LES COURTS ARN CHEZ C. ELEGANS : SPÉCIFICITÉ ET FONCTION DES PROTÉINES ARGONAUTES

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1 MARIE-EVE BOISVERT LES COURTS ARN CHEZ C. ELEGANS : SPÉCIFICITÉ ET FONCTION DES PROTÉINES ARGONAUTES Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l Université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire pour l obtention du grade de Maître ès sciences (M. Sc.) FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC Marie-Eve Boisvert,

2 Résumé Chez C. elegans, les caractéristiques moléculaires des différentes voies des courts ARN divergent. Dans la voie du RNAi, une molécule d ARN double-brin linéaire mène à la production de siarn, initiant la dégradation de l ARNm. Quant aux microarn, le précurseur du microarn présente une structure «épingle à cheveux» et le microarn mature induit un blocage de la traduction de cet ARNm. Ces deux voies requièrent leurs protéines Argonautes spécifiques. Nous avons conçu une molécule d ARNdb linéaire contenant à la fois une séquence d un microarn et une séquence d un siarn, et suggérons que la spécificité des Argonautes n est pas déterminée par la molécule de départ. Nous tentons aussi de comprendre le rôle des Argonautes ALG-1 et ALG-2. Une immunoprécipitation et une analyse des facteurs protéiques et ribonucléiques associés ont été effectués. Cette expérience pourrait aussi s avérer un outil simple permettant l identification de nouvelles cibles potentielles des microarn.

3 ii Abstract The molecular characteristics of the RNAi and microrna pathways are different. In the RNAi pathway, fully base-paired dsrna molecules trigger the production of small interfering RNAs (sirnas), which lead to the degradation of the complementary targeted mrna. On the other hand, the stem-looped mirna precursor is processed in mature mirna, which then imperfectly interacts with the mrna target, leading to the blocking of its translation. In the worm C. elegans, each of the RNAi and mirna pathways needs its specific Argonautes proteins. RNAi requires RDE-1, while ALG-1 and ALG-2 act in the mirna pathway. The restriction of sirnas and mirnas to specific Argonaute proteins might reflect the recognition of the trigger by specific factors targeting it to the correct Argonaute protein. To better understand the importance of the trigger in the selection of the adequate Argonaute and pathway, we designed a dsrna trigger containing both mirna and sirna sequences. This chimeric molecule can rescue successfully the loss of function of the mirna let-7, and can also initiate the gfp gene silencing by RNAi. We demonstrated that RDE-1 and the dsrna-binding protein RDE-4 are essential for RNAi induced with our trigger, but are not involved in the let-7 function of the chimera molecule. On the other hand, we showed that ALG-2 is strictly required for the mirna function, but not for the RNAi function. Interestingly, we also found that the let-7 mirna processed from our molecule has a limited lifetime, while the RNAi response, initiated from the same dsrna, is maintained for a longer period. We suggest that the specificity of the Argonautes and thus the choice of the small RNA pathway is not determined by the type of RNA trigger, but rather by their respective molecular response. Furthermore, we also tried to understand the roles of ALG-1 and ALG-2. An immunoprecipitation of these proteins and an analysis of the protein and RNA interactors were carried out.

4 Avant-Propos Dans la préparation de l article Function of double-stranded triggers in the Argonautes selection for the microrna and RNAi pathways in C. elegans, j ai élaboré tous les résultats et figures présentés, me donnant le statut d auteure principale. Isabelle Banville a contribué aux résultats en générant la souche let-7 ts (n2853);alg-2(ok304). J ai aussi participé à la rédaction de l article avec D r Martin Simard. Cet article a été soumis à la revue Current Biology. Merci au D r Martin Simard ainsi que les membres présents et passés du laboratoire. Je suis reconnaissante envers maître Joëlle Brodeur, le D r Luc Gaudreau de l Université de Sherbrooke et ses étudiants qui m ont côtoyée. Merci à Christian Mercier pour les encouragements, discussions et coups de pied dans le derrière. Merci au CRSNG pour le soutien financier, et au Centre de Recherche de l Hôtel-Dieu de Québec. Merci à Chevy Chase, Ralph Wiggum et Julien Trépanier.

5 Blackbird fly, into the light of a dark black night P. McCartney

6 Table des matières Résumé...i Avant-Propos... iii Table des matières...v Liste des tableaux...vi Liste des figures... vii Liste des abréviations... viii 1. Introduction Le RNAi Les protéines Argonautes Autres facteurs cellulaires Transmission du signal dans l organisme Les microarn Les microarn et le développement de C. elegans Origine du microarn La voie des microarn Le mécanisme d inhibition de l ARNm par les microarn La spécificité des protéines Argonautes pour la voie du RNAi ou du microarn n est pas déterminée par le type d ARNdb initial chez C. elegans Injection d un ARNdb cohésif jouant le rôle d un microarn et d un siarn Introduction d un microarn ciblant le gène gfp Détermination de la température optimale d induction Détection de l ARNm cible Matériels et méthodes Formation de la molécule d ARNdb let-7gfp Souches de C. elegans Injection de l ARNdb let-7gfp Détection du microarn gfp Identification de facteurs interagissant avec les Argonautes ALG-1 et ALG Détection de l ARNm cible associé au complexe ALG-1/ALG Essais primaires d amplification de lin-14 et lin Inhibition de la dégradation des ARNm lin-28 et lin Optimisation de la détection de l ARNm cible dans le complexe ALG Identification d interacteurs potentiels du complexe ALG-1/ALG Matériels et méthodes Extraction protéique et immunoprécipitation Extraction d ARN et transcription inverse Immunobuvardage de type Southern et Northern Amplification par PCR en temps réel Souche bactérienne produisant l ARNdb contre Y48B6A.3/xrn Discussion et Conclusion...58 Bibliographie...63 ANNEXE

7 Liste des tableaux Tableau 1 : Les différents courts ARN. Tableau 2 : Composants cellulaires des voies du RNAi chez C. elegans. Tableau 3 : Facteurs potentiels interagissant avec ALG-1/ALG-2.

8 Liste des figures Figure 1 : Les différentes méthodes initiant l exo-rnai chez C. elegans. Figure 2 : Modèles des voies du RNAi chez C. elegans. Figure 3 : Protéine Argonaute. Figure 4 : Membres de la famille let-7 chez C. elegans. Figure 5 : Le cycle de vie de C. elegans. Figure 6 : Formation du pré-microarn par le complexe Drosha-DGCR8. Figure 7 : Voie des microarn chez C. elegans. Figure 8 : Inhibition de la synthèse protéique par les microarn. Figure 1 (Boisvert et al.) : A unique chimeric dsrna molecule triggers both microrna and RNAi pathways in C. elegans. Figure 2 (Boisvert et al.) : The microrna rescue is rapidly attenuated. Figure 3 (Boisvert et al.) : microrna or RNAi pathway : everything is chosen down the line. Figure 9: Induction du microarn gfp. Figure 10 : Schéma de l expérience d immunoprécipitation. Figure 11 : Essai de détection de l ARNm lin-14 dans le complexe ALG-1/ALG-2. Figure 12 : Détection des ARNm lin-28 et lin-41 par PCR en temps réel dans une population de C. elegans exposée au RNAi contre xrn-2. Figure 13 : Présence des ARNm lin-28 et lin-41 dans les extraits totaux avant l immunoprécipitation. Figure 14 : Protéines coprécipitant avec GFP ::ALG-1 et GFP ::ALG-2.

9 viii Liste des abréviations ALG : Argonaute like gene ADN : acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire AGO : Argonaute ARN : acide ribonucléique ARNm : ARN messager db: double brin DCR: Dicer related DDH: Aspartate, Aspartate, Histidine endo: endogène exo: exogène gfp: green fluorescent protein h: heure hsp: heat shock protein IP: immunoprécipitation let: lethal lin: abnormal cell lineage nt: nucléotide pes: patterned expression site piarn: PIWI interacting ARN pré-microarn: précurseur du microarn pri-microarn: primary microarn rasiarn: repeat-associated small interfering ARN RDE : RNA interference deficient RdRP: RNA dependent RNA polymerase RISC: RNA induced silencing complex RNAi : RNA interference rpm : révolution par minute RRF : RdRP Family sb : simple brin siarn : small interfering ARN tncarn: tiny noncoding ARN UTR: Untranslated region µg: microgramme µl: microlitre UV: ultraviolet

10 1. Introduction Jusqu à tout récemment, l ARN de faible poids moléculaire retrouvé sur les gels d électrophorèse était considéré comme un simple produit de dégradation, et aucune attention n y était portée. Toutefois, des études sur la régulation du développement chez le ver Caenorhabditis elegans, au début des années 1990, ont révélé la double vie des molécules d ARN : l inhibition des gènes par les courts ARN non codants. Depuis, un grand nombre de courts ARNs ont été caractérisés : les exo- et endo-siarn, les microarn, les tncarn, les piarn et les rasiarn (tableau 1). Court ARN Provenance Taille Organisme Références exo-siarn (exogenous small interfering) endo-siarn (endogenous small interfering) tncarn (tiny non-coding) microarn Virus, introduction artificielle séquences codantes du génome séquences non codantes du génome séquences non codantes du génome, issu d'un précurseur pré-microarn 21 à 25 nt tous les organismes 20 à 22 nt C. elegans 20 à 22 nt C. elegans 22 nt tous les organismes (Guo and Kemphues 1995); (Fire, Xu et al. 1998) (Ambros, Lee et al. 2003); (Lee, Hammell et al. 2006) (Ambros, Lee et al. 2003); (Lee, Hammell et al. 2006) (Lee, Feinbaum et al. 1993); (Reinhart, Slack et al. 2000) piarn (PIWI-interacting) non spécifique 29 à 30 nt rat (Lau, Seto et al. 2006) rasiarn (repeat-associated small interfering) séquences répétées, comme rétrotransposons et hétérochromatine 24 à 29 nt drosophile (Aravin, Lagos-Quintana et al. 2003); (Vagin, Sigova et al. 2006) Tableau 1 : Les différents courts ARN. Ceux-ci varient entre eux d après leur provenance, leur taille et potentiellement leur fonction encore peu connue. On retrouve aussi d autres types de courts ARN chez la plante (Bonnet, Van de Peer et al. 2006, Brodersen and Voinnet 2006). De façon générale, Ces courts ARN, qui sont parfaitement ou partiellement complémentaires à l ARN messager (ARNm) d un gène cible, emprunteront leur voie moléculaire spécifique qui mènera à la reconnaissance de l ARNm cible et éventuellement à son inhibition. Les piarn ont été découverts récemment et leur rôle est encore méconnu. Cette classe de courts ARN est retrouvée en grande quantité dans les gonades mâles du rat; il est donc possible qu ils jouent un rôle dans la maturation des cellules germinales (Lau, Seto et al. 2006). Il en est de même pour les rasiarn, qui seraient impliqués dans le

11 2 développement de la lignée germinale de la drosophile (Vagin, Sigova et al. 2006). Toutefois, les voies moléculaires de l exo-rnai (exo-siarn), de l endo-rnai (endosiarn et tncarn) et des microarn (microarn) sont de mieux en mieux caractérisées. 1.1 Le RNAi À l origine, les scientifiques utilisaient l interférence par l ARN exogène (exo-rnai) comme un outil efficace d inhibition de l expression génique chez C. elegans (Guo and Kemphues 1995; Rocheleau, Downs et al. 1997). Des travaux précisant le mécanisme de cette inhibition montrèrent que la molécule d ARN double brin (ARNdb) initie la répression d un gène spécifique chez C. elegans de façon beaucoup plus significative qu un ARN simple brin (ARNsb) (Fire, Xu et al. 1998). Figure 1: Les différentes méthodes initiant le exo-rnai chez C. elegans (Boisvert, Topics in Microbiology, sous presse). Cette molécule d ARNdb exogène, une fois dans l organisme, est ensuite clivé en exosiarn, une molécule double brin ayant la région 3 cohésive d une longueur de deux

12 3 nucléotides (Zhang, Kolb et al. 2004). Toutefois, il a été récemment démontré que la voie du RNAi est aussi présente de façon naturelle chez les animaux. L endo-rnai, distincte de l exo-rnai, mène à la transformation de l ARNdb produite dans le ver en endo-siarn et tncarn (Ambros, Lee et al. 2003). La figure 2 présente les modèles proposés de ces voies moléculaires. Tout d abord, la molécule d ARNdb exogène pénètre dans l organisme, emprunte la voie de l exo-rnai et est généré en siarn primaires par l endonucléase Dicer (DCR-1). Quant à la voie de l endo-rnai, elle est initiée par l ARNdb endogène formé par une molécule simple brin repliée sur elle-même, ou par un duplexe d ARN bimoléculaire (Ambros, Lee et al. 2003). Figure 2: Modèle des voies du RNAi chez C. elegans. (Boisvert, Topics in Microbiology, sous presse) Dans chacune de ces voies, des complexes spécifiques de DCR-1 reconnaissent les ARNdb «initiaux», soit les ARNdb déclenchant les voies, et les transforment en siarn. Ces

13 4 siarn deviennent alors simple brin et un seul des deux brins s associe avec l Argonaute primaire (1 st Ago) : RDE-1 pour l exo-rnai et probablement ERGO-1 pour l endo-rnai (Yigit, Batista et al. 2006). Ce complexe Argonaute/siARN, appelé RISC (RNA-induced silencing complex), se lie alors de façon complémentaire à l ARNm. Name Family RNAi Function CSR-1 (Chromosome Segregation and RNAi) Argonaute Endo Germ line RNAi / Chromosome segregation ERGO-1 (Endogenous RNAi-deficient Argonaute) Argonaute Endo Interaction with the endo-sirna PPW-1 (PAZ/PIWI-related protein) Argonaute? Interaction with secondary sirna? PPW-2 (PAZ/PIWI-related protein) Argonaute? Interaction with secondary sirna? / transposon silencing in germ line PRG-1 (Piwi-Related Gene) Argonaute Endo Germ line proliferation and maintenance / Gonadogenesis RDE-1 (RNA interference-deficient) Argonaute Exo Interaction with the primary sirna, formation of the RISC complex SAGO-1 (synthetic secondary-sirna defective AGO) Argonaute Exo-Endo Interaction with secondary sirna SAGO-2 (synthetic secondary-sirna defective AGO) Argonaute Exo-Endo Interaction with secondary sirna *ALG-1 (Argonaute- Like Gene) Argonaute - Formation of mirisc with mirna / implication in transcriptional silencing *ALG-2 (Argonaute Like Gene) Argonaute - In complex with ALG-1, interaction with mirnas Interaction with trigger dsrna / may present primary sirna to RDE-4 (RNA interference-deficient) dsrna binding protein Exo DCR-1 DRH-1 (Dicer-Related Helicase) Helicase Exo May give an accessible conformation to dsrna for DCR complex DRH-2 (Dicer-Related Helicase) Helicase Exo May give an accessible conformation to dsrna for DCR complex DRH-3 (Dicer-Related Helicase) Helicase Endo May give an accessible conformation to dsrna for DCR complex MUT-14 (Mutator) Helicase Exo Transposon silencing into germ line/ May permit the novo RNA synthesis on the mrna target by RdRPs SMG-2 (Suppressor with Morphological effect on Genitalia) Helicase Exo May be important for the persistence of RNAi RDE-3 (RNA interference-deficient) Polymerase β- nucleotidyltransferase? May polyadenylate the 3' end of cleavage product, and recruit RdRP EGO-1 (Enhancer of glp-1) RNA-dependent RNA Polymerase Exo Polymerisation of secondary sirna precursor for exo-rnai in germinal cells RRF-1 (RdRP Family) RNA-dependent RNA Polymerase Exo Polymerisation of secondary sirna precursor for exo-rnai in somatic cells RRF-2 (RdRP Family) RNA-dependent RNA Polymerase?? RRF-3 (RdRP Family) RNA dependent RNA Polymerase Endo Polymerisation of secondary sirna precursor for endo-rnai in somatic cells PIR-1 (RNA phosphatase homolog) RNA phosphatase? Implicated in the processing of secondary sirnas May remove 5' β- and γ- phosphate of secondary sirnas DCR-1 (Dicer Related) RNase III Exo/Endo Cleavage of dsrna and mirna precursor into sirna and mirna SID-1 (Systemic RNA Interference- Deficient) Transmembrane protein? Systemic transmission of dsrna and transmission to progeny MUT-7 / MUT-8 / MUT-15 (Mutator)? Exo/Endo? Transposon silencing into germ line Tableau 2: Composants cellulaires des voies du RNAi chez C. elegans. Les Argonautes ALG-1 et ALG-2 sont suivis d un astérisque, car ils font partie de la voie des microarn et non du RNAi. (Boisvert, Topics in Microbiology, sous presse) Après le clivage endonucléolytique de cet ARNm cible, il y a recrutement de l ARN polymérase dépendante à l ARN (RdRP) et polymérisation du brin d ARN antisens au

14 5 produit de clivage. Ce nouveau ARNdb sera clivé (possiblement par DCR-1) pour générer les siarn secondaires. Ces siarn seront pris en charge par les Argonautes secondaires (2 nd Ago), et la réponse au RNAi, soit l inhibition du gène cible, sera donc amplifiée et transmise aux générations futures. Les voies moléculaires d inhibition génique par les courts ARN non codants nécessitent plusieurs étapes et plusieurs facteurs cellulaires. Dans cette section, les joueurs clés des voies du RNAi chez C. elegans seront décrits (tableau 2) et plus particulièrement la famille des Argonautes, dont chaque membre semble spécifique à sa voie métabolique Les protéines Argonautes Jusqu à ce jour, on retrouve huit Argonautes chez l humain, quatre chez la drosophile, 10 chez Arabidopsis thaliana, une seule chez Schizosaccharomyces pombe et pas moins de 27 chez C. elegans (Tolia and Joshua-Tor 2007). Les protéines Argonautes ont un rôle crucial dans les voies d interférence par les courts ARN. En fait, l association des Argonautes avec les courts ARN non-codants génère le noyau du complexe d inhibition induite par l ARN soit le complexe RISC, effecteur de l inhibition des ARNm cibles (Carmell, Xuan et al. 2002); (Hammond, Boettcher et al. 2001); (Miyoshi, Tsukumo et al. 2005). Ce qui définit une protéine Argonaute est la présence des domaines PIWI et PAZ (figure 3). Le domaine PAZ est retrouvé chez trois familles protéiques : Piwi, Argonaute et Zwille. Ce domaine, voisin de la partie N-terminale de la protéine, interagit avec les deux nucléotides non appariés de la région 3 du siarn ou du microarn (Carmell and Hannon 2004); (Lingel, Simon et al. 2003); (Song, Liu et al. 2003). Près de l extrémité C-terminale de l Argonaute, on retrouve le domaine PIWI. Ce domaine contient la région catalytique appelée «DDH» (deux aspartates et une histidine), un motif analogue au motif catalytique de la famille des RNases H (Song, Smith et al. 2004). Une mutation d un de ces acides aminés chez l Argonaute humain Ago2 abolit cette activité catalytique (Liu, Carmell et al.

15 6 2004; Rivas, Tolia et al. 2005). Une fois l Argonaute lié au siarn, ce complexe RISC se lie à l ARNm cible, et l Argonaute serait responsable du clivage de l ARNm (Song and Joshua-Tor 2006). On retrouve les Argonautes dans tous les organismes pouvant inhiber des gènes spécifiques par les courts ARN. Figure 3: Protéine Argonaute. Le siarn est représenté en jaune, et l ARNm ciblé en rouge. (Song, Smith et al. 2004) Les Argonautes primaires Chez C. elegans, la protéine RDE-1 (RNA interference-deficient) fut la première protéine Argonaute connue pour être impliquée dans la voie de l exo-rnai (Tabara, Sarkissian et al. 1999), et des études génétiques montrèrent que RDE-1 agissait en amont dans cette voie moléculaire (Grishok, Tabara et al. 2000). En induisant l exo-rnai chez le ver contre un gène spécifique, puis en utilisant une matrice d affinité à l ARN 2 -O-méthylé qui retient les complexes des courts ARN non codants (Hutvágner, Simard et al. 2004), il a été montré que RDE-1 interagit avec les brins sens et antisens générés par le clivage de l ARNdb initial par la RNase III DCR-1 (Yigit, Batista et al. 2006). Ces observations suggèrent que RDE-1 entre en jeu dans la voie après le transport systémique de l ARNdb initial dans l animal, et après sa transformation en siarn simple brin pour former le complexe RISC. Il a aussi été montré que dans une souche incapable de produire les siarn secondaires (décrits à la section ), l interaction de RDE-1 avec les courts ARN n est pas altérée,

16 7 suggérant que les étapes en aval de la voie de l exo-rnai chez C. elegans ne sont pas importantes pour la liaison de RDE-1 au siarn, ni pour la production de ces siarn générés par le traitement de l ARNdb initial (appelés siarn primaires). D autres expériences ont confirmé que RDE-1 interagit seulement avec les siarn primaires et non les siarn secondaires, caractérisant ainsi RDE-1 comme une protéine Argonaute primaire (Yigit, Batista et al. 2006). En résumé, quand un ARNdb initial est introduit dans C. elegans, cette molécule est transformée en siarn primaire par l endonucléase DCR-1, puis interagit avec RDE-1 pour former le complexe RISC (figure 1). Aujourd hui, il n est pas encore clair si RDE-1 clive directement l ARNm cible, comme rapporté pour les Argonautes formant le RISC chez la drosophile et l humain (Hammond, Boettcher et al. 2001; Liu, Carmell et al. 2004; Meister, Landthaler et al. 2004). Une comparaison des séquences des domaines PIWI de protéines Argonautes de plusieurs espèces suggère que RDE-1 pourrait avoir la capacité d induire le clivage endonucléolytique de l ARNm cible. Évidemment, la voie de l endo-rnai chez C. elegans nécessite aussi les Argonautes primaires : l Argonaute ERGO-1 (Endogenous RNAi-deficient Argonaute) semble remplacer RDE-1 lorsqu il s agit de la prise en charge d un ARNdb endogène. Un ver mutant pour le gène ergo-1 montre une diminution du niveau de siarn endogènes, et la mutation n affecte pas la voie de l exo-rnai (Yigit, Batista et al. 2006) Les Argonautes secondaires Puisque les Argonautes primaires semblent s associer seulement avec les siarn primaires, d autres membres de la famille des Argonautes s occupent quant à eux des siarn secondaires. Une fois que les molécules d ARNdb initiaux endogènes ou exogènes ont amorcé leur voie respective, le complexe RDE-1/exo-siARN ou ERGO-1/endo-siARN s associe à l ARNm cible, et la production des siarn secondaires est entamée. Une analyse des gènes des Argonautes a révélé le groupe des Argonautes secondaires, qui interagissent avec les siarn secondaires. Parmi eux, on y retrouve les Argonautes SAGO-

17 8 1, SAGO-2, PPW-1 et PPW-2. Les expériences démontrent qu une surexpression des protéines SAGO augmente l activité du RNAi, suggérant que ces protéines pourraient être le facteur limitant de la voie. Par des expériences d immunoprécipitation, il a été observé que les Argonautes SAGO-1 et SAGO-2 lient les siarn secondaires, aussi bien les exoque les endo-siarn. Il est donc suggéré qu une compétition existerait entre la voie de l exo-rnai et celle de l endo-rnai, et que ces deux voies convergeraient à l étape des siarn secondaires. Quant aux Argonautes PPW, ces protéines sont requises pour le RNAi dans la lignée germinale. De plus, les protéines SAGO et PPW ne possèdent pas le motif catalytique DDH dans leur domaine PIWI, ce qui est une différence majeure avec les Argonautes RDE-1 et ERGO-1. Il est donc suggéré que les siarn secondaires requièrent des facteurs cellulaires autres que les Argonautes pour contrôler l inhibition des ARNm ciblés (Yigit, Batista et al. 2006) Autres facteurs cellulaires Les protéines Argonautes du ver C. elegans ont un rôle crucial dans les voies de l interférence par l ARN. Les voies du RNAi nécessitent aussi d autres facteurs, pour entre autres générer les siarn primaires des ARNdb initiaux, de même que pour la production des siarn secondaires RDE-4 Durant les nombreuses expériences menant à l identification de gènes essentiels à la voie du RNAi chez C. elegans, un locus sur le chromosome III a été isolé, et le gène rde-4 a été identifié (Tabara, Sarkissian et al. 1999). Des études suivantes ont démontré que RDE-4, tout comme RDE-1, est requis durant les premières étapes de la voie de l exo-rnai (Grishok, Tabara et al. 2000); de plus, dans une souche mutante pour le gène rde-4 on observe une diminution des niveaux de siarn primaires suite à l injection de l ARNdb initial, résultant en un défaut de la voie de l exo-rnai (Parrish and Fire 2001). Grâce à la présence d un motif de liaison à l ARNdb, RDE-4 interagit préférentiellement avec les

18 9 longues molécules d ARNdb et non avec les siarn (Tabara, Yigit et al. 2002; Parker, Eckert et al. 2006). RDE-4 interagit avec RDE-1 et DCR-1, de même qu avec DRH-1 et DRH-2 (Dicer Related Helicase), des facteurs requis pour le RNAi (Tabara, Yigit et al. 2002), suggérant que le rôle de RDE-4 serait de reconnaître l ARNdb initial entrant dans l organisme et de le présenter à DCR-1 pour la formation du siarn DCR-1 et ses facteurs associés Grâce à des études de cellules de mouche à fruit, l enzyme de la famille des RNAseIII DCR-1 (dit Dicer) a été initialement associée à la production des siarn (Hammond, Bernstein et al. 2000). Par la suite, des études chez le ver ont montré que DCR-1 est requis pour la production des microarn, pour l exo-rnai, le développement de la lignée germinale (Grishok, Pasquinelli et al. 2001; Knight and Bass 2001), et plus récemment pour la voie de l endo-rnai (Ambros, Lee et al. 2003). La protéine DCR-1 contient un domaine ARN hélicase de type DExH/DEAD-box, deux domaines RNase III et un motif de liaison à l ARNdb (Knight and Bass 2001). La fonction principale de DCR-1 est de transformer l ARNdb initial et le précurseur des microarns (décrit plus loin) en siarn et microarn respectivement (Bernstein, Caudy et al. 2001; Grishok, Pasquinelli et al. 2001). Comme toute endonucléase de type RNase III, DCR-1 laisse au siarn ou au microarn une extrémité cohésive en 3 d une longueur de 2 nucléotides, et un groupement phosphate en 5. Il est aussi suggéré, mais non démontré, que DCR-1 est responsable de la formation des siarn secondaires (Sijen, Steiner et al. 2006; Yigit, Batista et al. 2006). Des facteurs autres que RDE-1 et RDE-4 sont maintenant connus pour interagir avec DCR- 1 : les Hélicases Reliées à Dicer DRH-1, DRH-2 et DRH-3 (Duchaine, Wohlschlegel et al. 2006). Il est suggéré que leur rôle serait de rendre la conformation de l ARNdb initial accessible pour le complexe DCR-1. DRH-1 et DRH-2 interagissent avec RDE-4, suggérant que ces hélicases font partie de la voie de l exo-rnai (Tabara, Yigit et al. 2002; Duchaine, Wohlschlegel et al. 2006). Quant à DRH-3, il semble provenir d un gène

19 10 essentiel à la viabilité de l animal et semble être requis pour la voie de l endo-rnai (Duchaine, Wohlschlegel et al. 2006). La classe de gène eri (Enhancers of RNAi) a aussi été trouvée en association avec DCR-1 (Duchaine, Wohlschlegel et al. 2006). La particularité de cette famille de protéines est qu une perte de fonction de l une d elles entraîne un phénotype d hypersensibilité à l exo- RNAi chez le ver. Des travaux ont tout d abord montré que l exonucléase ERI-1 est possiblement une sirnase : ERI-1 dégrade partiellement in vitro les siarn seulement. De plus, un mutant eri-1 montre une augmentation de la sensibilité à l exo-rnai, et une forte abondance et stabilité des siarn primaires (Kennedy, Wang et al. 2004). Il a donc été suggéré qu une atténuation du RNAi pourrait être causée par la dégradation de siarn par ERI-1. Toutefois, en étudiant l interaction entre ERI-1 et DCR-1, deux nouvelles protéines ERI interagissant avec DCR-1 et augmentant la sensibilité à l exo-rnai ont été découvertes : ERI-3 et ERI-5 (Duchaine, Wohlschlegel et al. 2006). En l absence d un de ces deux gènes, l interaction entre ERI-1 et DCR-1 disparaît pratiquement, suggérant que ERI-3 et ERI-5 «supportent» l association de ERI-1 à DCR-1. De plus, l accumulation d endo-siarn et de tncarn nécessite les protéines ERI, proposant un rôle dans la voie de l endo-rnai pour celles-ci (Duchaine, Wohlschlegel et al. 2006). En plus d exhiber un faible niveau d endo-siarn, un ver mutant pour le gène eri-1 démontre aussi une augmentation du niveau des exo-siarn (Lee, Hammell et al. 2006); (Duchaine, Wohlschlegel et al. 2006). Donc, ERI-1 intervient dans la voie de l endo-rnai et en son absence, les protéines effectrices du RNAi travailleraient majoritairement pour le exo- RNAi, où on y verrait une hypersensibilité à l exo-rnai. Alors, une compétition entre l exo- et l endo-rnai serait la cause du phénotype de l hypersensibilité, plutôt qu un rôle de régulation négative de la part des protéines ERI sur la voie de l exo-rnai. Malgré ces faits, la fonction exacte de la famille ERI n est pas encore déterminée. Parmi les interacteurs de DCR-1, on trouve l ARN phosphatase PIR-1 qui est essentielle pour l exo-rnai. Un mutant pir-1 montre un défaut du développement comme il a été vu

20 11 chez un mutant drh-3 (Duchaine, Wohlschlegel et al. 2006). Quand le mutant pir-1 est exposé à l ARNdb initial, il y a accumulation de molécules d ARNdb d environ 120 nucléotides, portant la séquence de l ARNdb initial, de même que les séquences en amont de cet ARNdb. Ces nouvelles molécules d ARNdb sont produites par les ARN Polymérases ARN-dépendantes (RdRP, décrites à la section ) et sont les précurseurs des siarn secondaires. Ceci soulève la possibilité que DCR-1 (ou la protéine effectrice) ne peut former les siarn secondaires à partir du précurseur sans l aide de PIR-1 (Duchaine, Wohlschlegel et al. 2006). Cet ARN phosphatase est hautement conservé dans l évolution (Duchaine, Wohlschlegel et al. 2006), et l homologue de PIR-1 chez les vertébrés peut retirer les 5 γ- et β- phosphates de substrats d ARN triphosphates (Yuan, Li et al. 1998; Deshpande, Takagi et al. 1999). Des évidences récentes proposent que les RdRP produisent des ARNdb ayant un triphosphate en 5 (Pak and Fire 2006; Sijen, Steiner et al. 2006), et PIR-1 pourrait donc générer les produits monophosphates en 5, qui seront reconnus par le complexe DCR-1 et/ou une Argonaute, tel SAGO ou PPW (Duchaine, Wohlschlegel et al. 2006) Les ARN Polymérases ARN-dépendantes et les siarn secondaires Un facteur important de l exo-rnai chez le ver C. elegans est que l introduction d un ARNdb à un endroit précis de l organisme induit l inhibition génique dans tous les tissus à l exception des cellules neurales, et ce, même dans les générations suivantes du nématode (Fire, Xu et al. 1998; Grishok, Tabara et al. 2000). Cette caractéristique résulte de l amplification de la réponse à l exo-rnai, grâce à la formation des siarn secondaires par les ARN Polymérases ARN-dépendantes (RdRP) (Sijen, Fleenor et al. 2001). Chez le ver, le premier RdRP décrit comme lié au RNAi fut EGO-1 (Smardon, Spoerke et al. 2000). Trois homologues à EGO-1 furent identifiés par la suite : RRF-1, RRF-2 et RRF-3 (Smardon, Spoerke et al. 2000). Le gène ego-1 est essentiel pour le développement de la lignée germinale, et une perte de fonction de ce gène entraîne une forte résistance à l exo- RNAi ciblant des gènes spécifiques à la lignée germinale (Smardon, Spoerke et al. 2000). Dans le cas du gène rrf-1, qui est étroitement lié à ego-1 dans le locus, une perte de fonction rend le ver insensible à l exo-rnai ciblant des gènes exprimés dans les tissus

21 12 somatiques, tandis que l interférence à l ARN est bien présente pour les gènes de la lignée germinale (Sijen, Fleenor et al. 2001). Donc, EGO-1 est nécessaire pour l exo-rnai dans les cellules germinales, alors que RRF-1 est requis pour l exo-rnai dans les cellules somatiques. Contrairement à ego-1 et rrf-1, une délétion du gène rrf-3 ne réduit pas la sensibilité à l exo-rnai dans les tissus somatiques et germinaux, mais entraîne plutôt une hypersensibilité à l exo-rnai (Sijen, Fleenor et al. 2001; Simmer, Tijsterman et al. 2002). Il a aussi été montré que la protéine RRF-3 interagit avec le complexe DCR-1 (Duchaine, Wohlschlegel et al. 2006) et qu il y a une diminution du niveau d endo-siarn et une augmentation d exo-siarn dans un mutant rrf-3, comme il a été observé pour un mutant eri-1 (Lee, Hammell et al. 2006). RRF-3 serait donc membre de la voie de l endo-rnai, tout comme ERI-1. Il n y a pas de phénotype observé chez un mutant rrf-2, et on en sait peu sur cette protéine. Il est toutefois suggéré que RRF-2 aurait un rôle redondant dans le RNAi (Sijen, Fleenor et al. 2001). La production des siarn secondaires semble avoir un rôle clé dans les voies du RNAi. Une fois que l ARNm cible est clivé, un complexe contenant la β-nucléotidyltransferase RDE-3 aurait le rôle de polyadényler l extrémité 3 des produits de clivage, facilitant le recrutement des RdRP (Chen, Simard et al. 2005). Le mécanisme de production des siarn secondaires par les RdRPs est encore obscur. Des études récentes ont montré que la production des siarn par les RdRPs ne nécessite pas d amorce et il est de plus en plus accepté que la matrice de ces nouveaux ARN serait l ARNm cible (Pak and Fire 2006; Sijen, Steiner et al. 2006). Ces mêmes études ont aussi révélé que les siarn secondaires contiennent des di- ou triphosphates à l extrémité 5, ce qui serait utile dans leur reconnaissance par les Argonautes secondaires à l aide de PIR-1. Maintenant que le cycle des siarn secondaires est amorcé, la réponse au RNAi sera persistante dans toutes les cellules du nématode.

22 Transmission du signal dans l organisme Chez C. elegans, la voie du RNAi est un mécanisme systémique qui est transmis à la progéniture, contrairement à la drosophile (Hammond, Bernstein et al. 2000; Tavernarakis, Wang et al. 2000; Winston, Molodowitch et al. 2002). En fait, la réponse à l exo-rnai peut toujours être détectée après 80 générations (Vastenhouw, Brunschwig et al. 2006). Il y aurait donc forcément un mécanisme chez le ver requis pour la transmission de l ARNdb d un tissu à un autre. La protéine transmembranaire SID-1 est effectivement impliquée dans la transmission systémique et l héritabilité du RNAi (Winston, Molodowitch et al. 2002). Il est suggéré que SID-1 forme un canal pour le transport passif de l ARNdb dans la cellule, tout en ayant une rétention active de l ARNdb (Feinberg and Hunter 2003). Il n y a pas d homologue à sid-1 chez la drosophile, en accord avec l absence de RNAi systémique. Toutefois, on retrouve des protéines homologues à SID-1 chez les mammifères, quoique la transmission du RNAi n y a pas encore été démontrée (Winston, Molodowitch et al. 2002). Chez la plante, la transmission du RNAi de cellule en cellule confère une protection immunitaire contre le génome viral dans tout l organisme. Chez le ver, il n est pas clarifié si la voie du RNAi est un système immunitaire primitif, quoique cette idée est fortement suggérée. Des études ont montré que rde-1 est requis pour une inhibition antivirale potentielle, amorcée par la réplication virale (Lu, Maduro et al. 2005). En plus, des études ont récemment découvert que C. elegans semble utiliser le RNAi comme défense contre les dommages causés par l insertion de transposons dans la lignée germinale (Vastenhouw and Plasterk 2004). Dans la plupart des souches de C. elegans, le transposon Tc1, le plus abondant, est actif dans les cellules somatiques mais soumis au silence dans les cellules germinales (Emmons and Yesner 1984). Des recherches ont démontré que les gènes responsables de cette inhibition, appelés mutateurs (mut-7, mut-8, mut-14 et mut-15 et autres) affectent aussi le RNAi lorsque mutés (Ketting, Haverkamp et al. 1999; Tabara, Sarkissian et al. 1999; Ketting and Plasterk 2000; Tijsterman, Ketting et al. 2002; Vastenhouw, Fischer et al. 2003). La nécessité de ces gènes dans ces mécanismes

23 14 d inhibition indique fortement le rôle de l exo-rnai dans la maintenance de l intégrité du génome et des générations futures. 1.2 Les microarn Bien qu elle nécessite aussi les protéines Argonautes, qu elle emploie de courts ARN db de 21 nucléotides avec deux nucléotides non appariés à l extrémité 3 et qu elle mène aussi à l inhibition de gènes spécifiques, la voie des microarn est bien distincte de la voie du RNAi. Jusqu à présent, on a identifié plus d une centaine de microarn chez C. elegans (Bartel 2004). Dans ce court ARN, les nucléotides 2 à 7 constituent une séquence appelée «seed». Ils sont considérés comme les nucléotides critiques pour la sélection des ARNm cibles. En fait, la complémentarité entre le microarn et son ARNm cible est restreinte à cette région (Lewis, Shih et al. 2003; Brennecke, Stark et al. 2005; Du and Zamore 2005; Lewis, Burge et al. 2005). Bien sûr, cette séquence est si courte qu elle se retrouve dans plusieurs microarn, qu on peut donc regrouper en famille de microarn d après leur «séquence seed» (figure 4). Les membres d une même famille sont considérés comme redondants, puisqu ils ciblent pratiquement les mêmes ARNm. Figure 4: Membres de la famille let-7 chez C. elegans. Les nucléotides 1 à 8 forment la séquence «seed» du microarn. (Abbott, Alvarez-Saavedra et al. 2005) Les microarn et le développement de C. elegans Le nématode Caenorhabditis elegans, pouvant atteindre jusqu à un millimètre à l âge adulte, est communément retrouvé dans le sol de plusieurs régions du monde. Il se nourrit

24 15 principalement de bactéries et a une durée de vie d environ trois semaines. Cet animal a toujours vécu dans l ombre jusque dans les années 1970; les travaux du D r Sydney Brenner ont mis en lumière tout le potentiel de recherche que détient C. elegans. Avec son génome complètement séquencé et la différenciation déterminée de chacune de ses 959 cellules somatiques, ce ver rond est un puissant outil de recherche Le gène hétérochronique lin-4 On retrouve deux sexes chez C. elegans : le mâle et l hermaphrodite. Celle-ci peut s autoféconder et pondre jusqu à 300 oeufs, et ce nombre s élève à 1000 lorsqu elle est fécondée par le mâle. Environ 14 heures après l embryogenèse, le ver quitte l oeuf et passe à travers quatre stades larvaires (L1, L2, L3 et L4) jusqu au stade adulte en 36 heures, à la température optimale de 25 C (figure 5) (Riddle 1997); (Wood 1988). Évidemment, chaque passage à un stade supérieur est finement régulé. Au début des années 1990, D r Victor Ambros et son groupe se sont intéressés au gène lin-4, dont le produit est impliqué dans le développement de C. elegans par régulation négative du gène lin-14 (Ambros and Horvitz 1987); (Ambros 1989), permettant le passage du stade L1 au stade L2 (figure 5) (Ambros 2000). Afin de mieux comprendre le mécanisme par lequel lin-4 interagirait avec le facteur de transcription LIN-14, l équipe du D r Ambros a effectué un criblage génétique classique à travers tous les stades larvaires menant au ver adulte. De façon surprenante, il fut découvert que le locus lin-4 ne code pas pour une protéine. Plus précisément, une banque d ADN complémentaire ne contient pas le gène lin-4. Ce fut la caractérisation du premier microarn (Wightman, Ha et al. 1993); (Lee, Feinbaum et al. 1993). Des études plus poussées sur lin-4 montrèrent que le microarn régule négativement lin-28, impliqué lui aussi dans le développement du ver entre le stade L1 et le stade L2 (Moss, Lee et al. 1997).

25 16 Figure 5: Le cycle de vie chez C. elegans. Après l éclosion, la larve L1 devient L2 après environ 12 h. lin-4 bloque l ARNm de lin-14 entre le stade L1 et le stade L2. Après environ 36 h, let-7 régule négativement l ARNm lin-41 et permet le passage du stade L4 au stade adulte. Le développement embryonnaire (de la ponte de l oeuf à l éclosion) dure approximativement 14 h Le gène hétérochronique let-7 Les microarn ont longtemps été perçus comme propres à C. elegans. Toutefois, la découverte d un second microarn impliqué dans le développement du ver a piqué la curiosité de la communauté scientifique. Comme lin-4, le gène let-7 ne code pas pour une protéine, mais bien pour un microarn de 22 nucléotides qui est complémentaire à la région 3 UTR d ARNm nécessaires pour le développement. (Reinhart, Slack et al. 2000). lin-41 est la cible la mieux connue de let-7 : c est un gène codant pour une protéine inhibitrice de la traduction du facteur de transcription LIN-29, essentiel à la transition L4 à adulte (Reinhart, Slack et al. 2000); (Slack, Basson et al. 2000); (Grosshans, Johnson et al. 2005). Une perte de fonction de let-7 chez le ver cause un défaut du développement lors du

26 17 passage du stade L4 au stade adulte (figure 5), qui est caractérisé par un éclatement de la vulve. Des études plus approfondies de ce microarn ont révélé que la séquence de let-7 et son appariement aux régions 3 UTR des ARNm cibles sont conservés parmi un grand éventail d espèces animales, dont l humain, la drosophile et le poisson-zèbre (Pasquinelli, Reinhart et al. 2000; Lagos-Quintana, Rauhut et al. 2001). Sa fonction hétérochronique est aussi conservée chez la drosophile et le poisson-zèbre : let-7 n est pas exprimé chez les embryons et les larves, mais sa présence est détectée au stade adulte (Sempere, Dubrovsky et al. 2002); (Pasquinelli, Reinhart et al. 2000) Origine du microarn On retrouve les gènes des microarn à plusieurs endroits dans le génome : à de longues distances des gènes codants, parmi les introns d ARN pré-messagers, regroupés ensemble et exprimés en transcrit de type polycistronique, et certains parmi les groupes de gènes Hox (Bartel 2004). Au moment des premières études, des évidences montraient que l ARN polymérase II était responsable de la transcription des microarn, soit par l étude du profil d expression des microarn ou par les caractéristiques du transcrit (Lee, Kim et al. 2004). Toutefois, des études récentes d immunoprécipitation de la chromatine et d essais de transcription in vitro démontrent que l ARN polymérase de type III transcrit aussi les microarn (Borchert, Lanier et al. 2006). La caractéristique propre aux microarn est qu ils proviennent d un transcrit primaire de plusieurs centaines de nucléotides à plusieurs kilobases, qui s assemble en structure «tige-boucle» : un précurseur appelé pri-microarn (précurseur primaire) (Lee, Jeon et al. 2002). Ce transcrit est par la suite tronqué en molécule de type «épingle à cheveux» d une longueur d environ 70 nucléotides appelé pré-microarn (précurseur) : une activité enzymatique effectuée par la RNAse III Drosha (Lee, Ahn et al. 2003). Ce pré-microarn est finalement pris en charge par DCR-1 et devient alors un microarn mature.

27 Le complexe Drosha-DGCR8 En étudiant méticuleusement la molécule pré-microarn, il a été remarqué que l extrémité 3 possède deux nucléotides non appariés, une signature des RNases III. De plus, la transition du pri-microarn au pré-microarn a majoritairement lieu dans le noyau cellulaire (Lee, Jeon et al. 2002; Zeng and Cullen 2003). C est ainsi qu est venue l idée d étudier la protéine Drosha, une RNase III nucléaire. Les premières recherches sur le rôle de Drosha dans la voie des microarns on vu juste : dans les cellules humaines, Drosha produit in vitro des fragments d ARN d environ 70 nucléotides, et Dicer clive l ARN en fragments de 22 nt (Lee, Jeon et al. 2002). Figure 6: Formation du pré-microarn par le complexe Drosha-DGCR8. (Han, Lee et al. 2006) D autres études ont démontré que Drosha agit en complexe et nécessite plus particulièrement la protéine DGCR8 (Pasha chez C. elegans et la drosophile (Denli, Tops et al. 2004)), une protéine contenant deux domaines de liaison à l ARNdb (Han, Lee et al.

28 ). Ces expériences ont démontré que, in vitro, Drosha seul ne peut produire les prémicroarn, mais son activité devient à pleine capacité lorsque la protéine DGCR8 est ajoutée à la solution. Le complexe Drosha-DGCR8 constitue donc le complexe fonctionnel pour le clivage du pri-microarn en pré-microarn. Dans ce complexe, DGCR8 interagit directement avec le pri-microarn en reconnaissant les boucles de mésappariement de la molécule d ARN, permettant ensuite à Drosha de cliver la molécule à onze nucléotides de la base et de former ainsi le pré-microarn (figure 6) (Han, Lee et al. 2006; Yeom, Lee et al. 2006) Exportation du précurseur du microarn vers le noyau La formation du précurseur des microarn a lieu dans le noyau, et la formation du microarn mature par DCR-1 a lieu dans le cytoplasme. L exportation nucléaire des précurseurs de microarn est assurée par Exportin-5 (Exp5), un membre de la famille des karyopherines qui nécessite l aide de RanGTP, comme la plupart des «cargos» d export nucléaire (Yi, Qin et al. 2003; Lund, Guttinger et al. 2004). Exp5 est reconnu pour exporter les courts ARN présentant une structure «mini-hélice» (Gwizdek, Ossareh-Nazari et al. 2003), comme les ARN de transfert. Les études ont montré que Exp5 se lie in vitro de façon directe et spécifique au pré-microarn humain, et ce, de façon dépendante à RanGTP, et qu une perte de fonction de cette protéine entraîne une diminution du niveau de microarn mature dans le cytoplasme (Yi, Qin et al. 2003; Lund, Guttinger et al. 2004). Il a été observé par la suite que Exp5 semble reconnaître la longueur du précurseur et l extrémité 3 cohésive de deux nucléotides avant de s y lier (Zeng and Cullen 2004). Il a été vu récemment chez l humain qu une fois exporté du noyau et maturé, un microarn peut être réimporté dans le noyau. C est le cas des microarn qui seraient impliqués dans la régulation de la transcription (Hwang, Wentzel et al. 2007). Cette étude démontre qu une séquence consensus en 3 du microarn mature permettrait sa localisation dans le noyau.

29 La voie des microarn Une fois dans le cytoplasme, le pré-microarn est pris en charge de façon similaire à l ARNdb initiant le RNAi, soit par un complexe Dicer qui formera un microarn mature qui a les mêmes caractéristiques qu un siarn (figure 7). Figure 7: Voie des microarn chez C. elegans. Le facteur d exportation et le facteur de reconnaissance du précurseur ne sont pas identifiés chez le ver. Les deux brins du microarn sont aussi désappariés et un seul s associera avec le complexe d Argonautes ALG-1/ALG-2. Ce nouveau complexe induira alors le blocage de la traduction des ARNm ciblés, contrairement au complexe RISC des siarn.

30 Complexe Dicer-Loqs Chez le ver, DCR-1 est nécessaire pour la maturation du microarn, en clivant le précurseur (Grishok, Pasquinelli et al. 2001; Hutvágner, McLachlan et al. 2001; Ketting, Fischer et al. 2001). Toutefois, la transformation du pré-microarn en microarn mature par DCR-1 nécessite une reconnaissance du précurseur par l endonucléase, comme l ARNdb initial du RNAi est reconnu par RDE-4. Pour les microarns, cette fonction est associée à TRBP chez les vertébrés, et à Loquacious (Loqs) chez la drosophile. Il n existe pas encore d homologue à ce facteur chez C. elegans, quoiqu il doit vraisemblablement être présent. La protéine de liaison à l ARNdb Loqs interagit avec Dcr-1 chez la drosophile, et la transformation du précurseur en microarn mature par Dcr-1 est dépendante de Loqs (Forstemann, Tomari et al. 2005; Saito, Ishizuka et al. 2005). Le mécanisme exact d action de Loqs n est pas encore connu, mais il est suggéré que Loqs et Dcr-1 formeraient un complexe analogue au complexe DCR-1/RDE-4 des siarn chez le ver, de même que le complexe Drosha/DGCR Les Argonautes ALG-1 et ALG-2 Parmi les 27 Argonautes trouvés chez C. elegans, seulement ALG-1 et ALG-2 sont, jusqu à ce jour, strictement associés à la voie des microarn. L altération de l expression des gènes alg-1 et alg-2 mène à un défaut sévère du développement (Grishok, Pasquinelli et al. 2001). En fait, les phénotypes observés sont identiques à ceux générés par la perte de fonction du microarn let-7. En plus, les niveaux des microarn let-7 et lin-4 diminuent lorsque les gènes alg-1 et alg-2 sont inhibés (Grishok, Pasquinelli et al. 2001). Les approches biochimiques ont démontré que le complexe ALG-1/ALG-2 est associé in vivo avec le microarn let-7 (Hutvágner, Simard et al. 2004), et nos observations indiquent que ces Argonautes interagissent avec plusieurs, sinon tous les microarn de C. elegans (E. L. Rondeau et M. J. Simard, donnés non publiées). Comme le complexe RISC des siarns, un brin du microarn s associe avec le complexe protéique ALG-1/ALG-2. En utilisant des stratégies de clonage pour identifier les microarn matures chez C. elegans, une étude a vu

31 22 une accumulation 100 fois plus grande du brin antisens du microarn que le brin sens (Lim, Lau et al. 2003). Il y aurait donc un processus qui déterminerait le choix du brin qui s associe avec l Argonaute, et qui entraînerait la déstabilisation de l autre brin. Effectivement, une étude a démontré que le brin qui fera partie du complexe est celui dont l extrémité 5 est moins fortement appariée à son brin complémentaire : c est la règle de l asymétrie, qui a été établie en étudiant l introduction in vitro des siarn dans le complexe RISC. (Schwarz, Hutvagner et al. 2003). ALG-1 et ALG-2 possèdent eux aussi le motif DDH (Yigit, Batista et al. 2006), quoique l action de ce complexe, pour la plupart du temps, n est pas de cliver l ARNm cible. En général, la voie des microarn mène au blocage de la traduction de l ARNm cible Le mécanisme d inhibition de l ARNm par les microarn Il a été découvert chez les premiers microarn décrits chez le nématode, lin-4 et let-7, qu ils se liaient de façon partiellement complémentaire à plusieurs endroits sur la région 3 UTR de leur ARNm cible respectifs lin-14 et lin-41 (Lee, Feinbaum et al. 1993; Wightman, Ha et al. 1993; Reinhart, Slack et al. 2000). Des études plus récentes ont conféré cette caractéristique à la plupart des microarn : les séquences «seed» de plusieurs microarn d invertébrés sont parfaitement complémentaires aux régions 3 UTR (Lai 2002). On observe des mésappariements entre les autres régions du microarn et son ARNm. Lorsque le microarn, en complexe avec les Argonautes, est lié partiellement au 3 UTR de l ARNm cible, l inhibition de l ARNm s initie. Et pour la voie des microarn, le mécanisme de cette inhibition est encore nébuleux. À l origine, il avait été suggéré que les microarn agissaient en bloquant la traduction de l ARNm après l étape de l initiation de la traduction. Les études de la régulation de lin-14 par lin-4 montrent que le niveau d ARNm lin-14 est faiblement affecté, contrairement à la protéine LIN-14 (Lee, Feinbaum et al. 1993). Aussi, l association du polysome à l ARNm lin-14 est inaltérée par l effet de lin-4, et le microarn est retrouvé avec les ribosomes et

32 23 l ARNm par cosédimentation (Olsen and Ambros 1999). Il en est de même pour le microarn let-7, qui se retrouve avec les ribosomes actifs (Nottrott, Simard et al. 2006). L idée suggérée est que le microarn pourrait induire la dégradation du polypeptide naissant. Une autre étude a suggéré que les microarn humains interfèrent avec le facteur d initiation eif4e, la coiffe et la queue poly-a de l ARNm (figure 8) (Humphreys, Westman et al. 2005). Figure 8: Inhibition de la synthèse protéique par les microarn. Le complexe Argonaute/microARN pourrait interférer avec le polypeptide naissant, avec la coiffe ou avec la queue poly-a. (Nottrott, Simard et al. 2006) En somme, un siarn induirait le clivage de l ARNm, alors que le microarn induirait le blocage de sa traduction. Une des premières différences entre le microarn et le siarn qui a été mis en cause est l appariement du court ARN avec son ARNm. Un microarn se lie de façon partiellement complémentaire à l ARNm, et le siarn s y lie avec une complémentarité parfaite. En modifiant une séquence de microarn afin qu elle soit parfaitement complémentaire à sa cible et en ajoutant des mésappariements à un siarn, il a été observé que le clivage endonucléolytique de l ARNm est généralement favorisé par un appariement parfait du court ARN avec sa cible (Hutvágner and Zamore 2002; Llave, Xie et al. 2002). En revanche, la présence de mésappariements privilégie le blocage de la traduction de l ARNm (Doench, Petersen et al. 2003; Saxena, Jonsson et al. 2003; Bartel 2004). En principe, le clivage du complexe RISC a lieu entre les nucléotides 10 et 11 du court ARN lié à sa cible. Le microarn a habituellement un mésappariement à cet endroit

33 24 (la région «seed» est en 5 ), ce qui pourrait empêcher un clivage (comme soulevé plus haut, ALG-1 et ALG-2 possèdent le motif DDH) (Pillai, Bhattacharyya et al. 2007). Il reste à savoir ce qui recrute les facteurs nécessaires à l inhibition de la traduction. Néanmoins, des études récentes ont montré que la dégradation de l ARNm peut être induite par les microarn. Deux groupes de recherche ont montré que les microarn peuvent initier la dégradation de leur ARNm, y compris les microarn lin-4 et let-7 (Bagga, Bracht et al. 2005; Lim, Lau et al. 2005). Au même moment, l implication de sites cytoplasmiques de dégradation et de stockage d ARNm, appelés les corps P (Processing bodies), dans la voie des microarn était révélé. En effet, les protéines Argonautes et les microarn sont retrouvés dans les corps P, dont ALG-1 qui interagit avec le facteur de colocalisation des corps P, AIN-1 (Ding, Spencer et al. 2005; Liu, Valencia-Sanchez et al. 2005; Pillai, Bhattacharyya et al. 2005). Ces résultats suggèrent que la dégradation de l ARNm a lieu. Par contre, il n est pas clarifié si cette dégradation est une cause de l inhibition de la traduction. Il est aussi possible que les microarn favorisent le stockage de l ARNm dans les corps P, empêchant ainsi sa traduction. Aujourd hui, le mécanisme de réponse par les microarn est encore confus. Les microarn peuvent affecter la traduction de l ARNm de même que sa stabilité, et ce, dans la plupart des cas, de façon combinée. Un modèle à deux étapes a donc été proposé : en premier lieu, le microarn réprimerait la traduction, puis il y aurait une accumulation du complexe microarn-arnm dans les corps P (Pillai, Bhattacharyya et al. 2007). Évidemment, beaucoup d études restent à faire afin d y apporter un peu plus de clarification. Les différentes voies d inhibition des gènes par les courts ARN sont similaires : chacune est enclenchée par un court ARN, nécéssite des protéines Argonautes et mène à l inhibition des gènes via l ARNm. Malgré ces ressemblances, ces voies sont aussi très différentes :

34 25 chaque molécule d ARNdb initiale présente une structure caractéristique, chaque voie possède ses propres protéines Argonautes et mène à une réponse différente. Ce mémoire présente notre cheminement afin de comprendre la restriction d une Argonaute à sa voie. Nous tenterons par la suite d apporter un peu plus de lumière sur la fonction des Argonautes reliées au microarn, afin de clarifier pourquoi les microarn induisent une réponse différente à celle des siarn.

35 2. La spécificité des protéines Argonautes pour la voie du RNAi ou du microarn n est pas déterminée par le type d ARNdb initial chez C. elegans 2.1 Injection d un ARNdb cohésif jouant le rôle d un microarn et d un siarn Nous avons vu que la voie de l exo-rnai et la voie des microarn possèdent leurs propres protéines Argonautes. Puisque ces protéines sont hautement homologues entre elles mais ne peuvent s interchanger dans les voies, nous avons voulu savoir ce qui restreint une Argonaute à sa voie métabolique. La première différence rencontrée entre ces deux voies est le type de molécule d ARNdb initial : le RNAi est initié par un ARNdb linéaire, et la voie des microarn par la présence d un ARNdb à structure «épingle à cheveux». Les travaux présentés dans l article suivant (Function of double-stranded triggers in the Argonaute selection for the microrna and RNAi pathways in C. elegans) montrent qu une molécule linéaire d ARNdb, contenant à la fois une «partie» microarn et une «partie» siarn, peut initier les deux voies. les résultats suggèrent que la spécificité fonctionnelle de l Argonaute à sa voie serait déterminée en aval de l étape d initiation.

36 27 Function of double-stranded triggers in the Argonaute selection for the microrna and RNAi pathways in C. elegans Marie-Eve L. Boisvert, Isabelle H. Banville and Martin J. Simard 1 Laval University Cancer Research Center, Hôtel-Dieu de Québec (CHUQ), Québec City, Québec G1R 2J6, Canada 1: Corresponding author Martin.Simard@crhdq.ulaval.ca Phone: , ext: Fax: Running title: Nature of the dsrna trigger does not affect Argonaute selection

37 28 SUMMARY In the RNAi pathway, fully base-paired dsrna triggers the production of small interfering RNAs (sirnas), which guide the destruction of complementary mrnas. In contrast, animal micrornas (mirnas) typically leads directly to translational repression of their mrna targets. mirnas are born from stem-loop precursors in which the double-stranded stem is only partially base-paired. In C. elegans, specific Argonaute proteins are dedicated to the RNAi and mirna pathways. RNAi requires the Argonaute protein RDE-1 [1, 2], whereas ALG-1 and ALG-2 bind mirnas [3] and are essential for mirna-directed regulation [4]. The restriction of sirnas and mirnas to specific Argonaute proteins might reflect the recognition of their distinct precursors by specific factors that imprint the small RNA, targeting it to the correct Argonaute protein. To test this idea, we designed a dsrna trigger containing both mirna and sirna sequences. This chimeric dsrna trigger both successfully rescued the loss of let-7 mirna function and initiated silencing of a specific gene by RNAi. We demonstrate that RDE-1, as well as the double-stranded RNA-binding protein RDE-4, are essential for RNAi induced by the chimeric trigger, yet are not required for silencing by the let-7 component of the trigger chimera. In contrast, the Argonaute protein ALG-2 is strictly required for the mirna function, but not for the sirna-directed gene silencing. We also find that the let-7 mirna generated from the chimeric trigger is short lived, whereas the RNAi response initiated by the same dsrna is sustained for a longer period. We conclude that the specificity of Argonaute proteins in the RNAi and the mirna pathways is not determined by the initial steps that generate the small RNA guides in these pathways but instead reflects their respective outcomes.

38 29 RESULTS AND DISCUSSION A small dsrna trigger able to enter both mirna and RNAi pathways In animals, the RNAi and the mirna pathways lead to different outcomes. The RNAi pathway degrades specifically the messenger RNA (mrna), which is fully complementary to the sirna embedded into the RISC complex while mirna, partially complementary to the untranslated region of the mrna, will abrogate protein synthesis without generally affecting mrna stability. Among the cellular factors associated to these processes, members of the Argonaute gene family are shown to be exclusively associated to either the mirna or the RNAi pathway. In Drosophila melanogaster, Ago1 is associated to mirna [5] and Ago2 is essential for the RNAi pathway [6]. In the nematode Caenorhabditis elegans, genetic studies demonstrated that the Argonaute rde-1 gene is strictly required for RNAi [1] and two Argonaute family members alg-1 and alg-2 are essential for the mirna pathway and have no role into the RNAi pathway [4]. Furthermore, recent biochemical data have revealed that RDE-1 is associated to sirna [2] and ALG-1 and ALG-2 are associated to mirna [3]. One reason of this disparity could be that trigger molecules are recognized by specific factors that imprint the RNA molecule and guide it to the appropriate Argonaute protein as well as to the appropriate outcome. In order to address if the double-stranded RNA (dsrna) trigger may guide the proper requirement of Argonautes genes, we have designed a small dsrna molecule that contains both the let-7 mirna sequence and a sirna that can silence the gfp gene (Figure 1A). To monitor the capacity of the chimeric dsrna molecule to generate a functional mirna function, we used a C. elegans strain that carries a thermosensitive (ts) allele of the let-7 mirna gene [7]. We can then provided functional copies of let-7 mirna by injecting the

39 30 chimeric dsrna into the animals and observe if we can rescue the let-7 loss-of-function phenotypes at non-permissive temperature (Figure 1B). When larvae stage animals are shifted at 25 C, the majority of let-7ts animals displays bursting vulva phenotype and only 15% of the shifted animals injected with unrelated dsrna do provide F1 progeny (Figure 1C). In contrast, when the let-7ts animals are injected with the dsrna chimeric trigger and then shifted at non-permissive temperature, nearly 60% of these animals had progeny (Figure 1C). Thus, our data indicate that a fully complementary double-stranded trigger can efficiently rescue the loss-of-function of a specific mirna. We next examined the potential of the dsrna chimeric molecule to enter the RNAi pathway and initiate a specific RNA silencing response. The designed dsrna trigger contains a sirna which is fully complementary to a 21 nucleotides region of the gfp mrna. When transgenic animals carrying the gfp gene are injected with the trigger chimera, the green fluorescence rapidly disappeared into the animal body (Figure 1D). To confirm that the RNAi pathway mediates the GFP silencing, we injected the dsrna molecule in animals carrying a null allele of the rde-4 gene, an essential component of the RNAi in C. elegans [8]. In these animals, the injection of the chimeric dsrna trigger did not affect the fluorescence level observed in the animal (Figure 1D), indicating that the GFP sirna produced from the processing of the chimeric dsrna is entering the RNAi pathway to efficiently silence the targeted mrna. Interestingly, we also observed that the rescue of the let-7ts animals with the dsrna molecule only last less than seventy-two hours (Figure 2). In contrast, the same dsrna initiates an RNAi response that can be maintained throughout the entire lifespan of the

40 31 injected animals (Figure 1D, data not shown). These data support that the mirna complex has an extremely rapid turnover while the sirna complex may be use for multiple round of mrna cleavage and thus the cleavage will initiate the amplification of the RNAi response by RNA-dependent RNA polymerase [9, 10]. Thus, our data indicate that we have successfully generated a dsrna trigger that can generate both functional mirna and sirna molecules. The dsrna trigger does not guide the specific requirement of Argonaute genes In RNAi, a perfectly base-paired dsrna molecule initiates the targeted mrna degradation. In contrast, the imperfect stem-loop structure of the mirna leads to translational inhibition. Since we have generated a chimeric dsrna that can efficiently produce mirna as well as sirna molecules, we can thus address if these molecular characteristics of the dsrna trigger can affect the selection of the Argonaute proteins associated with the small RNA species. In previous studies, we have shown that the Argonaute RDE-1 is interacting with sirnas [2] while ALG-1 and ALG-2 Argonaute proteins are associated with the let-7 mirna [3]. We thus generated let-7ts strains carrying either defective copies of the rde-1 gene or defective copies of alg-2 gene and address if rde-1 and/or alg-2 are important for the let-7 rescue by the chimeric dsrna molecule. Despite the fact the dsrna provided is perfectly base-paired, the rescue of the let-7 mirna does not require the rde-1 gene but necessitate the presence of alg-2 (Figure 1C). The weak let-7 rescue observed in alg-2 mutant reflects the contribution of alg-1, the closest homolog alg-2, also required for the microrna pathway [4]. We then conclude that the nature of the dsrna molecule that will generate the functional mirna does not play a

41 32 critical role in the Argonaute protein selection. On the other hand, we also tested the Argonaute proteins requirement for the RNAiinduced response by the trigger chimera. When GFP positive animals carrying null alleles of alg-2 gene are injected with the dsrna trigger, we observed a complete disappearance of the green fluorescent signal as observed for the wild-type animals expressing GFP (Figure 1D). However, when the animals are lacking functional alleles of the rde-1 gene, the dsrna trigger is unable to abolish the expression of the green fluorescence protein (Figure 1D). Thus, these observations confirm that RDE-1 is essential for the RNAi pathway in C. elegans and that ALG-2 is not implicated in this biochemical process. Our data demonstrate that despite the fact that we are using the same dsrna to generate small RNA molecules able to enter in both mirna and RNAi pathways, the specific requirement of the Argonaute genes is not altered. Thus, it strongly suggests that the nature of the dsrna trigger is not influencing the choice of the Argonaute genes for the mirna and the RNAi pathways. The outcomes of the Argonaute/small RNA complex seem mediated at the target level The Argonaute proteins are essential for mainly all RNA silencing pathways including the RNAi and microrna pathways discovered so far in eukaryotes. The presence of many members of this gene family may suggest specific roles associated to every member. In mammals, all four Argonaute proteins are able to bind mirnas and sirnas, but only hago2 has the capacity to induce endonucleolytic cleavage of the targeted mrna [11, 12]. This difference may be explained molecularly because only hago2 possesses the catalytic residues essential for the slicing activity in its Piwi domain [13]. In flies, ago1 mutants

42 33 are defective in mirna pathway but not in sirna-directed cleavage, whereas ago2 mutants are defective in RNAi pathway but not in mirna silencing [5]. As observed in flies, C. elegans has distinct requirement for Argonaute proteins in sirna or mirna-directed RNA silencing. Genetic studies have demonstrated that the Argonaute RDE-1 is essential for the RNAi pathway [1] while ALG-1/ALG-2 are important for the mirna pathway [4]. Moreover, the overexpression of Argonautes required for the mirna pathway cannot rescue the loss of the rde-1 gene for the RNAi response [2]. To explain this Argonaute specificity, we hypothesized that the molecular nature of the dsrna trigger may be crucial for the Argonaute choice. However, our current findings demonstrate that the source of the dsrna trigger is not affecting the preference of the Argonaute protein association with either the mirna or the sirna pathways. In contrast with mammalian Argonaute proteins, both Piwi domains of RDE-1 and ALGs Argonautes display the critical amino acids for endonucleolytic cleavage [2]. Therefore, their specific requirements for the RNAi or the mirna pathways cannot be explain by this unique molecular activity. Instead, the association with the targeted mrnas seems important to determine the proper Argonaute protein. The exclusive functionality of Argonaute proteins in C. elegans in the RNAi and microrna pathways may be attributed to unique molecular partners for RDE-1 and ALGs as previously observed for human Ago1 and Ago2 [14]. These specific interactions may occur prior to the interaction or when the Argonaute/small RNA complex interacts with the mrna target (Figure 3). We propose that as observed in mammals, Argonaute proteins in C. elegans can bind nonspecifically to any small RNA molecules generated by Dicer RNAseIII enzyme. For RDE-1

43 34 the specificity for RNAi pathway may come from RDE-4, a double-stranded RNA binding protein found in complex with RDE-1 [8, 15], or any other cellular factors required for the RNAi pathway. On the other hand, the specific requirement for RDE-1 and ALG-2 in their respective silencing pathways may be guided by interactions with cellular components already associated with mrna targets. We believe that extensive biochemical studies and complex analysis of the Argonaute ALGs and RDE-1 proteins will elucidate how they can respectively altered protein synthesis mediated by micrornas and mediate specific mrna degradation guided by sirnas. ACKNOWLEDGMENTS We would like to thank Dr Darryl Conte, Dr Jean-Yves Masson and members of the laboratory for comments on the manuscript. This work has been funded by the Canadian Institutes of Health Research (MOP-81186). M.E.L.B. is supported by a fellowship from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) and M.J.S. is holding a Junior 1 scholarship from the Fonds en Recherche de la Santé du Québec (FRSQ).

44 35 FIGURE AND LEGENDS Figure 1. A unique chimeric dsrna molecule triggers both microrna and RNAi pathways in C. elegans. (A) Diagram of the chimeric double-stranded RNA trigger. Chemically synthesized RNA oligos (IDT) have been annealed to generate the dsrna molecule that contains let-7 microrna (black strand) and a sirna targeting GFP mrna (green strand). Presence of two nucleotides 3 overhang insures precise cleavage by Dicer in order to generate 21nt functional let-7 mirna and GFP sirna [16]. The Wobble base pairing found in the hairpin let-7 mirna precursor molecule [17] has been transferred in the chimeric dsrna molecule structure to favor the loading of the let-7 mirna into the mirisc complex. The asymmetry rule [18] has also been observed for the design of the portion of the dsrna

45 36 molecule that generates the GFP sirna. (B) Schematic representation of the let-7 mirna rescue experiments. L4 larvae stage let-7 (n2853) and other relative double mutant animal strains, which carry thermosensitive allele of let-7 mirna gene, have been injected with the chimeric dsrna (2 mg/ml) at permissive temperature. After three hours recovery, animals are placed at non-permissive temperature and phenotypes are observed after 24hrs post-injection. (C) dsrna molecule rescues let-7 mirna function. The animals generating more than three F1 progeny are scored as rescued. As a control, let-7ts animals have been injected with an unrelated 42 bp dsrna (control). (D) The chimeric dsrna molecule initiates RNAi response. Various GFP expressing animals (pes-10::gfp strain) are injected as described in (B). The GFP signal is monitored with a GFP stereomicroscope in at least fifteen animals per strain. The (+) indicates that the RNAi is functional (absence of GFP signal) while (-) indicates that the RNAi is deficient (strong expression of GFP) in animals. Seventy-two hours after the dsrna injection, the GFP signal is still undetectable under the microscope. Animals used to generate the studied strains are: rde-1 (ne300), rde-4 (ne337) and alg-2 (ok304).

46 37 Figure 2. The microrna rescue is rapidly attenuated. Viable animals are scored every 24 hours after being transferred at non-permissive temperature (25 C). While nearly all animals from the let-7ts strain died after 48hrs at non-permissive temperature from a burst vulva [7] (grey bars), the phenotype is delayed in animals injected with chimeric dsrna molecule (black bars). All injected animals displayed busting vulva phenotype after 72 h. Numbers of animals observed are indicated.

47 38 Figure 3. microrna or RNAi pathway: everything is chosen down the line. The dsrna molecule can be cleaved by either the ALG-1/ALG-2 (ALG)/Dicer complex or the RDE-1/Dicer complex (evidence exists for these complexes [8, 15]). Once processed, the sirna and mirna molecule can be associated to either RDE-1 or ALG Argonaute protein. The functionality of the Argonaute protein in either the microrna pathway (left panel) or the RNAi pathway (right panel) can be mediated by specific interactions with cellular factors associated with the targeted mrna (X factor on the left panel) or by direct interaction with the Argonaute protein prior to the interaction with the mrna (pink object). Thus, it is only when the small RNA/Argonaute complex is associated to the target

48 39 and interacts with specific factors that the translational repression or the mrna cleavage and degradation take place. To maintain the RNAi response for an extent period of time, RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) can maintain the silencing of the targeted mrna (not shown) and the sirna/rde-1 complex may be recycled (dashed arrow on the right panel) to generate multiple templates for RdRP (model described in detail in [2]). REFERENCES 1. Tabara, H., Sarkissian, M., Kelly, W.G., Fleenor, J., Grishok, A., Timmons, L., Fire, A., and Mello, C.C. (1999). The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell 99, Yigit, E., Batista, P.J., Bei, Y., Pang, K.M., Chen, C.C., Tolia, N.H., Joshua-Tor, L., Mitani, S., Simard, M.J., and Mello, C.C. (2006). Analysis of the C. elegans Argonaute family reveals that distinct Argonautes act sequentially during RNAi. Cell 127, Hutvágner, G., Simard, M.J., Mello, C.C., and Zamore, P.D. (2004). Sequencespecific inhibition of small RNA function. PLoS Biol 2, E Grishok, A., Pasquinelli, A.E., Conte, D., Li, N., Parrish, S., Ha, I., Baillie, D.L., Fire, A., Ruvkun, G., and Mello, C.C. (2001). Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small temporal RNAs that control C. elegans developmental timing. Cell 106, Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., and Siomi, M.C. (2004). Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev 18,

49 40 6. Hammond, S.M., Boettcher, S., Caudy, A.A., Kobayashi, R., and Hannon, G.J. (2001). Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science 293, Reinhart, B.J., Slack, F.J., Basson, M., Pasquinelli, A.E., Bettinger, J.C., Rougvie, A.E., Horvitz, H.R., and Ruvkun, G. (2000). The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature 403, Tabara, H., Yigit, E., Siomi, H., and Mello, C.C. (2002). The dsrna binding protein RDE-4 interacts with RDE-1, DCR-1, and a DExH-box helicase to direct RNAi in C. elegans. Cell 109, Pak, J., and Fire, A. (2007). Distinct populations of primary and secondary effectors during RNAi in C. elegans. Science 315, Sijen, T., Steiner, F.A., Thijssen, K.L., and Plasterk, R.H. (2007). Secondary sirnas result from unprimed RNA synthesis and form a distinct class. Science 315, Meister, G., Landthaler, M., Patkaniowska, A., Dorsett, Y., Teng, G., and Tuschl, T. (2004). Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by mirnas and sirnas. Mol Cell 15, Liu, J., Carmell, M.A., Rivas, F.V., Marsden, C.G., Thomson, J.M., Song, J.J., Hammond, S.M., Joshua-Tor, L., and Hannon, G.J. (2004). Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science 305, Rivas, F.V., Tolia, N.H., Song, J.J., Aragon, J.P., Liu, J., Hannon, G.J., and Joshua- Tor, L. (2005). Purified Argonaute2 and an sirna form recombinant human RISC. Nat Struct Mol Biol 12,

50 Meister, G., Landthaler, M., Peters, L., Chen, P.Y., Urlaub, H., Luhrmann, R., and Tuschl, T. (2005). Identification of novel argonaute-associated proteins. Curr Biol 15, Duchaine, T.F., Wohlschlegel, J.A., Kennedy, S., Bei, Y., Conte, D., Jr., Pang, K., Brownell, D.R., Harding, S., Mitani, S., Ruvkun, G., et al. (2006). Functional proteomics reveals the biochemical niche of C. elegans DCR-1 in multiple small- RNA-mediated pathways. Cell 124, Han, J., Lee, Y., Yeom, K.H., Nam, J.W., Heo, I., Rhee, J.K., Sohn, S.Y., Cho, Y., Zhang, B.T., and Kim, V.N. (2006). Molecular basis for the recognition of primary micrornas by the Drosha-DGCR8 complex. Cell 125, Pasquinelli, A.E., Reinhart, B.J., Slack, F., Martindale, M.Q., Kuroda, M.I., Maller, B., Hayward, D.C., Ball, E.E., Degnan, B., Muller, P., et al. (2000). Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature 408, Schwarz, D.S., Hutvagner, G., Du, T., Xu, Z., Aronin, N., and Zamore, P.D. (2003). Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115,

51 Introduction d un microarn ciblant le gène gfp Parallèlement à l étude d une séquence d un microarn ayant la structure d un ARNdb linéaire, nous avons voulu observer le comportement d un ARNdb ciblant l ARNm gfp et ayant la structure «épingle à cheveux» d un pré-microarn (figure 9a). Cette séquence gfp retrouvée dans le microarn est parfaitement complémentaire à l ARNm cible exprimé dans la souche. Nous voulions savoir si cette molécule d ARN emprunte la voie du RNAi ou la voie des microarn. Deux souches préparées par D r Martin Simard ont été utilisées pour cette expérience, soit une souche exprimant le pré-microarn gfp (pes-10 ::gfp in[hsp-16 ::pngfp, rol 6]) et une souche mutante pour le gène rde-4 (pes-10 ::gfp; rde- 4(ne337) in[hsp-16 ::pngfp, rol 6]), exprimant aussi la molécule artificielle. L utilisation de cette souche mutante permet de voir si la voie du RNAi est impliqué dans le processus, comme utilisé dans la section Détermination de la température optimale d induction La séquence primaire du microarn gfp a été conçu d après la séquence du gène let-7 (Pasquinelli, Reinhart et al. 2000). On retrouve les mésappariements approximativement aux mêmes endroits, facilitant ainsi la reconnaissance du pri-microarn par DGCR8 (figure 9a). Le gène du microarn gfp est sous le contrôle du promoteur hsp-16, donc inductible par choc thermique. Nous devions donc trouver la température optimale permettant la plus forte induction du gène portant le microarn artificiel. Bien que la température idéale pour le ver soit 25 C, ces souches sont gardées à 15 C afin de s assurer que les vers ne subissent aucun choc thermique. Environ vers de la souche pes- 10 ::gfp in[hsp-16 ::pngfp, rol 6] au stade jeune adulte ont été mis à différentes températures (30, 32 et 35 C) et à différents temps d incubation (4, 8 et 24 h) et comparés aux animaux gardés à 15 C (figure 9b). Le temps d incubation idéal a été fixé à 24 h. Les temps de 8 h et 12 h ne donnaient pas de distinction entre les niveaux d expression du microarn à différentes températures (données non montrées). De plus, les vers sont

52 43 affectés par les hautes températures et 35 C est une température non viable pour eux. On voit à la figure 9b un plus haut niveau d expression du microarn gfp lors d une incubation à 32 C que lorsque la température est à 30 C, et qu il n y a pas d induction à 15 C. Le choc thermique est donc optimal à 32 C, pendant 24 heures. Figure 9: Induction du microarn gfp. (A) Séquence et structure du pri-microarn let-7 et gfp. La séquence du microarn ciblant l ARNm est entre les crochets verts. (B) Révélation par immunobuvardage de type Northern de l induction du microarn, suite à un choc thermique à 30 et 32 C. Les microarn ne sont pas induits quand l animal est conservé à 15 C. Le pré-microarn est à environ 70 nucléotides, et le microarn est de 21 nucléotides.

53 Détection de l ARNm cible Une fois que nous étions assurés que le pré-microarn est exprimé et transformé en microarn, nous voulions savoir ce qu il advenait de l ARNm cible. Puisque le microarn est parfaitement complémentaire à sa cible, l ARNm cible devrait être dégradé. Nous avons donc approché cette question en examinant le niveau d ARNm du gène gfp présent dans un organisme ayant subi le choc thermique et en le comparant avec un animal non induit. Par contre, plusieurs étapes d optimisation étaient requises pour réaliser cette expérience : la quantité de vers nécessaire à la détection d un signal, l extraction de l ARN, l élimination des contaminants et le PCR en temps réel. L optimisation n est pas présentement assez avancée pour permettre l évaluation des variations des quantités d ARNm de gfp suite à l induction du microarn. 2.3 Matériels et méthodes Formation de la molécule d ARNdb let-7gfp Les deux brins sens et antisens de la molécule de 44 nucléotides ont été obtenu par la compagnie IDT, et les séquences sont décrites à la figure 1 de Boisvert et al. Les brins sont dilués dans l eau à une concentration finale de 2 µg/µl. Les brins sens et antisens sont mélangés à une proportion 1 :1 et incubés à 90 C pour une minute. La solution est ensuite transférée à 37 C pour une heure. 1 µg de cette solution finale est déposé sur gel d acrylamide d une concentration de 20 %, afin de vérifier la pureté de la molécule Souches de C. elegans Les souches utilisées dans ces expériences sont let-7 ts (n2853), let-7 ts (n2853); rde-1(ne300), let-7 ts (n2853); rde-4(ne337) et let-7 ts (n2853); alg-2(ok304). La souche let-7 ts porte une mutation dans l allèle let-7, causant sa perte de fonction à température non permissive (25 C). Les souches mutantes pour les gènes rde-1 et rde-4 ont été obtenues par croisement génétique classique. Environ 2 mâles let-7 ts pour 3 hermaphrodites ne300 en stade L4 sont mis sur un pétri avec peu de nourriture, ce qui favorise l accouplement. Ce pétri est incubé à 15 C pour environ 2 jours, ou jusqu à ce que les hermaphrodites commencent à pondre. Celles-ci sont séparées sur pétri unique, et celles ayant une progéniture constituée de mâles

54 45 à 50 % sont suivies pour la suite du croisement. Les vers fécondés par un mâle donnent une progéniture à 50 % de mâles, et un ver autofécondé donne un mâle sur 500. Environ 40 larves F1 des hermaphrodites fécondées sont incubées à 25 C pour 24 h. Les vers ne présentant pas le phénotype let-7 sont hétérozygotes pour la thermosensibilité et sont donc transférés à température permissive (15 C). Ces vers sont aussi hétérozygotes pour la mutation rde-1. Environ 100 F2 sont nourris par une souche E. coli L4440 exprimant l ARNdb ciblant le gène musculaire unc-22. Si l allèle de type sauvage de rde-1 est présent, la voie de l exo-rnai fonctionne et les animaux présentent le phénotype unc-22, soit la paralysie. Si le ver est homozygote pour l allèle muté de rde-1, la voie du RNAi est affectée par la perte de fonction de rde-1 et donc les vers devraient se comporter normalement. Environ dix vers de la génération F3 de chaque F2 ne présentant pas le phénotype unc-22 sont ensuite transférés à température non permissive. Les F3 qui ne survivent pas sont donc issus de la souche que nous recherchons, soit let-7 ts ; rde-1(ne300). Nous avons procédé de la même façon pour la souche let-7 ts ; rde-4(ne337). Toutefois, la dernière étape est différente pour la souche let-7 ts (n2853); alg-2(ok304). Puisque alg-2 n est pas impliqué dans le RNAi, on ne peut utiliser la nourriture unc-22. Après avoir sélectionné les F2 hétérozygote pour l allèle let-7 ts, ceux-ci sont mis sur la nourriture conventionnelle du ver, soit la souche E. coli OP50, jusqu à ce qu ils aient généré les F3. La présence de la mutation dans le gène alg-2 dans les vers F2 est ensuite vérifiée par analyse PCR (Amorce 5 : tct gag ttt ggc tcg atg tg. Amorce 3 : atg ttc ctt gga tac cag cg). Les vers mutants alg-2(ok304) sont sélectionnés et dix F3 de chacun sont aussi analysés par PCR. La souche homozygote pour la mutation est choisie. Nous avons aussi créé les souches pes-10 ::gfp; rde-1(ne300), pes-10 ::gfp; rde-4(ne337) et pes-10 ::gfp; alg-2(ok304). Avec la souche pes-10 ::gfp; rde-1(ne300) en exemple, nous avons procédé de la même façon que les souches précédentes, avec 10 mâles pes-10 ::gfp pour 20 femelles rde-1(ne300). Environ 40 F1 provenant d hermaphrodites fécondées sont mis sur pétri unique, et environ 50 F2 en stade L2 exprimant bien la protéine GFP sont nourris avec la souche bactérienne unc-22. Les vers ne présentant pas le phénotype unc-22 proviennent de la souche désirée. Nous avons fait de même pour pes-10 ::gfp; rde-

55 46 4(ne337). Pour la souche pes-10 ::gfp; alg-2(ok304), nous avons procédé de la même façon que décrit pour la souche let-7 ts (n2853); alg-2(ok304) Injection de l ARNdb let-7gfp Les souches thermosensibles sont conservées à la température permissive de 15 C. L ARNdb est introduit dans le ver en stade L3 par micro-injection, à une concentration de 2 µg/µl. Les vers injectés sont ensuite incubés à température pièce pour environ 3 h, puis les survivants sont transférés à 25 C pour au moins 24 h. On procède de la même façon pour les contrôles (vers non injectés), excepté l étape de l injection. Les observations sont ensuite effectuées à tous les 24 h. Pour les souches let-7 ts, la présence de plus de 3 larves F1 constitue un résultat positif. Quant aux souches pes-10 ::gfp, on compare par microscopie la diminution de la protéine GFP du ver injecté au niveau de GFP du ver non injecté Détection du microarn gfp Synchronisation des vers La souche pes-10 ::gfp in[hsp-16 ::pngfp, rol 6] est tout d abord synchronisée afin d avoir les vers au même stade. 15 ml de solution M9 (22 mm KH 2 PO 4, 42 mm Na 2 HPO 4, 86 mm NaCl, 1 mm MgSO 4 ) sont déposés sur le pétri contenant une grande quantité de vers adultes porteurs d embryons, puis récupérés. La solution est centrifugée à 2800 rpm pour 30 secondes et le surnageant est jeté. 10 ml de la solution de synchronisation (11 % hypochlorite, 250 mm KOH) est ajouté au culot de vers et le tout est brassé vigoureusement pendant 2 minutes. La solution est recentrifugée, le surnageant est discarté et 10 ml de la solution de synchronisation est ajouté. Le tout est brassé vigoureusement jusqu à ce que la lyse des vers adultes soit presque totale. Le culot est ensuite rincé 3 fois avec la solution M9. Le culot lavé est suspendu dans 10 ml de M9 et laissé sur la plaque agitatrice pour 24 h, à température pièce. Cette solution ne contient que les oeufs qui étaient à l intérieur des adultes, et ils écloront durant cette dernière incubation.

56 Extraction des microarn gfp Environ vers synchronisés en stade jeune adulte (sans oeufs) sont déposés sur pétri et soumis aux différents chocs thermiques (24 h à 30 C et 32 C), dont un pétri contrôle qui est conservé à 15 C. L extraction des microarn est effectué à l aide du kit mirvana TM mirna Isolation de la compagnie Ambion. En bref, les vers sont lysés à l aide du piston de type Dounce dans la solution de lyse fournie par Ambion, et on procède à une extraction phénol/chloroforme. À la phase aqueuse, un tiers du volume d éthanol est ajouté et le tout est déposé sur le filtre fourni par la compagnie. Le filtrat est recueilli, 2/3 du volume en éthanol sont ajoutés et le tout est repassé au filtre. On procède à trois lavages puis à l élution, qui recueille les petits ARN inférieurs à 200 nucléotides Révélation par immunobuvardage de type Northern La préparation de la sonde radioactive a été élaborée à partir du protocole de Maxiscript TM In Vitro Transcription de la compagnie Ambion. La matrice d ADN a été obtenue en digérant par HindIII le plasmide GFP-5x utilisé par (Yigit, Batista et al. 2006). Dans un volume final de 20 µl, on utilise 1 µg de matrice d ADN, 1x de tampon de transcription (fourni par Ambion), 0,5 mm de chaque nucléotide (ATP, GTP, CTP), 50 µci de UTP radioactif et 2 µl de l ARN polymérase T7 fournie par Ambion. Ce mélange est incubé 1 h à 37 C, puis 2 U de DNase I y est ajoutée. Après une incubation de 15 minutes à 37 C, la solution est déposée sur résine Sephadex G-25 (Roche). Après purification, 2,4 µm de Na 2 CO 3 et 1,6 µm de NaHCO 3 sont ajoutés et le tout est incubé à 65 C pour 1 h afin d hydrolyser la sonde et d ainsi augmenter sa spécificité. Finalement, 0,5 % d acide acétique et 3,6 µm de NaOAc sont ajoutés au mélange, ce qui arrête l hydrolyse de la sonde. L extrait de courts ARN des vers obtenu par le kit mirvana est migré sur gel dénaturant de 15 %, puis transféré sur une membrane Hybond-N (Amersham /GE). La membrane est fixée et les microarn sont révélés par hybridation de la sonde radioactive à la membrane, comme décrit dans (Hutvágner, Simard et al. 2004).

57 48 3. Identification de facteurs interagissant avec les Argonautes ALG-1 et ALG-2 Nous avons vu que la voie du RNAi et la voie des microarn sont deux voies bien distinctes, qui répondent différemment à la présence d un ARNdb. Nous voulons donc comprendre les fonctions des protéines Argonautes dans chacun des mécanismes, à commencer par les protéines ALG-1 et ALG-2. Quand ces Argonautes entrent en jeu, le résultat usuel est le blocage de la traduction. Il a été vu que les microarn let-7 (Hutvágner, Simard et al. 2004) et lin-4 (donnée non publiée) se retrouvent en complexe avec ALG-1 et ALG-2. Ici, nous tentons tout d abord de montrer que l ARNm ciblé par les microarn se retrouve lui aussi en complexe avec ALG-1/ALG-2. En second lieu, nous tentons d identifier des facteurs protéiques interagissant potentiellement au complexe ALG-1/ALG- 2, dont le mécanisme d action est pratiquement inconnu. Par le fait même, puisque nous savons que presque tous les microarn sont en complexe avec ALG-1/ALG-2 (E. Rondeau et M.J. Simard, non publié), le fait de retrouver l ARNm cible dans ce même complexe pourrait nous servir d outil afin d identifier les cibles potentiels des microarn. 3.1 Détection de l ARNm cible associé au complexe ALG- 1/ALG-2 Puisque les microarn se lient à ALG-1 et ALG-2 et forment ainsi un complexe semblable au RISC, nous avons voulu savoir si l ARNm cible est aussi retrouvé dans ce complexe, ce qui pourrait apporter un peu plus de lumière sur le mécanisme d action du complexe ALG- 1/ALG-2 dans l inhibition de l ARNm par les microarn Essais primaires d amplification de lin-14 et lin-41 Nous avons commencé par une immunoprécipitation du complexe ALG-1/ALG-2, à partir de deux souches différentes. Nous avons effectué une extraction protéique d une souche de vers (stade jeune adulte) exprimant la protéine GFP ::ALG-1 (pha-1 ts (l2123)ex[alg-1

58 49 p ::gfp ::alg-1; pha-1]) et d une autre exprimant la protéine GFP ::ALG-2 (pha- 1 ts (l2123)ex[alg-2 p ::gfp ::alg-2; pha-1]). En principe, nous devrions obtenir sensiblement le même résultat de ces deux souches, puisque ALG-1 et ALG-2 sont associés (données non publiées). Suite à l immunoprécipitation, nous avons extrait l ARN présent dans le culot précipité (figure 10). Figure 10: Schéma de l'expérience d immunoprécipitation. L immunoprécipitation (IP) est effectué avec des anticorps anti-gfp. Cet ARN a ensuite été transformé en ADN complémentaire (ADNc). Nous avons premièrement tenté d amplifier par PCR les ADNc des ARNm lin-14 et lin-41, les cibles respectives des microarn lin-4 et let-7. Malheureusement, il n y avait aucun signal, et ce, autant dans l extrait immunoprécipité que dans l extrait total (données non montrées). Il est possible que le complexe ALG-1/ALG-2 et ARNm soit instable, alors nous avons effectué un pontage au bleu de méthylène de l extrait protéique avant de réaliser l immunoprécipitation. Encore une fois, nous obtenions le même résultat par PCR et par PCR en temps réel (données non montrées). Nous avons ensuite tenté les techniques d immunobuvardages de type Southern et de type Northern. Par Southern (figure 11a), on voit l ADNc de lin-14 seulement dans l extrait total d ADNc (contrôle positif), et des produits de dégradation dans les autres échantillons précipités. Puisque le Northern révèle directement l ARN extrait du culot immunoprécipité, sans passer par l étape de la transcription inverse, la détection des ARNm cible devrait être plus sensible. À la figure 11b, on peut voir que lin-14 est détecté dans le contrôle positif, et qu une traînée de

59 50 dégradation est observée dans le puits contenant l extrait total. Par contre, ces deux techniques ne nous révèlent pas la présence de l ARNm lin-14 parmi le complexe ALG- 1/ALG-2. Ces résultats suggèrent toutefois que l ARNm recherché serait dégradé, et donc indétectable. Figure 11 : Essai de détection de l ARNm lin-14 dans le complexe ALG-1/ALG-2. lin-14 migre à une taille de 1,5 kb. L ARN total (ARN tot) est considéré comme le contrôle positif, et provient d une population de vers non synchronisés. L Input est l échantillon total, avant l immunoprécipitation. l échantillon IP est le culot immunoprécipité. N2 est la souche sauvage, A1 est la souche exprimant gfp ::alg-1 et A2 est celle exprimant gfp ::alg- 2. (A) Southern blot de l ADNc créé suite à l extraction d ARN total du culot issu de l immunoprécipitation. (B) Northern blot de l ARN extrait des culots immunoprécipités Inhibition de la dégradation des ARNm lin-28 et lin-41 L étude de Bagga et al. qui a été publiée au moment de nos expériences montre que les ARNm cibles de lin-4 et de let-7 seraient dégradés à leur stade d entrée en fonction, soit en stade larvaire L2 pour lin-4, et en stade larvaire L4 pour let-7 (Bagga, Bracht et al. 2005). Ils ont aussi noté l activité du gène Y48B6A.3, qui encode l exonucléase 5-3 XRN-2. En absence de ce gène, les ARNm lin-14, lin-28 et lin-41 ne sont plus dégradés (Bagga, Bracht et al. 2005). Ces résultats concordent avec ce que nous avons obtenu à la figure 11. Nous avons donc fait croître la souche sauvage de C. elegans (N2) sur une culture bactérienne exprimant l ARNdb ciblant le gène xrn-2, comme décrit dans Bagga et al. Nous avons

60 51 ensuite procédé à l extraction d ARN d un extrait protéique de 4 mg, une fois les animaux au stade de jeune adulte. Pour une question de commodité des conditions de réaction, les ARNm recherchés sont lin-28 et lin-41. Figure 12: Détection des ARNm lin-28 et lin-41 par PCR en temps réel dans une population de C. elegans exposée au RNAi contre xrn-2. L ARN a été extrait d une population de vers N2 (souche sauvage) exposée au RNAi (N2 +) et non exposée (N2 -), puis transformé en ADNc par transcription inverse. Le contrôle positif (ctl) est une banque d ADNc extrait de vers non synchronisés non exposé au RNAi contre xrn-2. Un fragment d ARNm de l actine est amplifié à un niveau similaire dans chaque échantillon. Nous montrons à la figure 12 que lin-28 est détecté dans un extrait provenant de vers dont le gène xrn-2 a perdu sa fonction, mais que lin-28 n est pas décelé lorsque l exonucléase de xrn-2 n est pas inhibé. Quant à lin-41, il est enrichi dans un ver exposé au RNAi contre xrn-2, mais on le retrouve en moins grande quantité dans un échantillon non exposé. On retrouve les ARNm dans les contrôles positifs, puisque ceux-ci proviennent de vers non synchronisés (à tous les stades du développement) et donc de vers dont les ARNm ne sont pas encore inhibés. Donc, en faisant croître les souches exprimant gfp ::alg1 et gfp ::alg-2 sur une nourriture ciblant xrn-2 par RNAi, nous augmentons nos chances de déceler si les ARNm cibles interagissent avec le complexe ALG-1/ALG Optimisation de la détection de l ARNm cible dans le complexe ALG Nous avons tout d abord effectué l expérience avec la souche produisant la protéine GFP ::ALG-1. Après croissance sur la nourriture bloquant le gène xrn-2, nous avons effectué les étapes décrites à la figure 10. Toutefois, nous avons préalablement vérifié la

61 52 présence des ARNm cibles dans les extraits totaux (input), avant l étape de l immunoprécipitation (figure 13a). Figure 13: Présence des ARNm lin-28 et lin-41 dans les extraits totaux avant l immunoprécipitation. (A) Suite à l extraction protéique des souches pha-1 ts (l2123)ex[alg- 1 p ::gfp ::alg-1; pha-1] (A1) et N2, l ARN a été extrait, transformé en ADNc et amplifié par PCR en temps réel. À titre de contrôle, les puits A1- et N2- contiennent les échantillons d ARN dont la reverse transcriptase n a pas été ajouté durant l étape de la transcription inverse. L échantillon ctl ne contient pas d acide nucléique. L échantillon tot est l ARN total extrait de vers non synchronisés, non exposé au RNAi contre xrn-2. (B) Immunobuvardage de type Western de l immunoprécipitation contre la protéine GFP ::ALG-1 des extraits de souches N2 et A1. Les ARNm lin-28 et lin-41 étaient bel et bien détectables par PCR en temps réel, et les produits de dégradation n étaient pas décelés. Les souches gfp ::alg-1 et N2 (sauvage) exprimaient bien les ARN. Nous sommes maintenant assurés de la présence des ARNm cibles dans les échantillons, avant de passer à l étape de l immunoprécipitation. Nous nous sommes aussi assurés que l étape de la transcription inverse a fonctionné, en omettant la reverse transcriptase dans les échantillons contrôle. La présence d une bande dans les puits sans reverse transcriptase aurait été dû à l amplification d ADN génomique dans nos échantillons. L ARNm de l actine est exprimé uniformément dans chacune des souches, mais on remarque que lin-28 et lin-41 sont trouvés en moins grande quantité dans les extraits. Finalement, nous avons aussi vérifié l efficacité de l immunoprécipitation (figure 13b). La protéine de fusion GFP ::ALG-1 est majoritairement retrouvé dans le culot de l immunoprécipitation, et une très faible quantité est révélé dans le surnageant. Somme

62 53 toute, nos expériences sont presque au point afin de permettre la détection des ARNm lin- 28 et lin-41 s ils co-précipitent avec le complexe ALG-1/ALG Identification d interacteurs potentiels du complexe ALG- 1/ALG-2 Le rôle des argonautes ALG-1 et ALG-2 est encore nébuleux, de même que leur implication dans le blocage de la traduction par les microarn et/ou la dégradation de l ARNm, induits par ces microarn. Il a été vu que ALG-1 interagit aussi avec AIN-1 (Ding, Spencer et al. 2005) et DCR-1 (Ding, Spencer et al. 2005; Duchaine, Wohlschlegel et al. 2006). Nous voulons donc tenter d identifier d autres facteurs qui pourraient interagir avec le complexe ALG-1/ALG-2, afin de mieux comprendre la fonction de ces argonautes. Figure 14: Protéines coprécipitant avec GFP ::ALG-1 et GFP ::ALG-2. 4 mg d extrait protéique des souches N2 (sauvage), gfp ::alg1 pha1 et gfp ::alg-2 pha1 ont été immunoprécipités et le culot obtenu a été solubilisé et mis sur gel et coloré par Sypro Ruby (Bio-Rad). Les bandes séquencées sont encadrées en rouge.

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