E. faecium colonisant des greffés de moelle osseuse en Tunisie : fréquences de résistance aux antibiotiques et rôle des éléments génétiques mobiles

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1 E. faecium colonisant des greffés de moelle osseuse en Tunisie : fréquences de résistance aux antibiotiques et rôle des éléments génétiques mobiles Abbassi M.S, Touati A, Achour W, Ben Hassen A Centre National de Greffe de Moelle Osseuse Tunisie

2 Enterococcus faecium : INTRODUCTION Émergence de souches nosocomiales multi-r aux ATB. Aptitude ++ d acquisition d éléments génétiques codant la R à plusieurs familles d ATB. Souches de colonisation au Centre National de Greffe de Moelle osseuse de Tunis (235 souches, ) : Fréquence ++ de R aux : β-lactamines (43,8%) 49,7% en France et 90,3% aux USA (Jones et al. ACMA. 2002). Aminosides : haut niveau de résistance à la gentamicine (RHNG) (33,6%), à la kanamycine (55,7%) et à la streptomycine (47,6%) RHNG : 12,2% en France et 42,5% aux USA (Jones et al. ACMA. 2002). Macrolides : érythromycine (86,4%). Association significative entre RHNG, RHN à la streptomycine et résistance à l ampicilline (p < 0,001). But de l étude : caractérisation moléculaire de souches E. faecium R à l ampicilline et RHNG.

3 MATÉRIEL ET MÉTHODES I 26 souches E. faecium (2005) Souches de référence : E. faecalis E9, RHNG (R. Leclercq, Caen) E. coli k12 V517 (J. Etienne, Lyon). Identification bactériologique : Méthodes conventionnelles, Api20Strep (Bio-Mérieux ). Extraction des plasmides : Méthode de lyse alcaline (Woodford et al. AAC 1993;37:681-4.).

4 MATÉRIEL ET MÉTHODES II Tableau I : Amplification PCR des gènes de résistance Antibiotique Gènes amplifiés Phénotype Amorces (5-3 ) ant(6)-ia S aph(3')-iiia K (N A) ant(4')-ia K T (N A) Strep1- Cgg gag AAT ggg AgA CTT Tg Strep2- CTg Tgg CTC CAC AAT CTg AT Kan1- CTg ATC gaa AAA TAC CgC T Kan2- ACA ATC CgA TAT gtc gat gga g Tob1 - gga AgC AgA gtt CAg CCA Tg Tob2 - TgC CTg CAT ATT CAA ACA gc Aminosides aac(6')-ia-aph(2")-ie K G (A T Nt) A1- TTg gga AgA TgA AgT TTT TAg A A2- CCT TTA CTC CAA TAA TTT ggc T aph(2")-ib G (K A N T Nt) Aph b1- CTT gga CgC TgA gat ATA TgA GCA C Aph b2- gtt TgT AgC AAT TCA gaa ACA CCC TT aph(2")-ic G (K N T) Aph c1- CCA CAA TgA TAA TgA CTC AgT TCC C Aph c2- CCA CAg CTT CCg ATA gca AgA g aph(2")-id G (K T Nt) Aph d1- gtg gtt TTT ACA gga ATg CCA TC Aph d2- CCC TCT TCATACCAATCC ATA TAA CC MLS erm(b), erm(a), erm(c) MLS B Martineau et al. AAC. 2000,44: Tétracycline tet(m) tétracycline Tet 1- Tet 2- gct CAT gtt gat gca gga AA TCC CAT TgT TCA gat TCg gta

5 MATÉRIEL ET MÉTHODES III Électrophorèse en champ pulsé (PFGE): - Digestion de l ADN génomique total par SmaI et ApaI. - Séparation des fragments d ADN sur CHEF DRIII. - Interprétation des profils selon Tenover et al (J Clin Microbiol 1995;33: ). Hybridation de aac(6')-ia-aph(2")-ie : - Transfert de l ADN plasmidique et chromosomique sur membrane de nitrocellulose par la méthode de Southern (Hybond-N+, Amersham Pharmacia Biotech). - Marquage de la sonde, hybridation et détection du signal par ECL direct nucleic acid labelling and detection system (Amersham Pharmacia Biotech).

6 RÉSULTATS ET DISCUSSION

7 FRÉQUENCE DES GÈNES DE RÉSISTANCE AUX AMINOSIDES Phénotypes de résistance Gènes de résistance Fréquence N (%) K G (A Nt T) aac(6')-ia - aph(2")-ie 26 (100) K (A N) aph(3')-iiia 25 (96) S ant(6)-ia 24 (92,3) G (K Nt T) aph(2")-id 16 (61,5) K T (A N) ant(4')-ia 0 (0) G (K N Nt T) aph(2")-ib 0 (0) G (K N T) aph(2")-ic 0 (0)

8 FRÉQUENCE DES GÈNES DE RÉSISTANCE AUX MLS ET À LA TÉTRACYCLINE Gènes de résistance Fréquence N (%) erm(b)* 26 (100) erm(a)* 25 (96,1) erm(c) 0 (0) tet(m) 11 (42,3) *25 souches hébergent erm(b) et erm(a). Association erm(b) et erm(a) rarement rapportée chez les entérocoques.

9 ASSOCIATION DES GÈNES DE RÉSISTANCE Gènes amplifiés Nombre de souches aac6'-aph2'' ; aph2''-id; ant6-ia; aph3'-iiia; erm A; erm B 10 aac6'-aph2'' ; aph2''-id; ant6-ia; aph3'-iiia; tet M; erm A; erm B 5 aac6'-aph2''; ant6-ia; aph3'-iiia; tet M; erm A; erm B 5 aac6'-aph2''; ant6-ia; aph3'-iiia; erm A; ermb 3 aac6'-aph2''; aph2 -Id; aph3 -IIIa; erm A; erm B 1 aac6'-aph2''; ant6-ia; aph3'-iiia; tet M; erm B 1 aac6'-aph2''; erm A; erm B 1 aac(6')-ia-aph(2")-ie : - présent parmi toutes les souches support de la RHNG. -en association avec aph(3')-iiia (25/26) et aph(2 )-Id (16/25) associations fréquentes dans la littérature(ref).

10 PROFIL PLASMIDIQUE Fig1. Gels représentatifs du contenu plasmidique des souches de E. faecium 54kb Chr 2kb

11 PROFIL PLASMIDIQUE 18 profils plasmidiques différents, aucun plasmide détecté parmi 2 souches. Plasmides prédominants : 54kb (23 souches) et 2kb (12 souches). Hybridation : Pas de détection du gène aac(6')-ia-aph(2")-ie au niveau des plasmides. Support plasmidique le plus fréquemment rapporté (plasmides de 30 à 70kb). Plasmide de 54kb : support d autres gènes de résistance, plasmide conjugatif à large spectre de dissémination.

12 ECP AVANT ET APRÈS HYBRIDATION PAR aac(6')-ia-aph(2")-ie Digestion avec SmaI Digestion avec ApaI A M A M kb B B

13 ÉTUDE MOLÉCULAIRE PAR ECP 16 pulsotypes différents origine endogène, pression de sélection antibiotique pour 13 patients. 3 groupes de souches liées (13 patients) : A (9 patients : 5 en greffe et 4 en hématologie). B (2 patients : 1 en greffe et 1 en hématologie). C (2 patients, 1 en greffe et 1 en hématologie). Même origine colonisation (environnement, alimentation), pression de sélection.

14 HYBRIDATION PAR aac(6')-ia-aph(2")-ie Souches Hybridation (+) par aac(6')-iaaph(2")-ie sur PFGE SmaI ApaI Toutes les souches sauf S6,14, S6, S S Hybridation sur des bandes de 96kb indépendamment du type d enzyme chez 25 souches élément génétique indépendant du chromosome (plasmide). S6, S14 : élément génétique mobile 40 kb avec SmaI S20 : plasmide 96 kb + élément génétique mobile de 40 kb?

15 CONCLUSION Souches E. faecium AMP R et RHNG (colonisation patients en onco-hématologie) Accumulation gènes de R codant les mêmes phénotypes de R macrolides (erma, ermb) aminosides (aac(6')-ia-aph(2"), aph2''-id, aph3'-iiia) Hybridation PFGE : éléments génétiques mobiles de 40 et 96kb, support de la RHNG, responsables dissémination résistance, pression de sélection antibiotique (DDT gentamicine).