TP 2 : La spécificité des enzymes digestives.

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1 TP 2 : La spécificité des enzymes digestives. Mise en situation et recherche à mener Nous consommons différents glucides, tels que l'amidon, le glycogène ou le saccharose. Ces différentes macromolécules subissent au cours de la digestion une ou plusieurs actions enzymatiques permettant de produire des monosaccharides, comme le glucose ou le fructose. Ces molécules de petite taille peuvent alors être absorbées au niveau de l'intestin et donc parvenir dans la circulation sanguine. Parmi les enzymes impliquées dans la digestion des glucides, nous connaissons l'amylase qui peut catalyser l hydrolyse de l amidon, en une molécule plus simple, le maltose. On cherche à déterminer si l'amylase agit de manière spécifique au cours de la digestion et, si c'est le cas, à expliquer l'origine de cette spécificité. Ressources Document 1 : la digestion des glucides La digestion des glucides s'effectue en plusieurs étapes successives, grâce à l'intervention d'enzymes digestives. Le document ci-dessous représente ces différentes étapes en indiquant les substrats et les enzymes impliquées. Polysaccharides (ex : amidon, glycogène) Matériel disponible : verrerie solution d'amylase différentes solutions de glucides eau iodée liqueur de Fehling Enzymes salivaires et pancréatiques (ex : amylase) Disaccharides (ex : maltose, saccharose) Enzymes intestinales Monosaccharides (ex : glucose) Etape 1 : Concevoir une stratégie pour résoudre une situation-problème (durée maximale : 10 minutes) Proposer une démarche d investigation permettant de déterminer si l'amylase présente une spécificité vis à vis de son substrat, c'est-à-dire qu'elle ne peut agir que sur un seul substrat. Appeler l examinateur pour obtenir la suite du sujet.

2 Etape 2 : Mettre en œuvre un protocole de résolution pour obtenir des résultats exploitables Utiliser le matériel fourni pour déterminer si l'amylase agit spécifiquement sur un seul substrat Matériel à utiliser : - 12 tubes à essais - 4 pipettes avec petit bécher (pour rinçage des pipettes) - 1 plateau de coloration = plaques à cupules - bain-marie 37 + thermomètre - bain-marie 80 + thermomètre - chronomètre - liqueur de Fehling (réactif spécifique des sucres réducteurs, comme le maltose) - solution d amylase (+ pipette 5 ml) - eau distillée - solution d empois d'amidon, de glucose, de saccharose et de glycogène (avec pipette 10 ml) - feutres Conseils pour la réalisation du protocole : 1. Préparer 4 tubes à essai : - tube 1 : 10 ml de solution d'amidon - tube 2 : 10 ml de solution de glucose - tube 3 : 10 ml de solution de glycogène - tube 4 : 10 ml de solution de saccharose Ajouter 3 ml de la solution enzymatique d'amylase dans les 4 tubes Penser à repérer vos tubes 2. Tester le contenu en sucres réducteurs de vos 4 tubes à t=0 3. Placer les 4 tubes au bain-marie à 37 C 4. Tester le contenu en sucres réducteurs de vos 4 tubes à t=15 min et t=30 min. Attention de bien mélanger le contenu des tubes avant les prélèvements et de rincer vos pipettes!!! Tests réalisables : Présence de sucres réducteurs (ex : glucose, maltose) : bien mélanger le contenu du tube, puis prélever environ 2 ml de la solution à tester et la verser dans un tube à essai. Rajouter 1 dose de liqueur de Fehling (le contenu d'un prélèvement). Faire chauffer doucement ce tube sur le bec bunsen. Un précipité rouge-brique indique la présence de sucres réducteurs. Etape 3 : Présenter des résultats pour les communiquer Présenter, sous la forme de votre choix, les résultats obtenus.

3 Etape 4 : Exploiter les résultats obtenus pour répondre au problème 1. Exploiter l ensemble de vos résultats pour déterminer si l'amylase est spécifique d'un seul substrat. 2. A l'aide de vos résultats et des documents ressources ci-dessous, proposer une explication aux résultats obtenus. Documents ressources supplémentaires a. Structure moléculaire de quelques glucides b. Relation entre la forme de l'amylase et son activité L'amidon et le glycogène sont des polymères de glucose ; ces derniers sont reliés entre par des liaisons α 1-4 L'amylase salivaire humaine existe sous plusieurs formes. On a déterminé l'activité de deux de ces formes, la mutation affectant l'enzyme TRPmut pouvant affecter la configuration spatiale de la molécule. Variant enzymatique Activité des enzymes (mesurée par l'intensité de l'hydrolyse de l'amidon, exprimée en U.mg -1 d'enzyme) Amylase normale Amylase mutée : TRPmut 350 c. Une découverte majeure sur l'activité des enzymes D'après TS Spé SVT, édition Bordas 2012

4 Aide 1 : Résultats expérimentaux Tubes Contenu des tubes Tests à la liqueur de Fehling T0 T + 15 min T + 30 min 1 Amidon + amylase Absence de précipité rouge 2 Glucose + amylase 3 Glycogène + amylase Absence de précipité rouge 4 Saccharose + amylase Absence de précipité rouge Absence de précipité rouge Absence de précipité rouge Aide 2 Aide 3 :

5 Eléments de correction Etape 1 : Proposer une démarche d investigation permettant de déterminer si l'amylase présente une spécificité de l'amylase vis à vis de son substrat. 1. Ce que je veux faire : On cherche à montrer qu'une enzyme est spécifique de son substrat, c'est-à-dire qu'elle n'agit que sur un substrat précis. Ainsi, si l'amylase est spécifique du substrat sur lequel elle agit (amidon), alors les autres substrats glucidiques ne doivent pas être hydrolysés par l'amylase. Or, l'hydrolyse catalysée par l'amylase produit des sucres réducteurs (maltose). 2. Comment je le fais : Nous allons donc tester l'activité de l'amylase sur différents substrats, en travaillant dans les conditions optimales d activité de l'enzyme (bain-marie à 37 C). 3. Les résultats attendus : Si dans les tubes avec les autres sucres (glycogène, saccharose), on ne peut pas déceler de sucres réducteurs, cela signifie que l'amylase ne catalyse pas leur hydrolyse et donc qu'elle est bien spécifique. Si au contraire, on observe des sucres réducteurs, alors on pourra en déduire que l'amylase n'est pas spécifique de l'amidon. Etape 2 : Protocole Etape 3 : Présentation des résultats Tableau de présentation des résultats expérimentaux Tubes Contenu des tubes placés à 37 C 1 Amidon + amylase Absence de précipité rouge 2 Glucose + amylase 3 Glycogène + amylase Absence de précipité rouge 4 Saccharose + amylase Absence de précipité rouge T0 Tests à la liqueur de Fehling T + 15 minutes Absence de précipité rouge Etape 4 : Exploitation Le tube 2 (glucose + amylase) nous sert de témoin permettant de vérifier l'efficacité du test à la liqueur de Fehling. Le document 1 nous rappelle que la présence de sucres réducteurs (glucose et maltose) traduit l'hydrolyse des polysaccharides. On en déduit donc que dans les tubes 1 et 3, le substrat a été hydrolysé puisque des sucres réducteurs ont été identifiés. En revanche, dans le tube 4, nous ne voyons aucune modification (par de formation de sucres réducteurs) ce qui signifie que les molécules de saccharose n'ont pas été modifiées en présence de l'amylase. Donc, l'amylase a pu agir sur deux substrats différents, l'amidon et le glycogène, ce qui permet d'affirmer que l'amylase n'agit pas de manière spécifique. Cela s'explique par la structure spatiale très similaire de l'amidon et du glycogène (doc a). Or, une enzyme agit sur des substrats dont la configuration spatiale permet une interaction entre l'enzyme et son substrat (doc b). Cela explique pourquoi une mutation peut entraîner une réduction de l'activité enzymatique (doc b), puisque la mutation peut modifier la structure de l'enzyme rendant difficile voire impossible l'interaction enzyme/substrat. La spécificité- plus ou moins stricte d'une enzyme - peut s'expliquer par la configuration de l'enzyme rendant possible l'interaction entre l'enzyme et son substrat.