325 (sol. E) 325 (sol. F) 100 (sol. G) 0 [BSA] finale (µg.ml) Un mélange de solutions A et B du kit est préparé en ajoutant 50 volumes de solution A à un volume de solution B. Avant le dosage, les échantillons sont préparés comme suit : 200µl du mélange A+B sont ajoutés à 20µl de l échantillon à doser ainsi qu aux échantillons de la gamme étalon. Une incubation de 30min à 37 C est réalisée dans l appareil FLUOstar Omega. A la fin de l incubation l appareil permet de mesurer la Densité Optique à 562nm pour l ensemble des échantillons. A partir des résultats fournis on trace la droite d étalonnage [A 562nm =fct([protéine]µg.ml)] afin de déterminer la concentration de l échantillon. Analyse des protéines par électrophorèse Les gels de polyacrylamide utilisés sont de 12% et de 1 mm d épaisseur, fournis par Invitrogen (NuPage Novex Bis-Tris Gels). Trente microlitres d échantillon à étudier sont préalablement dilués avec dix microlitres de tampon de charge contenant un détergent anionique (LDS) et un agent réducteur (β-mercaptoéthanol). Le LDS charge toutes les protéines négativement, tandis que le β-mercaptoéthanol permet de pallier la formation anarchique de

10 ponts disulfures lors de la dénaturation des protéines (100 C pendant 5 minutes). Le chauffage rompt les ponts disulfures, la protéine devient alors linéaire puis le LDS du tampon, confère à la protéine une conformation globulaire. Les protéines vont donc migrer en fonction de leur poids moléculaire et non en fonction de leur charge. Vingt cinq microlitres d échantillon dilué sont déposés dans chaque puits du gel et la migration s effectue pendant 90 minutes à 170 V. La chambre de migration des mini cuves (El9001-XCell II Novex MiniGel, Invitrogen) est remplie avec le tampon MOPS SDS. Le SDS conserve les protéines chargées négativement. Après migration, les gels sont colorés avec le bleu de coomassie pendant 3 heures sous agitation ou statique pendant la nuit. La décoloration est réalisée, sous agitation, pendant 2 heures. Quantification des protéines Les protéines sont quantifiées à partir des SDS-PAGE en utilisant un système de capture d image de type ImageCapture (GE), équipé d une caméra CCD permettant des applications d imagerie à faible luminosité. Les bandes relatives au marqueur de poids moléculaire sont utilisées pour établir une courbe étalon pour la quantification des protéines par le logiciel ImageQuant. PRODUCTION à L ECHELLE FERMENTEUR La mise à l'échelle de la production de r-hgh dans un fermenteur 4L a été effectuée en ajoutant le milieu LB dans le fermenteur, puis en l'autoclavant dans des conditions standard pour assurer la stérilité de la production. Après la stérilisation, le fermenteur est relié à un bio-contrôleur, à une pompe à ph, à un moteur à rotation, à une pompe à oxygène et à un bain d'eau. Le rotor fournit une agitation optimale du milieu par des turbulences pour assurer l homogénéisation du milieu ainsi la dispersion nécessaire des nutriments pour la bactérie. La production a été réalisée à 25 C pour la souche BL21 plys. La vitesse de l'agitateur a été augmentée à 1000 tr / min pendant les premières heures de culture, en maintenant un DOT supérieur à 20%. Le taux d'aération était de 1 VVM (volume d'air par volume de milieu par min). La concentration d'oxygène et ph sont constamment mesurée par des unités dans le fermenteur, en donnant des signaux au bio-contrôleur qui, en retour, augmente ou diminue automatiquement le facteur dans le milieu du fermenteur en fonction de ce qui est nécessaire pour les bactéries pendant cette phase de production. Le reste de la production de protéines a été réalisée comme dans le cas décrit précédemment dans «expression et production de protéines». Cependant, des changements ont été apportés quant à la façon dont les agents inducteurs ont été appliqués. Un port d'accès en caoutchouc ou l'intérieur du fermenteur sur le couvercle a été trempé dans l'éthanol et laissé 1 minute pour détruire les contaminants. Après la désinfection, l'éthanol a été brûlé, par allumage avec un briquet. Une fois que la flamme a cessé une seringue stérile et que l'aiguille a été utilisée pour injecter directement les agents dans le milieu. 4. RÉSULTATS Au cours de ce projet, nous nous sommes intéressés à la production de l hormone de croissance humaine, protéine à usage thérapeutique, sous forme soluble dans E.coli. Afin de pallier les problèmes de solubilité préalablement discutées, nous avons mis en place la production de cette hormone en faisant variée différents paramètres : Souches, production de hgh avec tags de

11 solubilité et enfin l utilisation d agent chimique permettant l amélioration de la solubilité in bactério. 4.1.Effet de souches : 4 variétés de E.coli : BL21 PlysS, BL21 RARE, BL21 DsbC, et KRX ont été testées. Des plans d expériences ont été réalisé pour chaque souche en faisant varié la Température et la concentration d inducteur IPTG à deux niveaux (haut et bas) dans le but d étudier l influence de ces paramètres sur taux de r-hgh soluble produite par chaque souche. Nous avons alors transformé ces différentes souches d E. coli avec le vecteur pet-15b recombinant la cassette-cdna hgh. Nous avons réalisé des cultures de chaque souche recombinante à l échelle erlen. La température d induction et la concentration d inducteur sont fixée selon l expérience (IPTG : niveau haut=1mm, Niveau bas=0.5mm / Température : niveau haut : 25 C, niveau bas 18 C).A la fin de l induction, comme le montre la figure 3, le culot bactérien (a) présente une coloration rouge. L apparition de cette couleur est due à la fixation de l hème sur le cytochrome b5 exprimé au niveau de la protéine de fusion. Ces résultats préliminaires nous confirment l expression de notre protéine multitags recombinante à un stade avancé au niveau des souches, avant de passer aux techniques d analyse classiques (SDS- PAGE, westrn Blot ). (b) Induit (a) Non Induit Figure 3.Suivi de la production de la cassette-hgh via la coloration du tag cytochrome b5 A la fin de la production, les bactéries induites sont collectées, lysées et les fractions solubles sont récupérées par centrifugation. La r-hgh produite est purifiée par chromatographie d affinité sur sur billes de Nickel ensuite quantifiée par dosage BCA. L analyse par SDS-PAGE des fractions solubles et insolubles des différents tests montre des bandes dans les fractions solubles relatives à l hgh-cassette EBI. Ces bandes s intensifient en diminuant la concentration de IPTG et la Température d induction (figure 4).

12 QUANTITÉ DE RHGH (MG) CMAT_r-hGH (45 kda) Figure 4. Analyse par SDS-PAGE de la solubilisation de la cassette-hgh pour la souche BL21 DsbC à 18 C : P : fraction purifiée, sg : surnageant, C : culot, NI : Non induit Au vu des résultats présentés et analysés ci-dessous, on constate que, pour les quatre souches, la quantité de r-hgh soluble augmente en diminuant la température et la concentration d inducteur (figure 5 et 6) Effet de la concentration de [IPTG] sur la solubilisation de r-hgh pour les quatre souches de E.coli [IPTG]=1mM [IPTG]=0.5mM 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 plyss 1 prare 2 DsbC 3 KRX 4 SOUCHES Figure 5.Effet de la [IPTG] sur la solubilisation de r-hgh pour les quatre souches de E.coli à 18 C

13 QHANTITÉ DE RHGH (MG) QUANTITÉ DE R-HGH (MG) Effet de la température d'induction sur la solubilisation de r-hgh pour les quatre souches de E.coli T=25 C T=18 C 2 1,5 1 0,5 0 plyss 1 prare 2 DsbC 3 KRX 4 SOUCHES Figure 6.Effet de la température d'induction sur la solubilisation de r-hgh pour les quatre souches de E.coli De plus les résultats montrent une variation de taux de r-hgh soluble produite en fonction de la souche et de la température d induction utilisée. L analyse des résultats de la figure 12 laisse apparaitre, le taux le plus élevé de r-hgh soluble dans la souche BL21 plyss à 25 C cependant à 18 C un meilleur taux est obtenu par la souche BL21 DsbC. D après ces résultats les meilleures conditions de production sont obtenues par la souche BL21 DsbC induite par 0.5mM d ITG à 18 C. 4.2.Tag de solubilité : Dans le but d améliorer la solubilité de l hormone de croissance humaine exprimée chez E. coli, on a fusionné le cdna de l hgh au niveau de la partie C terminale de celui d une protéine chaperonne impliquée dans l adressage des protéines vers l espace périplasmique SUMO [21]. Des études ont montré que le tag SUMO permet d améliorer le repliement et la solubilité des protéines recombinantes chez E.coli. Lorsque la protéine d intérêt est taguée par SUMO, sa solubilité est souvent renforcée par la délivrance du complexe protéique dans le périplasme ce qui facilite le folding des protéines et la formation des ponts disulfure. Effet de la tag de solubilté SUMO sur la solubilisation de r-hgh pour les quatre souches de E.coli cassette-hgh cassette-sumo-hgh 2,5 2 1,5 1 0,5 0 plyss 1 prare 2 DsbC 3 KRX 4 SOUCHES Figure 7.Effet de tag e solubilité SUMO sur la solubilisation de r-hgh pour les quatre souches de E.coli

14 Les résultats obtenus valident l effet solubilisant du tag SUMO et montrent une augmentation du taux de r-hgh produite sous forme soluble chez les quatre souches (figure 7). Un maximum de solubilité est obtenu par la souche BL21 prare induite par 0.5mM d IPTG à 18 C. 4.3.Agent solubilisant Dans le cadre de la production de l hormone de croissance humaine, la démarche suivie consiste à varier la température de production (18 C, 25 C, 37 C), la concentration de l AE1EBI (2mM, 6 mm, 10 mm) et suivre la production de la protéine recombinante sous forme soluble. L optimisation de la solubilisation in vitro de r-hgh par cet agent a montré un maximum de solubilisation de 70% à 25 C en présence de 10 Mm de AE1EBI [21]. CONCLUSION L utilisation de protéines recombinantes a considérablement augmenté ces dernières années en réponse à la rapide croissance des programmes de biologie structurale et de protéomique fonctionnelle. Parallèlement, le développement des biotechnologies au sein de l industrie pharmaceutique a largement augmenté les besoins en protéines à usage thérapeutique ou diagnostic. Ce projet traite la surproduction de protéines hétérologues, dans notre cas l hormone de croissance humaine, chez E. coli, les problèmes rencontrés ainsi que des stratégies traditionnellement mises en œuvre pour lutter contre ses problèmes. Dans la présente étude, la production de r-hgh a été optimisée par suivie en temps réel tout au long de processus. Les premiers résultats montrent que l approche décrite permet d obtenir un rendement élevé de production de r-hgh soluble avec un bon degré de pureté. Cela pourrait fournir des informations précieuses pour la production de r-hgh à l échelle industrielle. Références. [1] G. Gardner D., Shoback D., Greenspan's Basic and Clinical Endocrinology. New York : McGraw-Hill Medical, (2007), pp [2] Min-Ji Kim1,2., Hyun Soo Park1., Kyung Hye Seo1, Hyo-Jin Yang1,2, Sook- Kyung Kim1,2, Jun-Hyuk Choi1 Complete Solubilization and Purification of Recombinant Human Growth Hormone Produced in Escherichia coli PLoS ONE Public Library of Science (2013) [3] Pınar C alık,a,b Eda Bayraktar,a Bahar Inankur,a Elif S. Soyaslan,a Merve S ahin,a Hatice Tas pınar,b Eda Ac ık,a Remziye Yılmaz,b,c and Tunc erh. O zdamard Influence of ph on recombinant human growth hormone production by Pichia pastoris Chem Technol Biotechnol 2010; 85: [4] Abelardo Margolles,1, José Antonio Moreno,1, Lorena Ruiz,1 Belkis Marelli,2 Christian Magni,2 Clara G. de los Reyes-Gavilán,1 and Patricia Ruas-Madiedo1 Production of human growth hormone by Lactococcus lactis Journal of Bioscience and Bioengineering VOL. 109 No. 4, , 2010 [5] Burcu S ahin1 Sibel O ztu rk2 Pınar C alık1,2 Tunc er H. O zdamar3 Feeding strategy design for recombinant human growth hormone production by Bacillus subtilis Bioprocess Biosyst Eng (2015) 38: [6] Daniel Lipinski & Joanna Zeyland & Marlena Szalata & Andrzej Plawski &Malgorzata Jarmuz & Jacek Jura &Aleksandra Korcz & Zdzislaw Smorag &Marek Pienkowski & Ryszard Slomski Expression of human growth hormone in the milk of transgenic rabbits with transgene mapped to the telomere region of chromosome 7q J Appl Genetics (2012) 53: [7] Xu J1, Okada S, Tan L, Goodrum KJ, Kopchick JJ, Kieliszewski MJ Human growth hormone expressed in tobacco cells as an arabinogalactan-protein fusion glycoprotein has a prolonged serum life Transgenic Research October 2010, Volume 19, Issue 5, pp [8] Catzel D1, Lalevski H, Marquis CP, Gray PP, Van Dyk D, Mahler S Purification of recombinant human growth hormone from CHO cell culture supernatant by Gradiflow preparative electrophoresis technology Protein Expression and

15 Purification Volume 32, Issue 1, November 2003, Pages [9] Marzieh Savari, Sayyed Hamid Zarkesh Esfahani,, Masoud Edalati, Davoud Biria Optimizing conditions for production of high levels of soluble recombinant human growth hormone using Taguchi method Protein Expression and Purification 114 (2015) [10] Jin-Hee Leea,b,1, Ji-Seon Jeonga,b,1, Sook-Kyung Kima, Jimyeong Songa,b, Ji Youn Leea,Soyun Baeka,b, Jun-Hyuk Choia,b, Preparation of soluble isotopically labeled human growth hormoneproduced in Escherichia coli Journal of Chromatography B, 1035 (2016) [11] Jonathan T. Sockoloskya and Francis C. Szokaa Periplasmic production via the pet expression system of soluble, bioactive human growth hormone Protein Expr Purif February ; 87(2): [12] Lewis UJ., Singh RNP., Tutwilier GH., et al., Humain growth hormone: a complex of proteins, Ressent Prog Horm Res, (1980), pp [13] KORDON C., BLUET-PAJOT MT., L'hormone de croissance, Paris : Economica, ISBN [14] Romeis B. s.l.,in Handbouch der mikroskopischen Anatomie des Menschen, Berlin ed, 1940, Springer [15] 36. Speed, M. A., Wang, D. I., King, J., Specific aggregation of partially folded polypeptide chains: the molecular basis of inclusion body composition, Nat. Biotechnol, Vol. 14 (1996), pp [16] Vallejo LF, Rinas U Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact Sep 2;3(1):11 [17] M Mujacic et al old-inducible Cloning Vectors for Low-Temperature Protein Expression in Escherichia Coli: Application to the Production of a Toxic and Proteolytically Sensitive Fusion Protein Gene 238 (2), [18] L Dumon-Seignovert et al. The Toxicity of Recombinant Proteins in Escherichia Coli: A Comparison of Overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3) Protein Expr Purif 37 (1), [19] Sørensen HP1, Mortensen KK Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol Jan 26;115(2): [20] Vahideh Sadr a, Behnaz Saffar b,, Rahman Emamzadehc Functional expression and purification of recombinant Hepcidin25 production in Escherichia coli using SUMO fusion technology Gene 610 (2017) [21] Rim HEDHLI, tracage de la production de l hormone de croissance humaine chez BL21 plyss, rapport PFE,2010 Contact principal : BEN ABLA Amina EBI - Ecole de Biologie Industrielle, 49 Avenue des Genottes, Cergy, France, a.benabla@hubebi.com