Globales: imagerie cellulaire, western-blot.

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1 Mars 2010

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3 Globales: imagerie cellulaire, western-blot. Dirigées: analyse d'une région définie par ChIP (immunoprécipitation de la chromatine) ou MeDIP (immunoprécipitation de l'adn méthylé) Exhaustives: analyse de l'épigénome (ChIP-on-chip, MeDIP-on-chip, ChIP-seq, MeDIP-seq, )

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5 But: analyser les interactions ADN-Protéines: Histone modifiées post-traductionelllement (phosphorylation, acétylation, méthylation ) Variant d histones Facteurs de transcription Protéines de modification de la chromatine Processus analysés: Réplication, recombinaison et réparation de l ADN Maintenance de la stabilité génomique Mitose Régulation de l expression des gènes Développement embryonnaire Différenciation cellulaire Aging Nutrition Maladies humaines (cancer, ) Pluripotence des cellules souches

6 D après Collas et Dahl (2008)

7 PCR semi-quantitative PCR quantitative Southern blot quantitatif ANALYSES Analyse épigénomique globale «ChIP on chip» = EPIGENOME Séquençage

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9 ChIP-seq, analyse de l'epigénome Lefrançois et al. BMC Genomics 2009

10 Barski et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell (2007) vol. 129 (4) pp

11 Specific pattren of methylated histones on gene body Barski et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell (2007) vol. 129 (4) pp

12 Le matériel de départ Cellules en cultures Embryons entiers Tissus /organes / tumeurs / biopsies entiers dissection (manuelle ou laser) Fixation (XChIP) ou non-fixation (NChIP) XChIP: Facteurs de transcription, histones Fixation au formaldéhyde (~2 Å) NChIP: Histones ou protéines chromatiniennes très solidement ancrées et abondantes

13 Lyse cellulaire (Extraction et purification de chromatine) Optionnel Fragmentation de la chromatine (0,2-1kb = mono à hepta-nucléosomes) Sonication Sonde 2 mm (eppendorf 1.5mL) Bioruptor Digestion enzymatique Mnase/Nucléase ER Immunoprécipitation Choix de l Ac! (ChIP grade)

14 Lavages stringeants Elution & dépontage 1%SDS, 0,1MNaHCO3 10mM DTT Purification de l ADN Proteinase K puis colonne d affinité (Miniprep/PCR purification kit Qiagen) Phénol/Chloroforme puis EtOH précipitation ipure (nouveauté 2010!) Analyse de l ADN immunoprécipité: Dot/Slot Blot Southern Blot puis quantification PhosphorImager PCR semi-quantitative Q-PCR Analyse épigénomique globale (ChIP on chip ) Séquençage

15 XChIP NChIP C-ChIP / Few cells ChIP / Q2ChIP RNA-ChIP (RIP) ChIP on ChIP ChIP-seq / ChIP-pet / ChIP-display / ChIP- DSL Sequential-ChIP MeDIP / medip-on-chip / medipseq DamID Banque d ADN immunoprécipité

16 Requiert un grand nombre de cellules > 10 6 cellules/ip ? Long et fastidieux Mise au point de nombreux paramètres avant de commencer: Temps de pontage Protocole de sonication Concentration en Ac PCR de la région cible Nombreux pipetages manuels 1 semaine / ChIP Reproductibilité parfois difficile Pas d assurance de succès (comme très souvent!!!)

17 in vivo Fiable si réalisée dans de bonnes conditions

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20 MLL : Mixed Lineage Leukemia Homologue de trithorax Histone méthyle transférase H3K4me3 Impliqué dans de très nombreux cancers 80% de leucémies juvéniles aigues

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22 qrtpcr of Hox c8 in MEFs: MLL +/+ MLL -/- FMLL: MLL-/- + FLAG-MLL

23 XChIP α-flag sur cellules FMLL

24 XChIP α-panh3ac et α-panh4ac sur cellules MLL+/+; MLL-/- et FMLL

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27 MLL +/+ MLL -/- FMLL Hox c α-h3k4me α-h3k27me α-flag PI souris PI lapin input Contrôles: Négatifs Positif Analyse par qpcr: Promoteur Hox c8 Promoteur Hpx a1 (contrôle négatif)

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29 Séquençage après traitement au Na bisulfite Enzymes de restriction sensibles à la méthylation de l ADN (AgeI, ClaI, HpaII, MluI, NotI, PmlI, PvuI, SacII, SalI, SmaI etc ) Immunoprécipitation de l ADN méthylé: MeDIP (ChIP-on-chip, CGH arrays, MeDIPseq)

30 medip-on-chip medipseq

31 MLL +/+ MLL -/- FMLL Hox c me5c input Analyse par qpcr: Promoteur Hox c8 Promoteur Hpx a1 (contrôle négatif)

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