Électrophorèse. Électrophorèse :

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1 Électrophorèse Électrophorèse : Séparation basée sur la migration différentielle des solutés sous l influence d un champ électrique Technique complémentaire à la chromatographie liquide Modes de séparation Classique (papier ou acétate de cellulose, gel) Capillaire (solution libre ou zone, milieu micellaire, gel, focalisation isoélectrique, isotachophorèse, électrochromatographie) 345

2 Electrophorèse Electrophorèse sur gel Une dimension (SDS-PAGE) Bi-dimensionnelle (gel 2D) Electrophorèse capillaire Solution ou Zone Isotachophorèse Focalisation isoélectrique Gel En milieu micellaire 346

3 Electrophorèse Concept de base mobilité ionique Electrolyse Electrophorèse 2 H 2 O + O H + + 4e H 2 O + 2e H OH Electrolytes Support Faible conductivité V R ~ 0 V R >> 0 Distance Distance 347

4 Electrophorèse Concept de base mobilité ionique Champs électrique (V/cm) Charge q E = f v Coefficient de friction Vélocité (cm s -1 ) Mobilité ionique (cm 2 V -1 s -1 ) μ = v/e = q/f 348

5 Electrophorèse sur gel Support solide et réseau poreux + CH 2 =CH CO NH CH 2 CH 2 =CH- CO NH 2 Acrylamide Methylene-bisacrylamide CO CH 2 =CH Catalyseur: Tetramethylethylenediamine (TEMED) (CH 3 ) 2 N(CH 2 ) 2 N(CH 3 ) 2 Initiateur: Persulfate d ammonium/potassium S 2 O 8 2- SO 4 - CH 2 =CH-CH 2 =CH-CH 2 -CH- CO NH 2 CO NH CO NH 2 NH 2 CO CH 2 CO NH 2 CO CH 2 -CH- CH 2 =CH -CH 2 -CH- La concentration de TEMED determine la longueur des chaines de polymere et sa stabilite mecaniquela dimension des pores est controllee par la concentration d acrylamide et de bis-acrylamide. La composition des gels est definie par %T et %C: %T = (poids en g de monomère + cross-linker)/100 ml varie entre 5 et 20% %C = 100 (poids du cross-linker)/(poids du monomère + cross-linker) 349

6 Electrophorèse sur gel Mobilité electrophorètique CH 3 -(CH 2 ) 10 -CH 2 -O-SO 3 -, Na + 1% SDS 100 C β-me 2 min Log M r Mobilité rel. Réduction des ponts disulfure Dénaturation et linéarisation de la protéine Le SDS se lie a la protéine ~ 1 molécule/3 lien peptidique Charge/poids de protéine est ~ cst Force électrique est proportionnelle à la charge et donc F e /M r ~ cst Si F e /M r est ~ cst comment se fait la séparation? 350

7 Electrophorèse sur gel Instrumentation Les gels sont disponible en format deja polymerisé On choisit %T pour la gamme de poids moléculaire désiré L échantillon (avec marqueur de migration bleu de bromophenol) est appliqué dans un puit au haut du gel Des standards de poids moléculaire pre-colorés sont disposés de chaque coté de façon a faciliter l alignement On utilise un stacking gel de faible %T pour compresser les protéines en début de gel et obtenir une meilleure résolution Le gel est coloré par la suite au coomassie ou à l argent 351

8 Electrophorèse sur gel Préparation des échantillons Tampon de resolubilisation Produits Concentration 2X 4x Tris-HCl, ph 6.8* M 0.25 M SDS 4 % 8 % β-me** 5 % 10 % DTT** 0.15 M 0.3 M Glycerol 20 % 30 % Bromophenol bleu 0.01 % 0.02 % * Utiliser Tris base et ajuster ph avec HCl pour éviter force ionique trop grande ** Utiliser le β-me ou le DTT Précautions: Utiliser gants pour eviter contamination (keratin ~ 55kDa). Manipulation sous la hotte SDS et β-me sont toxiques. Eviter la surcharge doser les proteines par BCA avec leur séparation sur gel 10 cm ~ µg pour échantillons purifiés et µg pour echantillons bruts avec Coomassie (sens. ~100ng) ou ~ 50 x moins avec coloration à l argent (sens. 2-5 ng). Utiliser DNase pour réduire les aggrégats d ADN 352

9 Electrophorèse sur gel % acrylamide et la gamme de poids moléculaire Source: Bio-Rad: The little book of standards 353

10 Historique Introduit en 1975 par P.H. O Farrell et J. Klose. 1 ere dimension utilise gel-ampholyte dans tubes étroits. Résolution accrue issue de l orthogonalité et des performances respectives de IEF et SDS-PAGE. Introduction de bandes avec gradient de ph immobilisé en 1982 par A. Görg et al. permettant une meilleure reproductibilité. Développement commercial par Amersham, Biorad en ~ O'Farrell, P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, (1975). Klose, J. Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutation in mammals. Humangenetik 26, (1975). Bjellqvist, B., Ek, K., Righetti, P.G., Gianazza, E., Görg, A., Westermeier, R., Postel, W. Isoelectric focusing in immobilized ph gradients: principle, methodology and some applications. J. Biochem. Biophys. Methods 6, (1982). 354

11 Principe de séparation 1 ere dimension (séparation par pi) Ampholytes: gel en tubes comprennant un melange d ampholytes avec une gamme de pi. Bandes d immobilines comprenant un melange de composes ayant des fonctions acides et base et lie a un monomere d acrylamide le tout immobilise sur une bande de plastique: CH 2 = CH C NH R O R = Groupes tampons acides ou bases faibles 2 e dimension (séparation par M r ) Gel acrylamide (SDS-PAGE) de plus grande dimension et accommodant la longueur des tubes ou bandes immobilines %T: 10 ou 12 % ou gradient de 8-12%. 355

12 Principe de séparation 356

13 Équipement Etan IPGphor Focalisation isoélectrique Etan Dalt SDS-PAGE (12 gels) Carottier automatisé Permet l excision des protéines sur gel 357

14 Préparation de l échantillon Lyse cellulaire (choc osmotique, gel/dégel, detergents, enzymatique), fractionnement mécanique (sonication, french press, billes de verre, etc..) Utilisation d inhibiteur de protéolyse Centrigugation Précipitation (sulfate d ammonium, TCA, acétone) Enlever contaminants potentiels (nucleotides, métabolites, phospholipides, sels, detergents, AND, ARN, polysaccharides, lipides) Dosage (BCA, Lowry, Bradford, etc ) 358

15 Solubilisation de l échantillon (avant IEF) 8 M urée, 4% CHAPS, 60 mm DTT, 2% Pharmalyte 3 10, 0.002% bromophenol bleu. Pour protéines de haute masse moléculaire ou hydrophobes: 7 M urée, 2 M thiourée, 4% CHAPS, 60 mm DTT, 2% Pharmalyte ph 3 10, 0.002% bromophenol bleu. NB Urée et thiourée perturbe les ponts hydrogenes et les forces de London Urée peut former des modifications (carbamylation) si T >37 C cyanate (HN=C=O) carbamylation (Lys, Arg)(R-NH2 R-NH-CO-NH2) serie de carbamylation 359

16 Sélection de bande d immobiline Bandes (3 mm x 18 cm x 0.5 mm) Gamme large 3 10 Gamme moyenne Gamme étroite

17 Sélection de bande d immobiline ph 3-10 Gamme large ph Gamme moyenne (41.2 kda ; pi 4.94) Gamme étroite ph Permet une augmentation de la résolution (41.5 kda ; pi 4.91) 361

18 Rehydratation de l échantillon Échantillon charge (urea, CHAPS, DTT, ampholytes, etc ) dans une cassette En présence d huile non conductrice Température ambiante Période: ~12 h Focalisation isoélectrique Température: 20 C 80 ma/bande 500-8,000 V sur 12 h 32,000 Vh Anode pi ph 4 ph 7 Cathode 362

19 Equilibration 2% SDS, 50 mm Tris-HCl ph 8.8, 6 M uree, 30% (v/v) glycerol, 0.002% bromophenol bleu 15 min 10 ml mg DTT 15 min 10 ml mg IAA 2 e dimension (SDS-PAGE) MW Conditions 500 V 1600 mw/gel Contrôle de la T a 20C ~6 h + Gel 10% acrylamide (22 cm x 23 cm x 1 mm) 363

20 Coloration Coomassie Sensibilité (~50 ng) Non spécifique Non quantitatif Argent Sensibilité ( ng) Longue préparation Non spécifique Protéines peuvent avoir une coloration négative Colorants fluorescent (SYPRO ruby) Sensibilité (1-2 ng) Spécifique, quantitatif Excision problématique 364

21 Analyse d image ( ) 4.0 ( ) pi ( ) Mr (kda) Assemblage des gels, comparaison de l expression différentielle chez les réplicatats et excision des proteines d intéret 365