Patch clamp : étude des canaux ioniques

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1 Pour la science n 175 Mai 1992: la technique du patch clamp Patch clamp : étude des canaux ioniques Mathieu SCHMITT

2 Intérêt du patch clamp Technique électrophysiologique permettant l étude biophysique et biomoléculaire des canaux ioniques Neher et Sakmann 1981: mise au point des techniques de patch clamp. Prix Nobel de médecine en 1991

3 Concept du patch clamp Dépression dans la pipette Forte résistance Pour la science n 175 Mai 1992: la technique du patch clamp Isolement du fragment (formation du seal) Possibilités : - Potentiel imposé - Enregistrement de courants unitaires ou macroscopiques

4 Dispositif expérimental Micromanipulateur sur table anti-vibration sur coussin d air et cage de faraday Micropipette de µm et pointe de 1 µm et tige d argent

5 Configurations membranaires Cellule attachée (étude d un canal, conservation milieu intracellulaire) Inside-out Cellule entière (étude de tous les canaux, milieu intracellulaire non préservé) Oustide-out

6 Etudes des canaux ioniques

7 Technique du potentiel imposé Maintien du potentiel de membrane Activation des canaux

8 Loi d Ohm: U = R x I Mesures électrophysiologiques Mesure de la conductance = facilité des passages des ions dans le canal R = 1 g I = g x U I total = G x. (E m - E x ) courants unitaires i x = γ x x (E m E x ) courants macroscopiques I total = N. P o. i x I total = N. P O. γ x. (E m - E x ) R : résistance membranaire (Ohm) V: potentiel électrique (volt) I: courant ionique (ampère) G : conductance (Siemens) γ : conductance (Siemens) E ion : Potentiel équilibre de l ion E m : Potentiel de membrane Loi de Nernst R: constante des gaz parfaits; R=8,314 V.C.K-1.mol-1 T: température en Kelvin; T=T c+273 Z: valence de l'ion F: constante de Faraday; F=96500 C.mol-1

9 Analyses des courants unitaires 3 états: Fermé : canal fermé, pas de courant, ouvert par un stimulus Ouvert : canal ouvert, passage de courant Inactivé : fermé non ouvrable qui suit l état ouvert Configuration : Cellule attachée Inside-out Outside-out Courants idéalisés Traitement informatique Déterminer : -Nombre d états de conductance -Vitesse de transition Modèle cinétique du canal plusieurs canaux Courant enregistrés Electrophysiologie moléculaire I: Technique du patch M.Joffre

10 Probabilité d ouverture et de fermeture d un canal P ouvert = aire ouvert aire ouvert + aire fermé P fermé = aire fermé aire ouvert + aire fermé

11 Analyses des courants macroscopiques Configuration: cellule entière Plus faible résistance MΩ Dépolarise : Hyperpolarise: - influx de cation - efflux d anion Ex: influx de Ca 2+ - influx d anion - efflux de cation Ex: efflux de K + I total = P o. N. i x = N. P O. γ x. (E m - E x ) Sommation de l activité des N canaux Sommation de courant unitaire Comportement moyen d un canal

12 Patch perforé Mise au point par Horn et Marty en 1988 Configuration : cellule attachée Formation de pores par la nystatine ou amphotéricine B Perméabilise la membrane Physiologie du neurone D.Trisch. Doin Conserve le milieu intracellulaire avec les messagers secondaires Accès électrique à l espace intracellulaire donc des courants de l ensemble de la membrane Avantage de la configuration cellule entière sans dilution du milieu

13 Etudes de substances pharmacologiques Changement du milieu extracellulaire: Analyses des canaux ioniques stimulés par des récepteurs de la face externe en outside-out (ex : Ach) Analyse de seconds messagers qui activent ou régulent des canaux ioniques en inside-out (ex : PKA, AMPc) Possibilité de changer le milieu intrapipette Techniques auxiliaires Possibilité d étude sur des tissus (ex : réseau neuronal) Utilisation de sondes fluorescentes( ex: fura 2) et de molécules photosensibles

14 Exemples d applications

15 Exemple d application 1 Functional Effects of Two Voltage-Gated Sodium Channel Mutations That Cause Generalized Epilepsy with Febrile Seizures Plus Type 2 Jay Spampanato and al. The Journal of Neuroscience, Octobre 1, 2001, DII mutation T875M DIV mutation R1648H Epilepsie généralisée avec des convulsions fébriles (GEFS+) Epilepsie myoclonique grave de l'enfance (SMEI). Activation et inactivation plus rapides Le gène SCN1A code pour la sous-unité α du canal sodique Nav1.1. Sous-unité du segment S4 du domaine IV Subtitution des histidines en arginine

16 Exemple d application 2 Mucovisidose de Classe IV : Mutations altérant la conduction Mutations des régions transmembranaires des canaux CFTR Exemple : mutations faux sens dans TM1 et TM2 R117H (Arginine en histidine) R334W (Arginine en tryptophane) Technique: Whole-cell Transfection de cellule épithélial bronchique IB3-1 Injection d AMPc Chloride channel and chloride conductance regulator domains of CFTR, the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator Erik M. Schwiebert and al PNAS Mars 3, 1998 vol. 95 no A: Wild-type B : Δ259-M265V CFTR C: TMD

17 Technique: Whole-cell Transfection d un oocyte IBMX inhibiteur de phosphodiestérase AMPc Forskolin Active adenylate cyclase Mutation altérant la sélectivité ionique Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator associated ATP Release Is Controlled by a Chloride Sensor Qinshi Jiang and al. J Cell Biol November 2 : Les CFTR est sélectif pour les anions Br>Cl>I

18 Exemple d application 3 Migraine hémiplégique familiale de type 1 Altération de la cinétique d inactivation du canal Mutation du gène CACNA1A qui code pour une sous-unité de Cav2.1 mutation S218L dans la boucle entre S4 et S5 Rôle du canal calcique P/Q dans la migraine hémiplégique familiale Norbert Weiss and al. MEDECINE/SCIENCES 2007 ; 23 : 53-63

19 Conclusion Mise en évidence des fonctions des canaux cellulaires: Contraction Exocytose Transmission axonale Odorat Absorption Pression osmotique A three-dimensional reconstruction of the quadruple recording shown Analyse de l activité des canaux: Biophysique Sélectivité ionique Sensibilité aux inhibiteurs comme aux activateurs Sensibilité au potentiel Propriété d activation, inactivation et déactivation Etude la physiologie cellulaire Etude des dysfonctionnement canaux ioniques Pathologies

20 Merci à M

21 Resistance (R seal ) et bruit de fond Si R seal est très grande Permet de mesurer une I très faible

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