PetrifilmMC. Plaques de numération des coliformes et des E. coli. Guide d interprétation

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1 3 Guide d interprétation Plaques de numération des coliformes et des E. coli MC Ce guide a été conçu pour vous familiariser avec l interprétation des résultats obtenus avec les plaques de numération des coliformes et des E. coli MC 3M MC. Pour obtenir de plus amples renseignements, contacter le représentant officiel des Produits de microbiologie de 3M de votre région. Les plaques de numération des coliformes et des E. coli contiennent un milieu de test de bile rouge violacé (BRV) fournissant une base nutritive, un agent gélifiant soluble dans l eau froide, un réactif à la glucuronidase et un indicateur qui facilite le dénombrement des colonies. La plupart des E. coli (environ 97 %) produisent de la beta-glucuronidase qui forme un précipité bleu au contact de la colonie. La pellicule supérieure emprisonne le gaz produit par les coliformes et les E. coli au cours de la fermentation du lactose. Environ 95 % des E. coli produisent du gaz que l on peut distinguer grâce aux colonies bleues ou rouge-bleu qui peuvent être associées à du gaz emprisonné sur la plaque de numération des coliformes et des E. coli (diamètre d environ une colonie). L AOAC INTERNATIONAL et le Bacteriological Analytical Manual (BAM) (Manuel d analyse bactériologique) de la FDA des États-Unis définissent les coliformes comme des bacilles gram-négatifs qui produisent de l acide et du gaz pendant la fermentation métabolique du lactose. Les colonies de coliformes en croissance sur les plaques de numération des coliformes et des E. coli produisent de l acide qui fait réagir l indicateur de ph et donne au gel une couleur rouge plus foncée; le gaz se trouvant sur le pourtour des colonies rouges confirme la présence de coliformes réels. Les méthodes d identification des E. coli peuvent varier d un pays à l autre (consulter l Aide-mémoire pour les durées et les températures d incubation) : Méthode homologuée par l AOAC INTERNATIONAL E. coli = 49 (colonies bleues avec gaz) Numération totale des coliformes = 87 (colonies rouges et bleues accompagnées de bulles de gaz) Ne pas utiliser cette plaque seule pour la détection de E. coli O57. Comme la plupart des autres milieux de E. coli et de coliformes, ce test n indiquera pas précisément la présence d une souche O57.

2 MC Plaques de numération des coliformes et des E. coli 3M MC 2 3 Numération (pas de croissance) = 0 Observer le changement de couleur progressif du gel qui s opère, de la figure 2 à la figure 8. À mesure que la numérotation des E. coli et des coliformes s accroît, le gel devient rouge foncé ou pourpre bleuté. Les bulles de fond sont une caractéristique du gel de la plaque et n indiquent pas la croissance de E. coli ou de coliformes. (Voir le carré.) Numération des E. coli = 3 Numération totale des coliformes = 28 La plage de numération pour la population totale sur les plaques de numération des coliformes et des E. coli est de 5 à 50 colonies. Ne pas compter les colonies situées sur la barrière en mousse, car elles ne subissent plus l influence sélective du milieu de croissance. (Voir le cercle.) Éclairage par l arrière Éclairage par l avant 2 Numération des E. coli = 3 La présence de couleur bleue au sein d une colonie (de bleu à rouge-bleu) indique qu il s agit d une colonie de E. coli. L éclairage par l avant permet une meilleure détection du précipité bleu produit par une colonie. Le cercle montre une colonie rouge-bleu comptée en utilisant l éclairage par l arrière. Le cercle 2 montre la même colonie détectée à l aide d un éclairage par l avant. Le précipité bleu est plus évident dans le cercle 2. 4 Numération des E. coli = 7 Numération estimée totale des coliformes = 50 La région circulaire de croissance bactérienne fait environ 20 cm 2. Il est possible d estimer le nombre de colonies présentes sur une plaque lorsque celle-ci contient plus de 50 colonies. Il suffit de compter le nombre de colonies dans une ou plusieurs cases représentatives et de déterminer le nombre moyen de colonies par case. Multiplier cette moyenne par 20 pour obtenir le nombre total estimé de coliformes par plaque. 5

3 Innombrable Pour obtenir une numération exacte, il est recommandé de diluer l échantillon 6 7 Numération réelle ~ 0 6 Les plaques de numération des coliformes et des E. coli dont les colonies sont innombrables possèdent une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : de nombreuses colonies de petite taille, une quantité importante de bulles de gaz et un assombrissement du gel qui passe du rouge au pourpre bleuté. Numérotation réelle ~ 0 8 En présence de fortes concentrations de E. coli, la couleur du gel peut passer au pourpre bleuté. 8 9 Numération présumée des E. coli ~ 8 Numération estimée des coliformes ~ 0 8 Lorsque les coliformes sont présents en fortes concentrations (>0 8 ), certaines souches de E. coli peuvent produire moins de gaz et les colonies bleues peuvent être moins définies. Compter toutes les colonies bleues qui ne présentent pas de traces de gaz et toutes les zones bleues comme étant des colonies de E. coli présumées. Retirer les colonies bleues sans gaz du gel et effectuer des tests de confirmation si nécessaire. Numération réelle ~ 0 8 En présence d une quantité importante de micro-organismes autres que les coliformes comme Pseudomonas sur les plaques de numération des coliformes et des E. coli, le gel peut virer au jaune.

4 Bulles de gaz Numération totale des coliformes = 3 Les particules alimentaires se caractérisent par leur forme irrégulière et ne sont pas accompagnées de bulles de gaz. Numération totale des coliformes = 78 La configuration des bulles de gaz peut varier. Les bulles de gaz peuvent perturber la colonie de manière que cette dernière «entoure» la bulle. (Voir les cercles et 2.) Les bulles artéfacts peuvent être le résultat d une inoculation inadéquate de la plaque ou de bulles d air emprisonnées dans l échantillon. Elles sont irrégulières et ne sont pas accompagnées de colonies. (Voir cercle 3.) Les exemples à 0 présentent différentes configurations de bulles qui peuvent être associées à des colonies produisant du gaz. Toutes ces colonies devraient être dénombrées.

5 MC Plaques de numération des coliformes et des E. coli 3 Aide-mémoire Pour obtenir des renseignements détaillés sur LES MISES EN GARDE, L EXONÉRATION DE LA GARANTIE/RECOURS LIMITÉ, LA LIMITATION DE RESPONSABILITÉ DE 3M, L ENTREPOSAGE ET LA MISE AU REBUT AINSI QUE LES DIRECTIVES D UTILISATION, consulter la notice d accompagnement du produit. Entreposage 2 3 Entreposer les pochettes non ouvertes à une température de 8 C ( 46 F). Utiliser avant la date de péremption inscrite sur l emballage. Dans les endroits à taux d humidité élevé où la condensation peut se produire, il est préférable d attendre que les produits aient atteint la température ambiante avant de les ouvrir. Préparation de l échantillon Pour sceller les pochettes ouvertes, replier l extrémité et fermer à l aide d un ruban adhésif. Conserver les pochettes scellées à une température de 25 C (< 77 F) et à une humidité relative de < 50 %. Ne pas réfrigérer les pochettes ouvertes. Utiliser les plaques dans le mois suivant l ouverture de l emballage Préparer une dilution du produit alimentaire dont le rapport de dilution est de : 0 ou plus. Peser ou pipetter le produit alimentaire dans un sac Whirl-Pak, un sac adapté au Stomacher, une fiole de dilution ou dans tout autre contenant stérile approprié. Ajouter la quantité appropriée de l un des diluants stériles suivants : solution tampon phosphate de Butterfield (tampon phosphate IDF, KH2PO4 à 0,0425 g/l dont le ph a été ajusté à 7,2), 0, % d eau peptonée, diluant salé peptoné (méthode ISO 6887), solution tampon à l eau peptonée (méthode ISO 6579), solution saline (de 0,85 à 0,90 %), bouillon de culture letheen sans bisulfite ou eau distillée. Mélanger ou homogénéiser l échantillon selon la procédure en vigueur. Ajuster le ph de l échantillon dilué entre 6,5 et 7,5 : avec N NaOH pour les produits acides; avec N HCl pour les produits alcalins. Ne pas utiliser de solution tampon contenant du citrate, du bisulfite ou du thiosulfate. Ces tampons peuvent inhiber la croissance bactérienne. Inoculation Poser la plaque sur une surface En maintenant la pipette perpendiculaire à plane. Soulever la pellicule supérieure. la plaque, déposer ml de l échantillon ou de l échantillon dilué au centre de la pellicule inférieure. Rabattre la pellicule supérieure en l abaissant délicatement pour empêcher que des bulles d air s y soient captées. Ne pas laisser tomber la pellicule supérieure.

6 CÔTÉ strié CÔTÉ plat 0 2 Avec le côté PLAT vers le bas, poser un étaleur sur la pellicule supérieure de l inoculum. Incubation Appliquer une LÉGÈRE pression sur l étaleur afin de répartir l inoculum uniformément en une zone circulaire avant que le gel ne se forme. Ne pas faire glisser ni tourner l étaleur sur la pellicule. Interprétation Soulever l étaleur et attendre au moins une minute pour que le gel se solidifie. <70 F 3 Incuber les plaques, côté transparent sur le dessus, en pile de 20 au maximum. Il peut être nécessaire d humidifier l incubateur afin de réduire au minimum la perte d humidité. 4 Recueillir les données des plaques sur un compteur de colonies standard ou sur toute autre loupe à éclairage. Consulter le Guide d interprétation lors de la lecture des résultats. Les colonies peuvent être isolées pour une identification ultérieure. Soulever la pellicule 5 supérieure et retirer la colonie du gel. Les durées et les températures d incubation varient en fonction de la méthode utilisée. Les méthodes homologuées les plus courantes sont les suivantes : Méthodes officielles de l AOAC 99.4 Pour les coliformes : Incuber pendant 24 h ± 2 h à 35 C ± C. Pour les E. coli : Incuber pendant 48 h ± 2 h à 35 C ± C. Méthode officielle de l AOAC Pour les E. coli (viande, volaille et fruits de mer) : 24 h ± 2 h à 35 C ± C. Méthode 3M homologuée par l AFNOR 0/4 09/92 Pour les E. coli : Incuber pendant 24 h ± 2 h à 42 C ± C. Méthodes NMKL (47.993) Pour les coliformes : Incuber pendant 24 h ± 2 h à 37 C. Pour les E. coli : Incuber pendant 48 h ± 2 h à 37 C. Autres remarques Questions? Composer le pour joindre le Service technique. Pour commander des plaques MC, composer le Produits de microbiologie Compagnie 3M Canada Case postale 5757 London (Ontario) N6A 4T microbiology@mmm.com est une marque de commerce de 3M. «Whirl-Pak» est une marque déposée de Nasco. 05-MS f