Cours Spectrométrie de Masse. Introduction

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1 Cours Spectrométrie de Masse Introduction Sarah SANGLIER Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique UMR 7512 (Dir : Alain Van Dorsselaer) CNRS - Université Louis Pasteur Strasbourg Tel: ssangli@chimie.u-strasbg.fr Cours ESBS Octobre 2005

2 Plan Mercredi 12/10 : Les Bases de la Spectrométrie de Masse (Sarah Sanglier) - Introduction à la spectrométrie de masse - L ionisation MALDI - L ionisation Electrospray Vendredi 14/10 : Application à l analyse protéomique (Alain Van Dorsselaer)

3 Spectrométrie de masse : introduction générale Définitions 1- Présentation d un spectre de masse 2- Unité de mesure: le Dalton 3- Masse moléculaire monoisotopique 4- Masse moléculaire moyenne (ou chimique) L instrument : structure d un appareil de spectrométrie de masse 1-Structure d un instrument : source et analyseur 2- Rôle des champs l électrostatiques 3- Rôle et systèmes de génération du vide 4- Présentation des principales sources EI, FAB, MALDI, ESI 5- Présentation des principaux analyseurs Magnétique, quadrupôlaire, trappe d ion, TOF, FT-ICR 6- La MS-MS

4 Qu est-ce que la spectrométrie de masse? C est une méthode de mesure des rapports masse-sur-charge (m/z) de molécules individuelles et ionisées et de leurs produits de fragmentations

5 Quelles informations peut apporter la spectrométrie de masse? 1- La masse moléculaire d un composé 2- La masse des fragments de ce composé 3- Une mesure de la quantité Nombre d ions Pic Moléculaire Fragments m/z

6 Pic moléculaire et masse moléculaire : définition La masse moléculaire est déduite de la valeur m/z du pic moléculaire dans le spectre. Celui-ci correspond à un ion qui contient TOUS les atomes de la molécule étudiée, sans qu il y ait eu rupture d une liaison. La molécule a été ionisée grâce à la perte ou au gain d une charge électrique. La masse moléculaire correspond donc à la composition élémentaire (formule brute) de l ion moléculaire. L existence d isotopes se traduit par la présence de plusieurs pics moléculaires. On observe, non pas UN pic moléculaire, mais UN GROUPE de pics moléculaires (un «massif moléculaire» ou «cluster moléculaire») La présence d isotopes complique donc la définition, et la mesure du «pic moléculaire».

7 Quelles informations peut apporter la spectrométrie de masse? 1- La valeur m/z du pic moléculaire permet de calculer la masse moléculaire 2- Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une partie de la structure 3- L intensité des pics permet de faire de l analyse quantitative Cholestane 100 % 0 m/z 149 m/z Pic moléculaire Da/e Fragments Exemple: spectre en ionisation par impact électronique du cholestane.

8 Quelle masse mesure-t-on? Masse monoisotopique c est la masse du premier pic du profil isotopique c est-à-dire celle qui ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stables (C 12, H 1, O 16, S 32, N 14, ). Masse chimique ou moyenne c est le barycentre (centroïde) des masses des pics constituant le profil isotopique c est-à-dire la masse qui prend en compte la masse des éléments donnée par le tableau périodique (C=12,011).

9 Quelle masse mesure-t-on? Masse moyenne Pic monoisotopique P P+1 P+2 P+3 m/z m/z Masse monoisotopique: dans le massif isotopique, on l appelle le pic P Les autres pics du massif isotopique sont appelés les pics P+1, P+2, P+3,. Il contiennent tous au moins 1 des isotopes lourds d un éléments.

10 De quoi dépend la nature de la masse mesurée? ΔM R = M/ΔM Vallée à 10 % M M + ΔM La résolution mesure l aptitude d un analyseur à séparer l ion M de l ion M+ΔM

11 Quelle masse mesure-t-on? Pic monoisotopique Masse moyenne P P+1 P+2 P+3 m/z m/z

12 Quelle sont les unités de mesure? La masse m s exprime en Dalton (Da) 1 Da = 1/ kgmole-1 / N Et donc: C12 C13 H1 H2 O16 S32 N14 Cl35 Cl37 = = = = = = = = = 1 Da = 1, kg 12, , , , , , , , , (N = 6, )

13 Un spectrométre de masse mesure la masse de molécules isolées Pour cela, le spectromètre de masse doit assurer les opérations suivantes: 1- Volatiliser Séparer les molécules les unes des autres: on passe de l état de matière condensée à un état gazeux. 2- Ioniser Transformer les molécules en ions, car un spectromètre de masse fonctionne grâce à des champs électriques 3- Mesurer les rapports m/z La masse moléculaire est calculée à partir du rapport charges (z) masse (m)/nb de

14 Un spectromètre de masse est constitué de: Source Interface Analyseur obtention d ions en phase gazeuse focalisation et transmission des ions séparation des ions en fonction de m/z

15 Un spectromètre de masse est donc constitué de deux parties : 1- La source d ion : pour volatiliser et ioniser Ces opérations peuvent se faire simultanément ou successivement selon le type de source d ions. Leur mécanisme intime est souvent mal connu. 2- L analyseur: pour mesurer m/z Il mesure les valeurs du rapport: masse / nb de charge (appelé m/z) C est une partie de l appareil où règne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen des ions soit supérieur à la distance à parcourir dans l appareil pour atteindre le détecteur. CECI IMPLIQUE: Des champs électrostatiques très précis pour guider et déplacer les ions dans l'appareil (lentilles électrostatiques, optique ionique) Un vide suffisant pour que les ions puissent se déplacer sans être détruits ou déviés par des molécules résiduelles (notion de libre parcours moyen)

16 Les unités de mesures des pressions sont nombreuses. L unité officielle est le pascal (Pa): 1 pascal = 1 N/m 2 On utilise également: L atmosphère Le bar Le millibar Le Torr Le Psi 1 atm = Pa (soit 1 013,25 hecto Pa) et 1 atm = 1,013 bar 1 bar = 10 5 Pa (=10 6 dyne/cm2) 1 millibar = 10-3 bar = 10 2 Pa 1 Torr = 1mm Hg 1 Psi = 1 pound / square inch = 0,07 atm et 14 PSI = 1 atm Pour la plupart des spectromètres de masse, le vide est indiqué en millibar. Les valeurs du vide dans l analyseur sont en général: 10-5 mbar : pour un analyseur trappe ionique (orbite circulaire) 10-6 mbar : pour un analyseur quadripôlaire (1 mètre de long) mbar : pour un analyseur magnétique (2 à 3 mètres de long) mbar : pour un analyseur à temps de vol (2 à 3 mètres de long) mbar : pour un analyseur ICR (orbite circulaire).

17 La source d ions : son rôle est de volatiliser et d ioniser Il existe de nombreux types de sources d ions et chacun de ces types de sources repose sur un principe physique différent. Le principe physique qui permet de volatiliser et l ioniser un type de composé est choisi par l opérateur en fonction des caractéristiques de la molécule à analyser. Les étapes de volatilisation et d ionisation se font successivement ou simultanément selon le type de source. Les critères de choix principaux sont: la volatilité et la stabilité thermique du composé à analyser sa labilité chimique les fonctions chimiques présentes et leur aptitude à induire une ionisation la taille des molécules les quantités de produit disponibles le type d introduction souhaitée (directe ou en couplage chromatographique)

18 Les sources d ions se classent en sources «dures» et en sources «douces» De très nombreuses méthodes d ionisation ont été inventées pour ioniser et volatiliser des molécules de plus en plus fragiles, grandes et polaires. Les «ionisations dures» génèrent souvent des ions moléculaires, à nombre impair d électrons, qui se fragmentent beaucoup et parfois même totalement avant d avoir eu le temps de sortir de la source. Lorsque leur durée de vie est assez longue pour qu il sortent de la source intacts, mais qu ils se décomposent avant d avoir complètement traversé l analyseur et d arriver au détecteur, on les appelle ions métastables. Leurs fragments peuvent être analysés et donnent des informations de structures. Les «ionisations douces» génèrent des ions moléculaires à nombre pair d électrons, qui sont relativement stables et qui ont des durées de vie suffisantes pour traverser l analyseur, arriver jusqu au détecteur, et donc être mesurés.

19 Quelles informations peut apporter une source à ionisation dure? 1- La masse moléculaire d un composé 2- La masse des fragments de ce composé 3- Une mesure de la quantité Nombre d ions Pic Moléculaire Fragments M/z

20 Quelles informations peut apporter un soure à ionisation douce? 1- La masse moléculaire d un composé 2- Pas de fragmentation 3- Une mesure de la quantité Nombre d ions Pic Moléculaire M/z

21 Les sources d ions les plus courantes sont : La source à plasma induit couplé (Induced coupled plasmas: ICP-MS) La source à impact électronique (EI) Très dure Dure La source à ionisation chimique (CI) La source à ionisation chimique par désorption (DCI) L ionisation par thermospray (TSP) La désorption de champs (FD) L ionisation par bombardement d ions ou d atomes rapides (LSIMS, FAB) La désorption par plasma (PD) La désorption laser (LD) L ionisation chimique à pression atmosphérique (API ou APCI) La photoionisation (APPI) Assez douce Assez douce Assez douce Assez douce Assez douce Assez douce Assez douce Assez douce Assez douce L ionisation laser assistée par matrice (MALDI) Utilisées en Douce L électronébulisation (electrospray: ES ou ESI) PROTEOMIQUE Douce

22 L analyseur : pour mesurer m/z Il existe différents types d analyseurs. Ils sont tous basés sur des principes physiques différents, mais tous les analyseurs mesurent des valeurs m/z. C est une partie de l appareil où règne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen des ions soit supérieur à la distance à parcourir dans l appareil pour atteindre le détecteur. B: Déflexion par un champ magnétique (c'est l'analyseur le plus ancien) Q: Déflexion par un champ quadrupolaire IT: Confinement dans un piège à ion (Ion Trap) TOF: Mesure d un temps de vol (Time Of Flight) FT-ICR: Résonnance Cyclotronique d Ions à Transformée de Fourrier Les ions formés dans la source sont dirigés (extraction et focalisation) vers l analyseur par des champs électrostatiques qui peuvent être de quelques volts (Q, IT, FT-ICR) ou de plusieurs dizaines de kilovolts (TOF, B). La vitesse de déplacement des ions dans l analyseur dépend de l intensité du champ d extraction On peut coupler plusieurs analyseurs (MS-MS et MS n ) pour faire de la spectrométrie de masse à plusieurs dimensions en utilisant successivement le pouvoir séparateur de chaque analyseurs. Ceux-ci peuvent être identiques ou différents.

23 Les caractéristiques principales d'un analyseur sont : La résolution R La gamme m/z qu'il peut analyser La rapidité de balayage en m/z La sensibilité La vitesse avec laquelle les ions le traversent Souvent, avec un même analyseur, on peut augmenter l'une de ces caractéristiques aux dépends des autres, mais seulement dans certaines limites. Chaque type d'analyseur a son "point fort".

24 Caractéristiques des analyseurs Analyseurs Résolution Gamme m/z Quadripôle (Q) Magnétique (EB) Temps de vol (TOF) Trappe ionique Cyclotron à résonance des ions (FT-ICR)

25 Spectromètres de masse commerciaux: De nombreux couples source /analyseur sont possibles EI/CI FAB MALDI/LD ES/APCI Q BE TOF IT FT-ICR

26 La spectrométrie de masse à plusieurs dimensions: Il y a plusieurs analyseurs qui se suivent Les analyseurs peuvent être couplés et agir de façon séquentielle. On parle alors de spectrométrie de masse à plusieurs dimensions Un premier analyseur sélectionne les ions avec un certain m/z On purifie donc un ion présent dans un mélange d ion qui peut être très complexe L ion «purifié» est alors fragmenté dans une chambre de collision. Un deuxième analyseur mesure alors les m/z des fragments. C est de la MS-MS (spectrométrie de masse en tandem) Si on répète l opération, on fait de la MS-MS-MS ou MS 3 Certain appareils permettent de faire de la MS 10 La MS-MS est un puissant outil de détermination de structure

27 Principe de la MS/MS: étude d ions fils Source MS1 Cellule de collision MS2 Détecteur Ions Ion parent Fragmentation (CID) Ions fils Spectre MS/MS Le premier analyseur ne balaye pas

28 Principe de fragmentation dans la chambre de collision (Collision Induced Dissociation : CID) Mi, z Cellule de collision m 1 m 2 m 3 m g E c = E lab = ze ΔV ΔV E cm = E lab m g / Mi + m g

29 Les analyseurs MS n La MS-MS peut être réalisée par : Deux quadrupôles Un quadrupôle et un analyseur à temps de vol Deux analyseurs à temps de vol Un piège à ions (Ion Trapp) Une résonnance cyclotronique d ion à transformée de Fourrier Q-Q Q-TOF TOF-TOF IT FT-ICR La MS n peut être réalisée par : Un piège à ions (Ion Trapp) Une résonnance cyclotronique d ions à transformée de Fourrier IT FT ICR

30 Les énergies de la collision en MS/MS dépendent du type d analyseur utilisé. On peut obtenir des schémas de fragmentation différents selon les énergies utilisées Collision haute énergie en kev EB/EB ou BEB EB/Q EB/TOF TOF/TOF Collision basse énergie en ev QQ Q-TOF IT FT-ICR TOF (PSD)

31 Nomenclature des fragments peptidiques Bieman, Roepstorff, Fohlmann a n b n c n NH CH CO NH CH COOH R n R n+1 x n y n z n d n, v n, w n d n+1, v n+1, w n+1 Fragments observés en haute et basse énergie Fragments observés seulement en haute énergie

32 Spectre ESI-MS d un digeste trypsique (m/z=681) Intens x MS/MS ,

33 ESI-IT-MS-MS de l ion [M+2H] 2+ à m/z=681 G A K E I/L D

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