Noradrenalin ELISA RE C. Fiche technique

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1 Fiche technique Noradrenalin ELISA Test immuno-enzymatique manuel et automatisé pour le dosage diagnostic in-vitro quantitatif de la noradrénaline (norepinéphrine) dans le plasma et l urine humains. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. BUT DU TEST Test immuno-enzymatique manuel et automatisé pour le dosage diagnostic in-vitro quantitatif de la noradrénaline (norepinéphrine) dans le plasma et l urine humains. 2. SOMMAIRE ET INTRODUCTION Les catécholamines adrénaline, noradrénaline et dopamine sont synthétisées dans la médulla surrénale, le système nerveux sympathique et dans le cerveau. Elles influencent pratiquement tous les tissus et sont impliquées, ainsi que d'autres systèmes hormonaux et neuronaux, dans le règlement d'une grande variété de processus physiologiques. Comme les catécholamines et leurs métabolites métanéphrine et normétanéphrine sont secrétés en quantités élevées dans de nombreuses maladies, elles peuvent être utilisées à but de diagnostic. Dans ce contexte, le diagnostic ainsi que le suivi des maladies tumorales du système nerveux prennent une importance particulière. Ceci s applique spécialement au phéochromocytome mais aussi au neuroblastome et au ganglioneurome. Grâce à l étape d extraction au début du test, le client est capable d utiliser toute sorte de spécimens d espèces animales. Cela fonctionne sur les rats, lapins, souris, chèvres, chevaux, chiens, cochons et autres. La structure chimique des catécholamines est identique chez tous les animaux. 3. PRINCIPE DU TEST Le test immuno-enzymatique sur phase solide (ELISA) est basé sur la technique sandwich. Les puits sont coatés avec un anticorps de chèvre anti-lapin. L anticorps liquide ajouté, dirigé contre un épitope d une molécule antigène, se lie à la plaque pendant le temps d incubation. L antigène de l échantillon est incubé dans le puits coaté avec un second anticorps conjugué à une enzyme (E-Ab), dirigé contre une autre région de la molécule d antigène. Suite à la réaction substrat, l intensité de la couleur développée est proportionnelle à la quantité d antigène présente dans l échantillon. Les résultats des échantillons peuvent être déterminés directement à partir de la courbe étalon. 4. PRECAUTIONS D EMPLOI 1. Seulement prévu au diagnostic in-vitro et à l usage professionnel. 2. Lire les instructions complètement et avec attention avant de commencer le test. Utiliser la version valide de la fiche technique incluse dans le kit. S assurer que tout a été bien compris. 3. Dans le cas de dommages importants de l emballage du kit, veuillez contacter IBL ou votre fournisseur sous forme écrite, une semaine au plus tard après avoir reçu le kit. N utilisez pas les composants abîmés pour un test, mettez-les de côté et en sécurité pour les besoins éventuels liés à la plainte. 4. Suivez le numéro du lot et la date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Ne pas utiliser de réactifs périmés. 5. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les directives de sécurité. Porter des blouses de laboratoire, gants en latex à usage unique et lunettes de protection si nécessaire. 6. Les réactifs de ce kit contiennent du matériel dangereux pouvant irriter les yeux et la peau. Consulter le MATERIEL FOURNI et les étiquettes pour les détails. Les Fiches de Données de Sécurité pour ce produit sont disponibles sur le site internet IBL ou sur demande particulière à IBL. 7. Les réactifs chimiques préparés ou utilisés doivent être traités comme matériel dangereux en accord avec les directives et règlements nationaux de sécurité pour tout matériel à risque. 8. Le personnel de nettoyage doit être formé par des professionnels en ce qui concerne les risques potentiels et la manipulation des produits. 9. Eviter tout contact avec la solution d arrêt. Elle peut provoquer des irritations et brûlures cutanées. 10. Tous les réactifs de ce kit contenant des sérums ou plasma humains ont été testés et confirmés négatifs à anti-hiv I/II, HbsAg et anti-hcv. Tous les réactifs doivent être considérés comme potentiellement contaminants et utilisés en tant que tel. 5. STOCKAGE ET STABILITE Le kit est envoyé à température ambiante et doit être stocké entre 2 C et 8 C. À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Le stockage et la stabilité des échantillons et réactifs préparés sont indiqués dans les chapitres correspondants. Les barrettes de la microplaque sont stables jusqu à la date de péremption du kit en étant stockées entre 2 C et 8 C dans le sachet déjà ouvert, mais hermétiquement refermé. Version / 9

3 6. COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS La libération des catécholamines et métanéphrines in-vivo est influencée par plusieurs aliments et médicaments. La vitamine B, le café et les bananes, alpha-méthyldopa, inhibiteurs MAO et COMT ainsi que les médications reliées à l hypertension ne devraient pas être pris dans les 72 h précédant la collecte des échantillons. Plasma (EDTA) Les échantillons de sang doivent être stockés à 2-8 C jusqu à centrifugation pour séparer le plasma dans les 2 h suivant la collecte de sang. Observer les précautions habituelles de prises de sang. Il est important de préserver l intégrité chimique d un échantillon sanguin, de sa collecte jusqu à son analyse. Ne pas utiliser d échantillons fortement hémolysés, ictériques ou lipémiques. Les échantillons d apparence turbide doivent être centrifugés avant analyse pour éliminer toute particule gênante. Stockage: 2-8 C -20 C (Aliquots) À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Eviter tout cycles de congélation / décongélation répétés. Stabilité: 6 heures 1 mois Envoyer les échantillons sous forme congelée. Urine Il est possible d utiliser des urines spontanées ainsi que des urines de 24 h. Le volume total d urines excrétées pendant une période de 24 h doit être collecté et mélangé dans une seule bouteille contenant ml de 6 N HCl comme conservateur. Déterminer le volume total pour le calcul des résultats. Mélanger et centrifuger les échantillons avant le test. Stockage: -20 C (Aliquots) À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Stabilité: 6 mois Eviter tout cycles de congélation / décongélation répétés. 7. MATERIEL FOURNI Les réactifs fournis dans ce kit suffisent pour 48 dosages en simple dans l étape d extraction (6 étalons, 2 contrôles et 40 échantillons de patients) et jusqu à 48 dosages en double dans le test ELISA pour le dosage de l adrénaline et de la noradrénaline plasmatique ou urinaire. Des réactifs supplémentaires sont disponibles sur demande. Quantité Symbole Composant 1 x 12x8 MTP 1 x 6 x 2.5 ml CAL A-F 1 x 2 x 2.5 ml CONTROL x 400 µl ENZCONJ CONC 2 x EXTRPLATE 1 x 60 ml EXTRBUF 2 x 1.25 ml COMT LYO 2 x 1.25 ml COENZ 1 x 3 ml ENZBUF 2 x 13 ml RELEASEBUF 1 x 3 ml ACYLREAG Microplaque Barrettes sécables. Coatée avec un anticorps IgG anti-lapin (chèvre, polyclonal). Étalon A-F Adrénaline: 0; 1.5; 5.0; 15; 50; 150 ng/ml (0; 8; 27; 82; 273; 819 nmol/l) Noradrénaline: 0; 5.0; 15; 50; 150; 500 ng/ml (0; 30; 89; 296; 887; 2955 nmol/l) Dopamine: 0; 60; 180; 585; 2300; ng/ml (0; 392; 1175; 3819; 15014; nmol/l) Prêt(e) à l emploi. Contient: [-] Adrénaline, [-] Noradrénaline, [-] Dopamine (biologiquement actives), et 0.1 M HCl. Contrôle 1+2 Prêt(e) à l emploi. Contient: [-] Adrénaline, [-] Noradrénaline, [-] Dopamine (biologiquement actives), 0.1 M HCl. Consulter les concentrations exactes sur les étiquettes des flacons ou sur le certificat CQ. Conjugué Enzymatique Concentré (50x) Contient: streptavidine phosphatase alcaline, Tampon Tris, HCl, 0.01 % NaN 3. Plaque d Extraction (Macroplaque) 24 puits de chaque. Coatée avec un gel d affinité au boronate. Tampon d Extraction Coloré en rouge. Prêt(e) à l emploi. Contient: % NaN 3. COMT lyophilisé/e Contient: Catéchol-O-méthyltransférase (foie de porc), NaN 3. Solution de Coenzyme Prêt(e) à l emploi. Contient: S-Adénosyl-L-Méthionine, stabilisateurs. Tampon pour Enzyme Prêt(e) à l emploi. Contient: Tampon Tris, HCl, stabilisateurs. Tampon de Libération Coloré/e en Jaune. Prêt(e) à l emploi. Contient: 0.1 M HCl, indicateur. Réactif d Acylation Prêt(e) à l emploi. Contient: diméthylformamide, Éthanol. Attention! Toxique. Fortement inflammable. Version / 9

4 Quantité Symbole Composant 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 2 ml COMT ADD 1 x 8.0 ml ANTISERUM NAD 1 x 25 ml PNPP SUBS Tampon de Lavage Concentré (10x) Contient: Tampon Tris, HCl, Tween, 0.2 % NaN 3. COMT Additif Contient: plasma humain, stabilisateurs, 0.01 % Thimérosal. Noradrénaline Antisérum Coloré en bleu. Prêt(e) à l emploi. Contient: anticorps contre Noradrénaline (lapin), Tampon, stabilisateurs. Solution Substrat PNPP Prêt(e) à l emploi. Contient: phosphate p-nitrophényl (PNPP). 1 x 15 ml PNPP STOP Solution d Arrêt PNPP Prêt(e) à l emploi. Contient: 1 M NaOH, 0.25 M EDTA. 3 x FOIL Feuille Adhésive 8. MATERIEL NECESSITE MAIS NON FOURNI 1. Pipettes (Multipette Eppendorf ou matériel similaire, CV < 3 %) Volumes: 10; ; µl 2. Agitateur orbital ( tr/min) (par ex. EAS 2/4, SLT) 3. Vortex 4. Micropipette à 8-canaux avec réservoirs pour réactifs 5. Bouteille pour lavage, système automatique ou semi-automatique pour le lavage de microplaque 6. Lecteur de microplaque capable de lire l absorbance à 405 nm (longueur d onde de référence nm) 7. Eau bidistillée ou désionisée 8. Papier absorbant, embouts de pipette et chronomètre 9. Tubes à usage unique pour la dilution des échantillons M HCl, pour la dilution des échantillons (Urine) 9. NOTES POUR LA PROCEDURE 1. Toute manipulation impropre des échantillons ou modification de la procédure du test peut influencer les résultats. Les volumes indiqués pour pipeter, les temps d incubation, températures et étapes de prétraitement doivent être strictement suivis selon les instructions. N utiliser que des pipettes et appareils calibrés. 2. Une fois que le test a commencé, toutes les étapes doivent être suivies sans interruption. S assurer que les réactifs, matériels et appareils nécessaires soient prêts au moment approprié. Amener tous les réactifs et échantillons à température ambiante (18-25 C) et mélanger doucement en tournant chaque flacon de réactif liquide et d échantillon avant emploi. Mélanger les réactifs sans former de mousse. 3. Eviter toute contamination des réactifs, pipettes et puits/tubes. Utiliser des nouveaux embouts de pipette en plastique pour chaque réactif, étalon ou échantillon. Ne pas interchanger les bouchons. Toujours refermer les flacons non utilisés. Ne pas réutiliser les puits/tubes ou réactifs. 4. Quelques composants contiennent 250 µl solution. Assurez-vous que la solution soit complètement dans le fond du flacon avant son ouverture. 5. Il est recommandé de doser les échantillons en double pour pouvoir identifier d éventuelles erreurs de pipetage. 6. Utiliser un schéma de pipetage pour vérifier une bonne répartition des échantillons. Un schéma de pipetage incluant le prétraitement des échantillons et le test est disponible sur le site internet IBL. 7. Le temps d incubation affecte les résultats. Tous les puits doivent être manipulés dans le même ordre et aux mêmes intervalles. Il est recommandé d utiliser une micropipette à 8-canaux pour pipeter les solutions dans tous les puits. 8. Le lavage de la microplaque est important. Des puits mal lavés donneront des résultats erronés. Il est recommandé d utiliser une pipette à multicanaux ou un système de lavage automatique. Ne pas laisser sécher les puits entre les incubations. Ne pas gratter les puits coatés pendant le rinçage et l aspiration. Rincer et remplir les réactifs avec soin. Lors du rinçage, vérifier que tous les puits soient bien égouttés du tampon de lavage, et que les puits ne contiennent aucun résidu. 9. L humidité affecte les puits/tubes coatés. Ne pas ouvrir le sachet avant que celui-ci n ait atteint la température ambiante. Les puits/tubes inutilisés doivent être rangés immédiatement dans le sachet refermé avec le dessiccateur. Version / 9

5 10. PROCEDURE MANUELLE PREPARATIONS PREALABLES AU TEST Le contenu du kit pour 96 dosages peut être divisé en 2 analyses différentes. Des quantités de gel visibles peuvent se décoller de la surface de la plaque d extraction pendant I extraction. Ceci n influence pas les résultats du test. Une contamination aérienne par des désinfectants contenant du peroxygène pour nettoyer les surfaces ou équipements, utilisés sous forme de poudre ou solutions, comme par ex. VIRKON, doit être évitée. Une telle contamination entrave fortement la performance du test. VIRKON est une marque déposée de DuPont Dilution des Echantillons Les échantillons susceptibles de contenir une concentration supérieure à l étalon le plus concentré doivent être dilués de la sorte: Echantillon doit être dilué avec Remarques Plasma > étalon le plus concentré eau bidist. avant l étape d extraction Urine > étalon le plus concentré 0.1 N HCl avant l étape d extraction Extraction des Échantillons, Étalons et Contrôles (Plaque d Extraction) (version manuelle) 1. Pipeter 20 µl de chaque Étalon, Contrôle et échantillon urinaire et 500 µl de chaque échantillon plasmatique dans les puits respectifs de la plaque d extraction. Ajouter 500 µl d eau bidist. à tous les puits excepté aux échantillons plasmatiques pour corriger les différences de volumes. 2. Pipeter 1000 µl de Tampon d Extraction dans chaque puits. 3. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Extraire 30 min à TA (18-25 C) sur un agitateur orbital ( rpm). Pendant l extraction, la surface du liquide peut mouiller la feuille adhésive, mais le niveau du liquide ne doit pas excéder 2/3 du puits. Un éclaboussement n affecte pas les résultats. 4. Retirer la feuille adhésive. Vider immédiatement la plaque et égoutter le reste de liquide sur du papier absorbant. 5. Pipeter 2 ml d eau bidist. dans chaque puits. 6. Couvrir la plaque avec une nouvelle feuille adhésive. Agiter 5 min à TA (18-25 C) sur un agitateur orbital ( rpm). Un éclaboussement n affecte pas les résultats. 7. Retirer la feuille adhésive. Vider immédiatement la plaque et égoutter le reste de liquide sur du papier absorbant. Egoutter complètement. 8. Pipeter 150 µl de Tampon d Extraction dans chaque puits. Ajouter 50 µl de Réactif d Acylation dans chaque puits. Mélanger immédiatement après avoir pipeté. 9. Extraire 20 min à TA (18-25 C) (sans feuille adhésive) sur un agitateur orbital ( rpm). 10. Vider immédiatement la plaque et égoutter le reste de liquide sur du papier absorbant. Egoutter complètement. 11. Pipeter 2 ml d eau bidist. dans chaque puits. 12. Couvrir la plaque avec une nouvelle feuille adhésive. Agiter 5 min à TA (18-25 C) sur un agitateur orbital ( rpm). Un éclaboussement n affecte pas les résultats. 13. Retirer la feuille adhésive. Vider immédiatement la plaque et égoutter le reste de liquide sur du papier absorbant. Egoutter complètement. 14. Pipeter 300 µl de Tampon de Libération dans chaque puits. 15. Agiter 30 min à TA (18-25 C) (sans feuille adhésive) sur un agitateur orbital ( rpm). Les échantillons préparés doivent être testés le même jour. Si ce n est pas possible, vous pouvez conserver la plaque d extraction recouverte d une feuille adhésive à 2-8 C pendant la nuit. Version / 9

6 Préparation des composants concentrés Diluer / dissoudre Les volumes indiqués ci-dessous sont pour un test avec 6 barrettes (48 dosages). Composant avec Diluant Relation Remarques Stockage Stabilité 25 ml WASHBUF CONC 225 ml eau bidist. 1:10 Mélanger vigoureusement. 2-8 C 4 semaines 120 µl ENZCONJ CONC 6 ml WASHBUF (dilué) PROCEDURE DU TEST (version manuelle) Préparation de la Solution Enzymatique COMT 1:51 Préparer fraîchement et n utiliser qu une fois. Mélanger sans former de mousse C 5 heures La Solution Enzymatique COMT doit être fraîchement préparée directement (max. 15 min) avant emploi. Dissoudre chaque composant de kit de COMT lyophilisé avec 1.25 ml d eau bi-distillée et bien mélanger*. Puis ajouter 1.25 ml de Solution Coenzymatique et, juste avant emploi, 1.25 ml de Tampon Enzymatique et 0.40 ml de COMT Additif, afin d obtenir un volume final de 4.15 ml de Solution Enzymatique. Utiliser 1 flacon pour 48 dosages de noradrénaline. Si vous dosez l adrénaline et la noradrénaline, mélanger (2) flacons pour 48 dosages en adrénaline et 48 dosages en noradrénaline. La Solution Enzymatique peut paraître trouble. Mélanger sans former de mousse. * Si seulement vous n'avez besoin que d'un aliquot de la solution COMT, le reste de la solution COMT doit être congelée immédiatement à -20 C. Dans ces conditions, la solution est stable pendant 1-2 mois Dérivation Enzymatique des Echantillons, Etalons et Contrôles (Microplaque) Il est recommandé de commencer avec l adrénaline dans le cas où vous dosiez l adrénaline et la noradrénaline. Si vous pipetez avec un déplacement positif, vider le fluide résiduel de l embout de la pipette dans les puits correspondants de la plaque d extraction, sinon les extraits pourraient ne pas suffire pour les dosages en noradrénaline. Il est pratique de tenir la plaque d extraction de façon inclinée. Définir et identifier les puits adrénaline et noradrénaline avant d utiliser les microplaques Pour le dosage à but de recherche d homogénéisats tissulaires et de surnageants de culture cellulaire, nous pouvons donner la recommandation générale suivante: Travailler avec des surnageants de culture cellulaire dépend de la matrice ainsi que des concentrations attendues: En suivant le protocole des échantillons urinaires (extraction pour au moins 20 µl de surnageant) vous atteindrez une sensibilité de 0.6 ng/ml. Dans le cas d une matrice avec une addition de serum (sérum de veau foetal), le protocole pour plasma (extraction de 500 µl de surnageant) peut être appliqué pour atteindre des sensibilités correspondant au protocole plasma (cf 16. PERFORMANCE). Pour les homogénéisats tissulaires, ne pas utiliser d acide perchlorique pour l homogénéisation. Adressezvous à IBL pour davantage de détails Noradrénaline pour urine et plasma 1. Pipeter 25 µl de Solution Enzymatique COMT fraîchement préparée dans chaque puits de la Microplaque. Agiter la plaque brièvement. 2. Pipeter 25 µl de chaque Étalon, Contrôle et échantillon extrait dans les puits respectifs. Placer les embouts de pipette directement dans la solution COMT pour cette étape. La couleur vire au rouge. Agiter la plaque brièvement. 3. Pipeter 50 µl de Noradrénaline Antisérum (coloré en bleu.) dans chaque puits. 4. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Incuber 120 min à TA (18-25 C) sur un agitateur orbital ( rpm). Version / 9

7 5. Retirer la feuille adhésive. Jeter la solution d incubation. Laver la plaque 4 x avec µl de Tampon de Lavage dilué. Egoutter l excès de solution en frappant la plaque retournée sur du papier absorbant. 6. Pipeter 100 µl de Conjugué Enzymatique fraîchement préparée dans chaque puits. 7. Couvrir la plaque avec une nouvelle feuille adhésive. Incuber 60 min à TA (18-25 C) sur un agitateur orbital ( rpm). 8. Retirer la feuille adhésive. Jeter la solution d incubation. Laver la plaque 4 x avec µl de Tampon de Lavage dilué. Egoutter l excès de solution en frappant la plaque retournée sur du papier absorbant. 9. Utiliser une micropipette à 8 canaux si possible pour l ajout des Solutions Substrat et d Arrêt. Pipeter ces solutions à la même cadence. Utiliser un déplacement positif et éviter la formation de bulles d air. 10. Pipeter 200 µl de Solution de Substrat PNPP dans chaque puits. 11. Incuber 40 min à TA (18-25 C) (sans feuille adhésive) sur un agitateur orbital ( rpm). 12. Arrêter la réaction substrat en ajoutant 50 µl de Solution d Arrêt PNPP dans chaque puits. Mélanger rapidement le contenu en agitant la plaque. 13. Mesurer la densité optique avec un photomètre à 405 nm (longueur d onde de référence: nm) dans les 60 min suivant l ajout de la Solution d Arrêt. Aucune bulle d air ne doit être visible. 11. PROCEDURE AUTOMATISEE PREPARATIONS PREALABLES AU TEST (version automatisée) Le contenu du kit pour 96 dosages peut être divisé en 2 analyses différentes. Des quantités de gel visibles peuvent se décoller de la surface de la plaque d extraction pendant I extraction. Ceci n influence pas les résultats du test. Une contamination aérienne par des désinfectants contenant du peroxygène pour nettoyer les surfaces ou équipements, utilisés sous forme de poudre ou solutions, comme par ex. VIRKON, doit être évitée. Une telle contamination entrave fortement la performance du test. VIRKON est une marque déposée de DuPont Dilution des Echantillons Les échantillons susceptibles de contenir une concentration supérieure à l étalon le plus concentré doivent être dilués de la sorte: Echantillon doit être dilué avec Remarques Plasma > étalon le plus concentré eau bidist. avant l étape d extraction Urine > étalon le plus concentré 0.1 N HCl avant l étape d extraction Extraction des Échantillons, Étalons et Contrôles (Plaque d Extraction) (version automatisée) 1. Pipeter 30 µl de chaque Étalon, Contrôle et échantillon urinaire et 750 µl de chaque échantillon plasmatique dans les puits respectifs de la plaque d extraction. Ajouter 750 µl d eau bidist. à tous les puits excepté aux échantillons plasmatiques pour corriger les différences de volumes. 2. Pipeter 1000 µl de Tampon d Extraction dans chaque puits. 3. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Extraire 30 min à TA (18-25 C) sur un agitateur orbital ( rpm). Pendant l extraction, la surface du liquide peut mouiller la feuille adhésive, mais le niveau du liquide ne doit pas excéder 2/3 du puits. Un éclaboussement n affecte pas les résultats. 4. Retirer la feuille adhésive. Vider immédiatement la plaque et égoutter le reste de liquide sur du papier absorbant. 5. Pipeter 2 ml d eau bidist. dans chaque puits. 6. Couvrir la plaque avec une nouvelle feuille adhésive. Agiter 5 min à TA (18-25 C) sur un agitateur orbital ( rpm). Un éclaboussement n affecte pas les résultats. 7. Retirer la feuille adhésive. Vider immédiatement la plaque et égoutter le reste de liquide sur du papier absorbant. Egoutter complètement. 8. Pipeter 150 µl de Tampon d Extraction dans chaque puits. Ajouter 50 µl de Réactif d Acylation dans chaque puits. Mélanger immédiatement après avoir pipeté. 9. Extraire 20 min à TA (18-25 C) (sans feuille adhésive) sur un agitateur orbital ( rpm). Version / 9

8 10. Vider immédiatement la plaque et égoutter le reste de liquide sur du papier absorbant. Egoutter complètement. 11. Pipeter 2 ml d eau bidist. dans chaque puits. 12. Couvrir la plaque avec une nouvelle feuille adhésive. Agiter 5 min à TA (18-25 C) sur un agitateur orbital ( rpm). Un éclaboussement n affecte pas les résultats. 13. Retirer la feuille adhésive. Vider immédiatement la plaque et égoutter le reste de liquide sur du papier absorbant. Egoutter complètement. 14. Pipeter 450 µl de Tampon de Libération dans chaque puits. 15. Agiter 30 min à TA (18-25 C) (sans feuille adhésive) sur un agitateur orbital ( rpm). Les échantillons préparés doivent être testés le même jour. Si ce n est pas possible, vous pouvez conserver la plaque d extraction recouverte d une feuille adhésive à 2-8 C pendant la nuit Préparation des composants concentrés (version automatisée) Diluer / dissoudre Les volumes indiqués ci-dessous sont pour un test avec 6 barrettes (48 dosages). Composant avec Diluant Relation Remarques Stockage Stabilité 50 ml WASHBUF CONC 450 ml eau bidist. 1:10 Mélanger vigoureusement. 2-8 C 4 semaines 190 µl ENZCONJ CONC 9.5 ml WASHBUF (dilué) PROCEDURE DU TEST (version automatisée) Version / 9 1: Préparation de la Solution Enzymatique COMT Préparer fraîchement et n utiliser qu une fois. Mélanger sans former de mousse C 5 heures La Solution Enzymatique COMT doit être fraîchement préparée directement (max. 15 min) avant emploi. Dissoudre chaque composant de kit de COMT lyophilisé avec 1.25 ml d eau bi-distillée et bien mélanger*. Puis ajouter 1.25 ml de Solution Coenzymatique et, juste avant emploi, 1.25 ml de Tampon Enzymatique et 0.40 ml de COMT Additif, afin d obtenir un volume final de 4.15 ml de Solution Enzymatique. Utiliser 1 flacon pour 48 dosages de noradrénaline. Si vous dosez l adrénaline et la noradrénaline, mélanger (2) flacons pour 48 dosages en adrénaline et 48 dosages en noradrénaline. La Solution Enzymatique peut paraître trouble. Mélanger sans former de mousse. * Si seulement vous n'avez besoin que d'un aliquot de la solution COMT, le reste de la solution COMT doit être congelée immédiatement à -20 C. Dans ces conditions, la solution est stable pendant 1-2 mois Pour le dosage à but de recherche d homogénéisats tissulaires et de surnageants de culture cellulaire, nous pouvons donner la recommandation générale suivante: Travailler avec des surnageants de culture cellulaire dépend de la matrice ainsi que des concentrations attendues: En suivant le protocole des échantillons urinaires (extraction pour au moins 20 µl de surnageant) vous atteindrez une sensibilité de 0.6 ng/ml. Dans le cas d une matrice avec une addition de serum (sérum de veau foetal), le protocole pour plasma (extraction de 500 µl de surnageant) peut être appliqué pour atteindre des sensibilités correspondant au protocole plasma (cf 16. PERFORMANCE). Pour les homogénéisats tissulaires, ne pas utiliser d acide perchlorique pour l homogénéisation. Adressezvous à IBL pour davantage de détails Noradrénaline pour urine et plasma 1. Pipeter 25 µl de Solution Enzymatique COMT fraîchement préparée dans chaque puits de la Microplaque. Agiter la plaque pour 1 min. 2. Pipeter 25 µl de chaque Étalon, Contrôle et échantillon extrait dans les puits respectifs. Agiter la plaque pour 1 min. 3. Pipeter 50 µl de Noradrénaline Antisérum (coloré en bleu.) dans chaque puits. 4. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Incuber 120 min à TA (18-25 C) sur un agitateur orbital ( rpm). 5. Jeter la solution d incubation. Laver la plaque 6 x avec µl de Tampon de Lavage dilué. 6. Pipeter 100 µl de Conjugué Enzymatique dans chaque puits.

9 7. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Incuber 60 min à TA (18-25 C) sur un agitateur orbital ( rpm). 8. Jeter la solution d incubation. Laver la plaque 6 x avec µl de Tampon de Lavage dilué. 9. Les étapes de pipetage pour les Solutions de Substrat et d Arrêt doivent être menées avec les mêmes intervalles de temps. 10. Pipeter 200 µl de Solution Substrat PNPP dans chaque puits. 11. Incuber 40 min à TA sur un agitateur orbital ( rpm). Si la température dans I automate dépasse 25 C, diminuer le temps d incubation á 30 min pour éviter des signaux trop élevés. 12. Arrêter la réaction substrat en ajoutant 50 µl de Solution d Arrêt PNPP dans chaque puits. Mélanger rapidement le contenu en agitant la plaque. 13. Mesurer la densité optique avec un photomètre à 405 nm (longueur d onde de référence: nm) dans les 60 min suivant l ajout de la Solution d Arrêt. 12. CONTROLE QUALITE Les résultats du test ne sont valides que si le test a été réalisé en suivant les instructions. De plus, l utilisateur doit strictement se conformer aux règles BPL (bonnes pratiques de laboratoire) ou directives comparables. L utilisateur et/ou le laboratoire doivent disposer d un système validé pour établir un diagnostic conformément aux principes de BPL. Tous les étalons et contrôles du kit doivent être trouvés dans les gammes acceptables indiquées sur les étiquettes et dans le certificat de Contrôle Qualité (CQ). Si ces critères ne sont pas remplis, le test est non valide et il doit être répété. Chaque laboratoire devrait utiliser des échantillons connus comme contrôle supplémentaire. Il est recommandé de participer aux programmes de contrôle qualité appropriés. En cas de déviation des résultats, vérifier les origines éventuelles techniques: dates de péremption des réactifs (préparés), conditions de stockage, pipettes, appareils, conditions d incubation et méthodes de lavage. 13. CALCUL DES RESULTATS Les DO des étalons obtenues (axe y, linéaire) sont reportées en fonction des concentrations correspondantes (axe x, logarithmique) soit sur papier semi-logarithmique ou soit en utilisant une méthode automatique. Les méthodes cubic spline, 4 Parameter Logistics ou Logit-Log donnent de bons résultats. Appliquer chaque signal des étalons pour le calcul de la courbe étalon. Les concentrations des contrôles du kit et des échantillons urinaires peuvent être lues directement à partir de la courbe étalon correspondante. Du fait d un volume plasmatique utilisé supérieur (500 µl - version automatisée: 750 µl - au lieu de 20 µl - version automatisée: 30 µl - pour les étalons), les résultats des échantillons de plasma doivent être divisés par 25. Pour les unités en pg/ml, veuillez multiplier par En cas d échantillons préalablement dilués, ne pas oublier de multiplier leurs valeurs par le facteur de dilution ayant été appliqué. Les échantillons montrant une concentration supérieure à celle de l étalon le plus concentré doivent être dilués de la façon décrite dans les PREPARATIONS PREALABLES AU TEST et testés de nouveau. Calculer la sécrétion de 24 h pour chaque échantillon urinaire: µg/24 h = µg/l x L/24 h Conversion: 1000 pg/ml = 1 ng/ml Noradrénaline (µg/l) x = nmol/l Courbe Etalon Typique (Noradrénaline) (Exemple. Ne pas utiliser pour vos calculs!) Étalon Noradrénalin e (ng/ml) DO Moyenne DO/DO max (%) A B C D E F (OD) Noradrenalin ELISA (ng/l) Version / 9

10 14. VALEURS ATTENDUES Les résultats ne peuvent pas être l unique raison de conséquences thérapeutiques. Ils doivent être corrélés à d autres observations cliniques et tests diagnostiques. Des sujets apparemment sains ont montré les valeurs suivantes: (5 % - 95 % percentile) Il est recommandé que chaque laboratoire établisse ses propres valeurs normales. Urine Plasma µg/j nmol/j pg/ml nmol/l Noradrénaline < 90 < 535 < 600 < LIMITES DE LA PROCEDURE La collecte des échantillons a une influence significative sur les résultats du test. Voir le paragraphe COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS pour plus de détails. Pour les réactivités croisées, voir PERFORMANCE. Les composants sanguins suivants n ont pas d effets significatifs (+/-20%) par rapport aux valeurs attendues) sur les résultats du test jusqu aux concentrations indiquées ci-dessous: Hémoglobine Bilirubine Triglycérides 2.0 mg/ml 1.0 mg/ml 91 mg/ml 16. PERFORMANCE Substance Noradrénaline Adrénaline < 0.02 Spécificité Analytique Réactivité croisée d autres Noradrénaline 100 (Réactivité Croisée) substances testées < 0.02 % Métanéphrine < Normétanéphrine < Sensibilité Analytique Urine 0.6 ng/ml (Limite de Détection) Plasma 20 pg/ml Signal moyen (Etalon zéro) + 2SD Précision Gamme (ng/ml) CV (%) Intra-Essai Urine Plasma Inter-Essai Urine Plasma Gamme (ng/ml) Dilution en Série jusqu au Gamme (%) Linéarité Urine : Plasma : Pas d effet crochet détecté. Récupération Moyenne (%) Gamme (%) % Récupération après enrichissement Comparaison de Méthode versus HPLC Urine Plasma IBL = 0.75 x HPLC r = 0.945; n = LITTERATURE DE REFERENCE DU PRODUIT 1. Creces J., Appleton Ch.: Catecholamines and their Metabolites: Evaluation of a commercial ELISA. Clin. Biochem., QML Pathology, Brisbane QLD (2004) 2. Westermann J, Hubl W, Kaiser N, Salewski L, Simple, rapid and sensitive determination of epinephrine and norepinephrine in urine and plasma by non-competitive enzyme immunoassay, compared with HPLC method. Clin. Lab., 48: (2002) Version / 9

11 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /