Optimization of gemcitabine-based chemoradiotherapy with a poly(adp-ribose) polymerase inhibitor, in a pancreatic cancer cell line, MIA PaCa-2
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- Coralie Sévigny
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1 Optimization of gemcitabine-based chemoradiotherapy with a poly(adp-ribose) polymerase inhibitor, in a pancreatic cancer cell line, MIA PaCa-2 W. WAISSI EA 3430 : Progression tumorale et microenvironnement Laboratoire de radiobiologie Centre Paul STRAUSS STRASBOURG Sous la direction de Pr Georges NOEL
2 Cancer du pancréas : Epidémiologie et paysage mutationnel Incidence : nouveaux cas en 2012 Pronostic : Survie globale à 5 ans : 5% Principales mutations : K-Ras, TP53, CDKN2A, Smad4 35% Inca 2012 Vincent et al. The lancet 2012 Siegel et al. CA. Cancer J. Clin Witkiewicz et al. Nat Commun Waddell et al. Nature Bailey et al. Nature 2016
3 activity, which is targeted by most drugs. PARP-1 can also catalyzes poly(adp-ribosyl)ation of itself to an Radiosensibilisation par un inhibiteur de PARP automodification domain 23. This modification results in the accumulation of negative charges onto PARP-1 causing the repulsion of PARP-1 and allowing the access of DNA repair enzymes. Indeed, it is now well established that PARP-1 is a major SSB sensor, allowing the recruitment of DNA repair proteins such as PARP-1 XRCC1, DNA ligase III, polymerase ß, thus leading to DNA repair 24. N F1 F2 L F3 S BRCT Cataly; c domain * Figure 5: Schematic representation of human PARP-1 domains. BRCT: BRCA1 c-terminal domain F1: Zinc finger domain 1; F2: Zinc finger domain 2; F3 Zinc finger domain 3; NLS: Nuclear localization signal; * : Active site containing the PARP signature motif. Fixation sur la cassure 4.2 PARP-BRCA synthetic lethality The concept of synthetic lethality explains the efficacy of PARP inhibitor (PARPi) alone because it targets cells deficient in one DNA repair Recrutement pathway by inhibiting de another. Indeed, PARPi enhance the number protéines de of SSB, which may be converted to DSB and are not repaired by proteins of the HR pathway such as réparations BRCA1/2, thus leading to a genomic instability and cell death 24. Over the last few years, a new concept called BRCAness emerged. It can be described Pol ß as a concept of HR mechanisms deficiency in BRCA wildtype cells 25,26. Key mutations XRCC1 in various proteins essential to HR pathways such as ATM, CHK2 and RAD51 27 ligase or epigenetic modifications of BRCA genes may explain BRCAness. Synthetic lethality and BRCAness phenotypes explains PARPi efficacy when used alone. However, association of PARPi with DNA damaging agents such as IR could be another way to enhance tumor cell killing. Olaparib
4 Lignée cellulaire : MIA PaCa-2 Matériels et méthodes K-Ras muté, TP53 muté, Smad4 sauvage, délétion CDKN2A, BRCA1/2 sauvage. Traitement avant irradiation : Gemcitabine (24h avant) Olaparib (1h avant) Irradiation : Rayons gamma : Cesium 137 Survie clonogénique Cytométrie en flux : Cycle cellulaire, Apoptose Quantification des cassures double-brins
5 Cytotoxicité de la gemcitabine et de l olaparib Milieu ou Milieu Gem/Milieu Ola T-48 T-24 J0 j1 j14 Fraction de Survie Olaparib 1 µm 1,07+/-0,23 Gemcitabine 10 nm 1,06+/-0,15 Gemcitabine 100 nm 0,51+/-0,18 Gemcitabine 1000 nm 0,15+/-0,03
6 Survie clonogénique RT Gem 10 Milieu ou Milieu nm/milieu Ola T-48 T-24 T-1 j1 j2 j14 SER=1,23 SER=1, Dose (Gy) Dose (Gy) Dose (Gy)
7 Cell cycle distribution Cell cycle distribution 100% Irradiation t = -24h t=-1 t=24h R Milieu ola T 100% Cycle cellulaire Irradiation+Olaparib 80% 80% 60% 40% G2/M S G0/G1 60% 40% G2/M S G0/G1 20% 20% 0% 0 Gy 2 Gy 5 Gy 10 Gy 0 Gy 2 Gy 5 Gy 10 Gy 0 Gy 10 Gy 0 Gy+ola 10 Gy+ola 0% 1. L irradiation augmente le nombre de cellules en phase G2/M 2. L Olaparib augmente le blocage en phase G2/M
8 Cell cycle distribution Cell cycle distribution RT Cycle cellulaire 100% Irradiation Milieu Gem 10 nm 100% Milieu T=24h Irradiation+Gemcitabine 80% 80% 60% 40% G2/M S G0/G1 60% 40% G2/M S G0/G1 20% 20% 0% 0 Gy 2 Gy 5 Gy 10 Gy 0 Gy 2 Gy 5 Gy 10 Gy 0 Gy 10 Gy 0 Gy+Gem 10 Gy+Gem 0% 1. La gemcitabine augmente le blocage en phase S en absence d irradiation
9 Gem 10 Milieu nm/milieu T-48 T-24 Pourcentage de cellules positives H2Ax RT Foci Gamma-H2AX Ola/Milieu T-1 T=24h Olaparib Controle Gemcitabine 1. En l absence d irradiation, l olaparib n augmente pas le nombre de foci γ-h2ax à 24h. 2. A 24h, l Olaparib augmente significativement le nombre foci γ- H2AX après irradiation à 5Gy et 10 Gy (p<0,05) 3. La gemcitabine augmente significativement le nombre de foci γ-h2ax à 24h comparativement au non traité (p<0,05). 4. L aspect des foci est différent après traitement par Olaparib par rapport à la gemcitabine
10 Milieu T-48 T-24 Gem /milieu RT Ola/Milieu T-1 T=24h Apoptose Le taux d apoptose précoce n excède pas 5% quel que soit le traitement
11 Conclusions Sur la lignée MIA PaCa-2 Olaparib seul : Non cytotoxique -Ne modifie pas le cycle cellulaire -N induit pas de foci γ-h2ax + Irradiation Radiosensibilisation : -Diminution de la survie clonogénique -Arrêt du cycle en G2/M -Augmentation des foci γ-h2ax -Pas d apoptose Gemcitabine seul à dose non cytotoxique -Arrêt des cellules en phase S + Irradiation Radiosensibilisation : -Diminution de la survie clonogénique -Persistance de foci γ-h2ax Evaluation de la radiosensibilisation par l olaparib et la gemcitabine dans 3 autres lignées cellulaires présentant différentes anomalies dans les voies de réponse aux dommages de l ADN.
12 Remerciements Laboratoire de Radiobiologie Georges NOEL Hélène BURCKEL Anaïs NICOL Gaëlle LARDERET Elodie MAGISSON Financements L Université de Strasbourg Le CRLCC Paul Strauss MERCI DE VOTRE ATTENTION
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