Apport du laboratoire au diagnostic des infections virales VIH

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1 Apport du laboratoire au diagnostic des infections virales VIH Marie-Edith Lafon et Camille Tumiotto 08/02/2017

2 Marie-Edith Lafon Méthodes virologiques disponibles (courantes) Détection d' Anticorps PCR qualitatives et quantitatives Nouvelles techniques de biologie moléculaire : PCR multiplex, PCR unitaires adaptées à l urgence Détection d Antigènes Quand demander ces examens et comment les interpréter? Exemples par syndrome - hépatites virales - méningo-encéphalites - pneumopathies - diarrhées - CMV - HPV

3 Prélèvements et méthodes virologiques courantes Sérologies virales Biologie moléculaire : PCR, séquençage Sérum Détection d antigènes - Lames pour IF - Ecouvillons/sécrétions pour tests rapides Phase pré-analytique L (Revir 2007, Remic 2015) Transport à +5 C - sérologies virales : tubes secs non centrifugés au maximum 48h - charges virales : centrifugation congélation au maximum 6h après prélèvement - Tubes EDTA - Écouvillons (virocult) - Tubes stériles : LCR, urine, LBA - Biopsies non fixées

4 Sérologies virales But : mise en évidence d un contact Intérêts : automatisation, rapidité, sensibilité / spécificité (ELISA) ELISA Limite : sensibilité moindre aux âges extrêmes croisements antigéniques (très rares) faux positifs (moins rares )? Ac Chémiluminescence tubes unitaires HIV, HTLV, HCV, HBV, HAV CMV, EBV, HSV, VZV, rubéole, B19, rougeole, oreillons

5 Biologie moléculaire : PCR, séquençage PCR en temps réel : - Quantitatives = «charges» HIV, HBV, HCV, CMV, EBV, HHV6, BKV, AdV - Qualitatives : HSV, VZV, B19, HHV8, Grippe, multiplex Séquençage : HIV, HCV, HBV, CMV, HSV, Pas de tube hépariné

6 Biologie moléculaire But : détecter ou caractériser le génome viral dans un prélèvement. Hybridation : détection HPV oncogènes Amplification génique : PCR en temps réel (tous virus) Applications qualitatives (diagnostic) et quantitatives (suivi sous traitement anti-viral) Séquençage : mutations de résistance et génotype (HIV, HBV, HCV, CMV, HSV) Limites : - Risques de contamination pour les techniques PCR traditionnelles - Aucune preuve du caractère pathogène ou du lien de causalité (viroses persistantes)

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8 Nouvelles méthodes de PCR Multiplex : viroses respiratoires, viroses responsables de gastro-entérites Unitaires prêtes à l emploi adaptées à l urgence : HSV (neuro / gynéco) Avenir? Coût

9 Détection concomitante de plusieurs virus (PCR «multiplex») Grippe A, B, typage H1N1 et H3N2 VRS A, B Rhinovirus Metapneumovirus Virus parainfluenza (4) Bocavirus Adenovirus Coronavirus (3)

10 - FilmArray (BioFire Diagnostics) Approuvé par la FDA. Durée de l analyse : 1h extraction comprise. 200 le test. - Xpert Flu/VRS (GeneXpert Cepheid) Durée de l analyse : 40 minutes

11 Détection d antigènes? Ag HSV avant accouchement But : détection de la présence du virus en forte quantité Intérêt : rapidité (20 minutes à 3 heures) Limites : manque de sensibilité, lecture subjective Autre exemple : viroses respiratoires en urgence pédiatrique

12 Cultures virales But : démonstration du caractère infectieux du virus Intérêt : technique de référence (phénotype d une souche) Limites : lenteur : 3 semaines pour les négatifs nombreux virus non ou mal cultivables

13 Une petite idée des prix Sérologie VIH : B54 Western blot VIH : B160 Sérologie HSV IgM + IgG : B50 Ag Rotavirus dans les selles : B20 Charge VIH : B220 Charge VHC : B220 ADN HPV : B140 idée Génotypage VIH : B1100 Multiplex respiratoire : RIHN 1000 B = 0.27

14 Exemples par syndrome

15 Hépatites

16 Hépatite aiguë HAV -Transaminases - Sérologies virales : HAV : IgM + IgG- HEV : IgM+ IgG- HEV HBV : Ag HBs+ IgM anti HBc+ HCV : Ac totaux Autres : HSV, Huraux et al, Traité de virologie Médicale, ESTEM, Paris, 2003

17 IgM Ag HBs = hépatite B en cours Ac anti HBs = protection Ac anti HBc = contact Profils sérologiques classiques 6 mois Hépatite B aiguë Huraux et al, Traité de virologie Médicale, ESTEM, Paris, 2003

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19 Hépatite chronique Phase de tolérance immunitaire clairance immunitaire porteur inactif ADN HBV : Ag HBs+ Ac anti HBc+ Delta? Hépatite B chronique Marqueurs sériques VHC HCV : Ac anti HCV+ ARN + ARN VHC sérique ARN VHC sérique Ac anti-vhc HEV : Ac anti HEV+ ARN + contexte transplantation Transaminases mois ans Hépatite aiguë Hépatite chronique

20 Phase de tolérance immunitaire clairance immunitaire porteur inactif ADN Hépatite B chronique Huraux et al, Traité de virologie Médicale, ESTEM, Paris, 2003

21 Ac anti HBc = contact Ag HBs = hépatite B en cours Ag HBe Ag HBe Ac anti HBe Ac anti HBe Tolérance Immunitaire ALT normales Clairance Immunitaire ALT élevées Réactivation(s) IgM anti HBc ALT élevées Portage inactif ADN VHB faible ALT normales ou Mutants pré-core ADN VHB élevé ALT élevées Hépatite B chronique années

22 VHB : stratégie de diagnostic et suivi virologique 1) Contact avec le virus : sérologies Ag HBs, Ac anti HBc (Ac anti HBs) Vérification sur second prélèvement obligatoire si AgHBs po 2) Réplication virale : sérologie / biologie moléculaire Ag HBs Ag/Ac anti HBe (mutants pré core!!!) charge VHB (ADN) (mutants pré core) : seuil UI/mL 3) Suivi de traitement : - charge VHB ( 100%) - séroconversion e ( 30%) - séroconversion s ( 1%) (mutations de résistance RT)

23 Marqueurs sériques VHC ARN VHC sérique ARN VHC sérique Ac anti-vhc Transaminases mois ans Hépatite aiguë Hépatite chronique

24 VHC : stratégie de diagnostic et suivi virologique 1) Contact avec le virus : sérologie Ac anti VHC (Ac totaux) Vérification sur second prélèvement obligatoire avec deux méthodes distinctes 2) Réplication virale : biologie moléculaire charge VHC (ARN, méthode la plus sensible possible) 3) Mise en route et suivi de traitement : génotype VHC (génotype 3 ) charge VHC (12 semaines, 3 mois après fin du traitement) mutations de résistance au plus près du nouveau traitement (gènes cibles du premier traitement)

25 VHC : nouvelles cibles Receptor binding and endocytosis Fusion and uncoating Transport and release (+) RNA LD ER lumen LD Virion assembly NS3/4 protease inhibitors ---previr Translation and polyprotein processing ER lumen Membranous web LD NS5B polymerase RNA inhibitors replication Nucleoside/nucleotide Nonnucleoside buvir NS5A* inhibitors *Role in HCV life cycle not well defined asvir Adapted from Manns MP, et al. Nat Rev Drug Discov. 2007;6:

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28 Vaccination HBV : négatifs Ac anti-hbs > 10 UI/mL Ac anti HBc HAV : IgG anti HAV positives

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30 Méningite encéphalite

31 Méningite, encéphalite Première intention : LCR : PCR HSV (VZV et entérovirus) Seconde intention? (contexte) : PCR LCR CMV, HHV6, EBV : possible impact thérapeutique Adénovirus, Parvovirus B19, JCV... Intérêt de la sérologie? Séroconversion ou élévation du titre en IgG dans le sérum Méthodes actuelles non validées pour la sérologie dans le LCR

32 Santé Publique France

33 Infections respiratoires aiguës

34 Infections respiratoires aiguës Privilégier les prélèvements directs : écouvillon nasal, LBA pour PCR idéalement multiplex (et/ou recherche directe d antigènes) Enfant : VRS Influenza Métapneumovirus humain Rhinovirus Infections respiratoires aiguë Adulte en réanimation : HSV CMV Influenza Rhinovirus Personne âgée : Influenza VRS Immunodéprimé : + HHV6, EBV, VRS Seconde intention, si justification clinique +++ : VZV, rougeole, virus émergents (MERS coronavirus, Influenza A ) Sérologies virus respiratoires : aucun intérêt (>95% séropositifs à 5 ans)

35 Santé Publique France

36 Gastro-entérite aiguë

37 Gastro-entérite aiguë : Rotavirus, adénovirus, calicivirus Intérêt du diagnostic? Conforter les mesures d isolement selles : tests Ag immuno-enzymatiques unitaires pour adénovirus et rotavirus PCR multiplex +++ Rota/Adenovirus

38 CMV (HHV5)

39 CMV : stratégie de diagnostic et suivi virologique 1) Contact avec le virus : sérologie Ac anti CMV IgG / IgM Attention : IgM possibles lors des réactivations! 2) Réplication virale : biologie moléculaire (ou antigénémie pp65) charge CMV (PCR quantitative BHN) 3) Suivi de traitement : charge CMV mutations de résistance sur gènes UL97 (kinase virale) ou UL57 (polymérase virale)

40 Définitions Infection CMV patient asymptomatique présence du CMV (virémie, antigénémie, ADNémie) Maladie CMV (virémie, antigénémie ou ADNémie (+)) Syndrome CMV Fièvre persistante 38 C (+/- malaise, arthralgie, myalgie) ET Leucopénie (<3000 leuco/µl) et/ou thrombopénie (<75000/µl) et/ou transaminases (x2n) CMV invasif localisation viscérale prouvée (biopsie, LBA, ) ET dysfonction d organe Paya et al, AJT 2004

41 Stratégies thérapeutiques traitement «tardif» réplication virale traitement prophylactique traitement pré-emptif maladie CMV test diagnostique CMV + patient asymptomatique greffe temps

42 Mécanismes de résistance aux anti-cmv kinase virale UL97 R GANCICLOVIR Ganciclovir-P kinases CELLULAIRES Ganciclovir-PPP ACICLOVIR Aciclovir-P Aciclovir-PPP CIDOFOVIR-P Cidofovir-PPP terminateurs de chaîne FOSCARNET R ADN pol ase virale UL54

43 Ganciclovir Cidofovir Foscarnet 1 2 Mutation UL97 Mutation UL54 Résistance isolée au ganciclovir par défaut de phosphorylation Résistance au cidofovir et au ganciclovir Résistance croisée Résistance au foscarnet Association de résistances S. Alain, CNR CMV

44 Quand craindre l émergence d une souche résistante? persistance d une infection active à CMV (ADN ou Agpp65 +) pendant plus de 21 jours sous traitement antiviral bien conduit. CV > 0.5 log / semaine sous traitement antiviral absence de réponse clinique lors d un traitement antiviral adéquat Réponse retardée au traitement - ne traduit pas systématiquement une résistance - facteur de risque de récurrence à surveiller Agpp65 ou ADNémie en début de traitement possible sans résistance

45 HPV

46 Variabilité des HPV > 140 génotypes, dont 120 humains > 40 génotypes peuvent infecter les voies génitales (supergroupe A) HPV 16 HPV 31 HPV 52 HPV 45 HPV 18 S Alain, 2006

47 HPV : risque oncogène variable 90% HPV à bas risque oncogène 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 HPV à haut risque oncogène 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 67, 68, 73, 82, 26, 53, 66 83% Lésions : condylome ou LSIL* * Low-grade squamous intraepithelial lesions Evolution possible vers HSIL* ou cancer * High-grade squamous intraepithelial lesions S Alain, 2006

48 Les chiffres du dépistage en France Détection moléculaire des HPV à haut risque (Assurance Maladie) Exbrayat C. InVS 2003 ; BEH 02/2005. ANAES, sept 2002.

49 Diagnostic : le prélèvement et son transfert +++ cytologie en phase liquide Laboratoire d anatomocytopathologie Laboratoire de biologie

50 Virologie : biologie moléculaire - Détection de 13 HPV HR : indication ASCUS (nomenclature) 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 (hybridation moléculaire ou amplification génique) Hybrid capture 2 - Génotypage PCR puis hybridation moléculaire D après A. Molijn et al. Journal of Clinical Virology 2005;32S:S43 S51 T. Schenk et al. J. Clin. Microbiol. J Clin Microbiol May;47(5):

51 Distribution des génotypes HPV dans les lésions génitales en France (études EDiTH) prévalence globale HPV 98% cancers invasifs (n=516) âge médian 50 ans prévalence HPV 97,1% inf multiples 22% CIN 2/3 (n=493) âge médian 37 ans prévalence HPV 98,2% inf multiples 31% LSIL (n=397) âge médian 31 ans prévalence HPV 98,2% inf multiples 50% condylomes (n=423) acuminés externes âge médian 30 ans prévalence HPV 98,8% inf multiples 32% Représentation des 15 génotypes les plus fréquents. Etude de la distribution des génotypes d HPV, d après BEH juillet 2009

52 Rodin, Le Secret Analyse clinique Diagnostic virologique

53 VIH Camille Tumiotto

54 Virus enveloppé contenant 2 molécules d ARN Particules sphériques de 80 à 120 nm Structure du VIH-1 (p17) (p7) (p24) electron cryotomography Saleta et al. JCV 2005; Ganser-Pornillos et al. Curr. Op. in Struct Biol, 2008

55 Cycle viral du VIH-1 Maartens G et al. Lancet 2014.

56 Organisation génomique du VIH Traité de Virologie Médicale

57 Vue d ensemble de la pandémie VIH en 2015 Personnes vivant avec le VIH 36,7 millions [34 millions 39,8 millions] Nouvelles infections à VIH en ,0 millions [1,9 million 2,2 millions] Décès liés au sida en ,1 million [940,000 1,3 million] Amérique du Nord et Europe occidentale et centrale 2,4 millions [1,5 million 3,5 millions] Caraïbes [ ] Amérique latine 1,7 million [1,4 million 2,0 millions] Moyen-Orient et Afrique du Nord [ ] Afrique subsaharienne 25,8 millions [24,0 millions 28,7 millions] Europe orientale et Asie centrale 1,5 million [1,3 million 1,8 million] Asie et Pacifique 5,0 millions [4,5 millions 5,6 millions] Environ 5600 nouvelles infections à VIH par jour en 2014 dont 1/3 concerne des jeunes entre 15 et 24 ans!

58 % 56 % 20 %

59 Découvertes de séropositivitévih Parmi les infections VIH en France, environ 1 à 2 % sont liées au VIH-2 et il y a moins de 0,2 % de co-infections VIH-1-VIH-2

60 Objectif mondial de l OMS à l horizon 2020 : 90 % des PVVIH connaissent leur statut sérologique 90% des PVVIH diagnostiqués sous traitement ARV 90% des personnes sous ARV en succès virologique avec une CV supprimée de manière durable. à Au moins 73% des PVVIH avec une CV supprimée. En France en 2010 : En Aquitaine : > 98 % sous ttt et > 91 % ont une CV < 40 copies/ml D. Costagliola

61 4 groupes: Variabilité génomique du VIH-1 M («major») avec une distribution mondiale N («non-m, non-o») isolé uniquement au Cameroun ( 16 cas) O («outlier») retrouvé au Cameroun, au Gabon et en Guinée Equatoriale P au Cameroun ( 2 cas) Dans le groupe M: 9 Sous-types : A, B, C, D, F, G, H, J, K. > 70 Circulating Recombinant forms (CRFs) Tebit DM, Arts EJ Lancet Infect Dis 2011

62 Répartition géographiquedes sous-typesdu VIH-1 En France en 2012 : 57% de sous-type B 43% de sous-type non-b dont la moitié est du CRF 02_AG Hemelaar, Trends in Mol. Med. 2012

63 Modes de contaminations du VIH

64 Histoire naturelle de l infection VIH-1

65 Primo-infection VIH-1 (Syndrome rétroviral aigu) Période d invasion de l organisme par le VIH o Conséquence : activation intense et délétère du système immunitaire o Constitution des réservoirs Intérêt d un diagnostic précoce (+++) o Intérêt individuel o Intérêt collectif Période de forte contagiosité (26 fois plus élevée en PI qu en phase chronique) Charge élevée Population virale homogène Symptomatique dans 50 à 70 %. 11% des nouveaux diagnostics. Manifestations peu spécifiques Rechercher la notion d exposition à un risque

66 Des évolutions inhabituelles Non progresseurs à long terme o Lymphocytes TCD4>500/mm3 au-delà de 10 ans o Charge plasmatique et ADN proviral bas o Groupe hétérogène o Association à certains groupes HLA «HIV elite controllers» : environ 1% o ARN VIH < 50 copies à 10 ans o Les LTCD4 peuvent être infectés (pas de «résistance») o Virus défectif chez la majorité des patients o Niveau d ADN proviral plus faible o Réponse immune très puissante (+++): peu de cellules infectées

67 Cinétique des marqueurs de l infection VIH-1 :

68 Diagnostic de l infection VIH-1 : Technique ELISA de 4 ème génération : o Test mixte et combiné mettant en évidence Ac anti-vih-1/2 + Ag p24 (permet de diminuer la fenêtre sérologique) o Positif 2 semaines après le contage Résultat à confirmer sur un 2 ème prélèvement.

69 Diagnostic de l infection VIH-1 : Western blot : o Test de confirmation o Détection d anticorps dirigés contre plusieurs protéines virales différentes : beaucoup moins de faux positifs qu avec l ELISA. o Limitations: Fenêtre silencieuse (comme l ELISA)

70 Antigénèmie p24 : Diagnostic de l infection VIH-1 :

71 Antigénèmie p24 : Diagnostic de l infection VIH-1 : Si Ag p24 positif: TEST DE NEUTRALISATION indispensable pour valider le résultat Y Y Y Y Y Y + Y Y Y sérum de chèvre avec Ac anti-p24 + sérum de chèvre sans Ac anti-p24

72 Diagnostic de l infection VIH-1 : Autres tests : TROD et Autotest o Utilisés notamment lors des Accidents d Exposition au Sang (AES) pour déterminer statut sérologique du patient source Par des personnels de santé ou personnels formés (association) pour les TROD Par l intéressé directement (autotest) o Réalisé sur salive, sang total, plasma, sérum.. o Résultat en quelques minutes o Si négatif : pas d infection VIH si prise de risque date de plus de 3 mois (vs 6 semaines avec test ELISA 4 ème génération) o Si positif : résultat à confirmer par un test ELISA de 4 ème génération

73 Diagnostic de l infection VIH-1 : RT-PCR pour quantification de la charge virale : o Détection de l ARN viral circulant en nombre de copies de RNA viral présentes dans le plasma Raccourcissement de la fenêtre silencieuse (jusqu à 10 jours après l exposition au virus) Seuil de quantification < 20 copies/ml plasma Suivi de l efficacité du traitement : < 50 copies/ml = succès virologique

74 Algorithme de l HAS :

75 Diagnostic de l infection par le VIH-1 Cas particuliers Primo-infection : Sérologie ELISA + Antigénémie p24 + Charge VIH en urgence

76 Diagnostic de l infection par le VIH-1 Cas particuliers Transmission Mère-Enfant (TME) : o Présence des Ac anti-vih maternel chez enfant jusqu à mois: sérologie et WB positifs o Détection de l ADN proviral à partir des PBMC de l enfant (PCR LTR) à J0, M1, M3 et M6 o CV VIH chez la mère o Sérologie enfant à mois

77 Diagnostic de l infection par le VIH-1 Cas particuliers Encéphalite à VIH : Troubles neurocognitifs souvent se présentant cliniquement comme un syndrome démentiel associé à une réaction méningée de type lymphocytaire. o CV VIH positive dans le LCR o Le plus souvent : associé à une CV VIH positive dans le sang o Intérêt du génotypage dans le LCR car les médicaments pénètrent mal la barrière hémato-encéphalique et les virus peuvent avoir des mutations de résistance aux ARV différentes entre le LCR et le sang

78 Diagnostic de l infection par le VIH-1 Cas particuliers Recherche ARN VIH dans le sperme et les cellules séminales : Réalisé si situation d AMP avec homme infecté par le VIH. o Excrétion VIH dans le sperme discontinue même si CV dans le sang négative o En premier : CV VIH dans le plasma séminal Si négative : CV dans cellules séminales non réalisée Si positive : CV dans cellules séminales o Fraction : correspond à des préparations des cellules en fonction de leur dilution/lavage

79 Diagnostic de l infection par le VIH-1 Cas particuliers Accident d exposition sanguin ou sexuel (AES) : Test rapide pour déterminer statut sérologique du patient source o Si patient source VIH+ : Débuter ARV 4 h après exposition (inutile après 48h et continuer pendant 28 jours o Si patient source connu VIH+: avec CV indétectable : traitement post-exposition (TPE) = ARV du patient source avec CV > 50 cp/ml : traitement à adapter en fonction du génotype de résistance fait chez le patient source

80 50 % d homologie avec le génome du VIH-1 Présent surtout en Afrique de l Ouest, Iles du Cap Vert Par rapport VIH-1: VIH-2 Evolution naturelle plus lente: phase asymptomatique + longue et progression vers stade SIDA + lente Infectivité moins importante: transmission (sexuelle et TME) moins fréquente Moindre réponse CD4 à un traitement efficace Suivi par techniques spécifiques de mesure de CV

81 Déclaration obligatoire de l infection VIH Déclaration de l infection VIH par les biologistes ET les cliniciens.

82 Traitements anti-rétroviraux et résistance :

83 Initiation d un traitement antirétroviral :

84 Initiation d un traitement anti-rétroviral : Instauration d un traitement ARV quel que soit le nombre de lymphocytes T CD4. Bénéfice individuel : empêche la progression vers le SIDA, réduction de la morbi-mortalité et meilleure restauration du système immunitaire. Bénéfice collectif : réduction de la «charge virale globale» et donc diminution du risque de transmission du VIH : TAsP : Treatment As Prevention.

85 Objectifs du premier traitement ARV : Le premier traitement doit conduire en 6 mois au succès virologique : CV VIH < 50 copies/ml. Evaluation de la CV : o M1 : CV doit avoir diminuée d au moins 2 log copies/ml o M3 : CV doit être < 400 copies/ml o M6 : CV doit être < 50 copies/ml Si objectifs non atteints : Observance? Interactions médicamenteuses? Sous-dosage des ARV? Résistance? Tolérance jusqu à M10-M12 si : o CV initiale > 5 log copies/ml, o Décroissance régulière de la CV o M6 < 200 copies/ml

86 Situations particulières CV faible (< 1000 copies/ml) : o Ecarter un défaut de quantification ou une prise cachée d ARV o Ne reporter l initiation de traitement que si les CD4 restent > 500/mm 3 CD4 < 200/mm 3 sans infection opportuniste identifiée : o Débuter ARV rapidement o Dépister une IO latente et entreprendre la prophylaxie des IO Infection opportuniste : o Si pas de traitement spécifique de l IO : début ARV sans délai o Si pneumocystose, toxoplasmose, CMV, HSV ou tuberculose non méningée : ARV différés après 2 à 4 semaines de traitement de l IO. o Si tuberculose ou cryptococcose neuro-méningée : ARV différés d au moins 4 semaines sous réserve de la bonne évolution de l IO. Patient atteint de cancer : o Début des ARV sans délai

87 Choix du premier traitement anti-rétroviral : Plus de 20 ARV disponibles dans 6 classes médicamenteuses : o Inhibiteurs nucléos(t)idiques de la transcriptase inverse (INTI) o Inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) o Inhibiteurs de la protéase (IP) o Inhibiteurs de l intégrase (INI) o Inhibiteurs de fusion (IF) o Inhibiteurs d entrée - antagonistes du CCR5 Plusieurs formes galéniques possibles et plusieurs présentations pharmacologiques disponibles : Combo, STR. Choix basés sur l efficacité, la tolérance, la simplicité d administration et le coût.

88 Choix du premier traitement anti-rétroviral : 2 INTI INNTI Commentaires : TénofovirDF/emtricitabine 245/200 mg x 1 = TDF + FTC = TRUVADA (combo) = TVD 2 INTI INI Commentaires : TénofovirDF/emtricitabine 245/200 mg x 1 = TDF + FTC = TRUVADA (combo) = TVD Abacavir/lamivudine 600/300 mg x 1 = ABC + 3TC = KIVEXA (combo) = KVX TénofovirDF/emtricitabine 245/200 mg x 1 TénofovirDF/emtricitabine 245/200 mg x 1 = TDF + FTC = TRUVADA (combo) = TVD 2 INTI IP/r Commentaires : TénofovirDF/emtricitabine 245/200 mg x 1 = TDF + FTC = TRUVADA (combo) = TVD Rilpivirine 25 mg x 1 = RPV Dolutégravir 50 mg x 1 = DTG Dolutégravir 50 mg x 1 = DTG Elvitégravir/c 150/150 mg x 1 Raltégravir 400 mg x 2 = RAL Darunavir 800/100 mg x 1 = DRV/r Association disponible en 1 cp/j (STR) = EVIPLERA = EVP Uniquement si CV < 5 log copies/ml. Précaution si CD4 < 200/mm 3 Précaution si clairance de la créatinine < 80 ml/min. Surveillance rénale. Prise au cours d un repas et association à un IPP CI Précaution si clairance de la créatinine < 80 ml/min. Surveillance rénale. Peu d interactions médicamenteuses avec le dolutégravir Association disponible en 1 cp/j = TRIUMEQ = TMQ Uniquement si HLA- B*57:01 négatif Peu d interactions médicamenteuses avec le dolutégravir Association uniquement disponible en 1 cp/j = STRIBILD = STB Ne pas initier le traitement si clairance de la créatinine < 70 ml/min Précaution si clairance de la créatinine < 90 ml/min. Surveillance rénale. Interactions médicamenteuses avec le cobicistat Précaution si clairance de la créatinine < 80 ml/min. Surveillance rénale. Pas d interaction médicamenteuse avec le raltégravir. Précaution si clairance de la créatinine < 80 ml/min. Surveillance rénale. Interactions médicamenteuses avec le ritonavir Intérêt particulier si : Immunodépression avancé, charge virale plasmatique élevée, nécessité de débuter un traitement sans délai, femme enceinte.

89 Résistance aux antirétroviraux

90 Molécules antirétrovirales ETR RPV DTG ` 07 ` 08 ` 09 ` 10 ` 11 ` 12 ` 13 ` 14 STB

91 Molécules antirétrovirales ETR RPV DTG ` 07 ` 08 ` 09 ` 10 ` 11 ` 12 ` 13 ` 14 STB RESISTANCES

92 Définitions :

93 Emergence de la Résistance aux ARV Taux d erreur de la transcriptase inverse: 1/ nucléotides soit une mutation incorporée par génome et par cycle de réplication Production virale: particules par jour Taux de recombinaison: 5 à 10 évènements par cycle de réplication Activité APOBEC intense grande diversité génétique avec de nombreux variants viraux (ou quasi-espèce) présents chez un même individu

94 Sélection de la résistance Adapté de Delaugerre et al.

95 Sélection de la résistance Suppression incomplète: Défaut de puissance Taux plasmatique insuffisants Défaut d observance Pré-existence de résistance Adapté de Delaugerre et al.

96 Mutations de résistance Présentes dans les gènes cibles des antirétroviraux : Reverse transcriptase, Protéase, Intégrase, GP41 Elles confèrent un avantage réplicatif aux virus en présence de drogues: Sélection de variants mutés Certaines ont un effet négatif sur la fonction de l enzyme ARN viral ATG Protéine M184V GTG aa sauvage position aa muté

97 Résistance Capacité réplicative (Fitness) Pression sélection

98 Capacité réplicative wt > mutant Adapté de Martinez-Picado and Martinez, 2008

99 ARV Avantage réplicatif Mutant > wt Adapté de Martinez-Picado and Martinez, 2008

100 Résistance Capacité réplicative (Fitness) Pression sélection BARRIERE GENETIQUE

101 Barrière génétique Décrit la capacité à sélectionner des virus résistants à cet ARV lorsque la réplication virale n est pas contrôlée Dépend de: o nombre et type (transition/transversion) de changement nucléotidique nécessaire pour obtenir une mutation de résistance o impact de cette mutation sur le niveau de sensibilité à l ARV o impact de cette mutation sur la capacité réplicative virale EFV, NVP, RAL IP boosté Delaugerre Médecine et maladies infectieuses 2010

102 Les inhibiteurs nucléos(t)idiques (INTI) :

103 Mécanisme d action des INTI : 2 familles d inhibiteurs nucléos(t)idiques: Analogues nucléosidiques: Analogues nucléotidiques: ARV Substrat naturel adenosine Thymidine cytidine Menéndez-Arias TRENDS in Pharmacological Sciences 2002

104 Mécanisme d action des INTI : Les INTIs sont des pro-médicaments, à la différence des INNTIs et IP è Actifs avoir été transformés en composés triphosphorylés par des kinases cellulaires

105 Mécanisme d action des INTI : Les INTIs ressemblent aux dntps naturels: o Compétition pour liaison avec la RT et incorporation dans l ADN viral o Absence de groupement 3'-hydroxyl nécessaire à la polymérisation: à terminaison de l élongation du brin d ADN viral

106 Les INTI

107

108 Mécanisme de résistance aux INTI : Augmentation de l excision de l INTI préalablement incorporé: Thymidines Analogue Mutations (TAMs): mutations favorisant l accès de l ATP au site de polymérisation de la RT, qui va aller «casser» la liaison phosphodiester entre le INTI et l ADN viral. M41L, D67N, K70R, L210W, T215F/Y K219Q/E ± Tout sauf 3TC/FTC Type I TAMs (M41L, L210W, T215Y) >> Type II TAMs (D67N, K70R, T215F, K219Q/E)

109 Mécanisme de résistance aux INTI : Diminution de l incorporation de l INTI dans la chaine d ADNc naissante: la RT mutée est capable de discriminer les INTI des dntp cellulaires o M184V: Fréquente et sélection rapide 3TC/FTC o K65R: Peu fréquente et sélectionnée par TDF+ABC ou ddi Incompatible avec TAMs Tous (TDF++) sauf AZT o L74V ABC, ddi o K70E TDF

110 Mécanisme de résistance aux INTI : o Q151M multidrug resistant complex Q151M + mutations accessoires (A62V, V75I, F77L, F116Y) Ne requiert pas de mutations aux INTI préexistentes Rare Tous sauf TDF o Insertion 69 Apparaît en combinaison de multiples TAMs Rare Tous les INTI!

111 Mécanisme de résistance aux INTI : Update of the drug resistance mutations in HIV-1. Wensing et al., Topics in Antiviral Medecine 2015

112 Les inhibiteurs non nucléosidiques (INNTI) :

113 Structure et chimie différentes des INTIs Pas besoin de modification pour être actifs Fixation sur un site hydrophobe à proximité du site actif de la RT à Changement de conformation de l enzyme altérant son activité Inhibition non compétitive Inactifs sur le VIH-2 Mécanisme d action des INNTI :

114 Les INNTI

115

116 Mécanisme de résistance aux INNTI : Mutations de résistance localisées près ou dans le site de fixation du INNTI Une seule mutation entraine une modification de conformation de la poche à perte d affinité pour le INNTI Faible barrière génétique Résistance croisée Névirapine/Efavirenz> Rilpivirine>> Etravirine o K103N: EFV, NVP o Y181C: EFV, NVP, RPV, ETR o E138A RPV

117 Mécanisme de résistance aux INNTI : Update of the drug resistance mutations in HIV-1. Wensing et al., Topics in Antiviral Medecine 2015

118 Les inhibiteurs de Protéase (IP) :

119 Analogues de substrat Mécanisme d action des IP : Inhibiteurs compétitifs du site actif de la protéase qui empêchent le clivage des précurseurs Gag et Gag/Pol nécessaire à la maturation virale. Ritonavir (dose sub thérapeutique) inhibe cytochrome P450 (CYP)3A à «booste» la dose du IP associé Clavel F, Hance AJ. N Engl J Med 2004.

120 Les inhibiteurs de la Protease

121 Mécanisme de résistance aux IP Mutations majeures/primaires: o Empêchent la fixation de l IP au niveau du site actif en modifiant la conformation de la PR. o +/- spécifiques de chaque IP Ex: NFV: D30N ATV: I50L - Mutations mineures/secondaires: o Augmentent le niveau de résistance o Compensent la perte de capacité réplicative liée aux mutations primaires. o Peuvent être polymorphiques o Barrière génétique haute même si résistance croisée entre certains IP: Ex: famp et DRV

122 Mécanisme de résistance aux IP Update of the drug resistance mutations in HIV-1. Wensing et al., Topics in Antiviral Medecine 2015

123 HIV-1 Protease Dimer Binding with a PI Clavel F, Hance AJ. N Engl J Med 2004.

124 Les inhibiteurs d intégrase (INSTI) :

125 Mécanisme d action des INI Dérivés de diketoacides Inhibiteurs sélectifs du transfert de brin par chélation des ions divalents au niveau du site actif de l enzyme (motif «DDE») 3 PROCESSING STRAND TRANSFER

126 Les inhibiteurs de l integrase

127 Mécanisme de résistance aux INI : Perturbe l interaction avec INI en interférant avec la fixation du cation divalent 3 voies majeures de mutations: o Y143C/R+T97A o N155H + E92Q; o Q148H/R/K+G140S/A Faible barrière génétique Résistance croisée Raltégravir/Elvitegravir >>> Dolutegravir

128 L inhibiteur de fusion :

129 Entry steps and schematic view of gp41 HR1 HR2 Miyamoto and Kodama Antivir Chem Chemother 2012

130 Entry steps and schematic view of gp41 HR1 HR2 Miyamoto and Kodama Antivir Chem Chemother 2012

131 L inhibiteur de fusion

132 Inhibition de la gp41 et résistance T20 (enfuvirtide):peptide synthétique de 36 aa mimant la séquence HR2 de la gp41 (heptad repeat) Inhibiteur compétitif: fixation sur la région complémentaire HR1 Empêche interaction HR1-HR2 nécessaire à la fusion des membranes HR = Heptad Repeat FP = Fusion Peptide TMA = Transmembrane anchor = Enfuvirtide NH 2 COO H FP TMA HR1 HR2 - Résistance par sélection de mutations dans HR1:

133 L inhibiteur d entrée :

134 Mécanismes de l entrée Miyamoto and Kodama Antivir Chem Chemother 2012

135 Inhibiteur de l entrée Le maraviroc (MVC) est un inhibiteur allostérique du récepteur CCR5 : Fixation de l antagoniste dans la région TM à modification conformationnelle de la partie N-terminale et des boucles extracellulaires du CCR5 gênant la fixation de la gp120 Récepteur libre gp12 0 Site de liaison du gp120 sur le CCR5 Haute affinité MVC ( ) lié au CCR5 Site de liaison bloqué par MVC Très faible affinité Blocage entrée du virus Dorr P, Antimicrob Agents Chemother 2005;49 : ; Mosley M, CROI 2006, Abst. 598 à Importance de déterminer le tropisme viral ie l utilisation du corécepteur CCR5 ou CXCR4 pour l entrée (tropisme R5 ou X4)

136 L inhibiteur d entrée

137 Mécanismes de résistance Résistance : la souche reste R5 mais s adapte à la présence de l antagoniste Switch La souche infectante devient X4 par évolution de la souche R5 initiale Emergence La souche infectante devient X4 par émergence d une population minoritaire X4 préexistante CXCR4 CCR5 VIH tropisme X4 VIH tropisme R5 VIH tropisme dual Antagoniste CCR5

138 Détermination de la Résistance aux Antirétroviraux

139 Evaluation des résistances Deux types de tests: Génotypiques o Séquençage total (variants >20% de la population virale) o Interprétations selon algorithmes d interprétation mis au point à partir de corrélation phénotype/génotype et d études de réponse virologique o Résultat rapide, coût relativement modéré o Ex: trugene (Siemens), Viroseq (Abbott), protocoles ANRS Phénotypiques o Mesure in vitro (en culture cellulaire) des concentrations de drogue inhibant la réplication virale (CI50, CI90) o Utilisent des virus recombinants incluant un gène du virus du patient o Nécessitent des structures automatisées; coût important. o Pas d avantage sur le génotype en pratique clinique o Intérêt pour l étude de nouvelles drogues et dans le cadre de protocoles.

140 Tests génotypiques de résistance Amplification par PCR de la protéase, la RT, l IN, la Gp41 et la Gp120 à partir de l ARN plasmatique ou l ADN proviral (si CV < 150 cp/ml) Séquençage par méthode de Sanger

141 En pratique jours EXTRACTION AMPLIFICATION SEQUENCAGE GENOTYPE DE RESISTANCE Plasma (CV > 150 cp/ml) Ultracentrifugation et extraction manuelle de l ARN plasmatique viral Sang total (CV < 150 cp/ml) extraction automatisée de l ADN génomique contenant ADN proviral Plasma: RT-PCR: ARN viral $ ADN Sang total: PCR: ADN proviral $ ADN Plasma: PCR nichée: ADN $ ADN Sang total: PCR nichée: ADN $ ADN Analyse et purification des produits PCR par électrophorèse Réaction de séquence Migration des produits de séquençage Lecture des électrophorégrammes Rendu des résultats

142 Tests génotypiques de résistance Analyse des mutations échantillon vs séquence de référence Interprétation des mutations de résistance en utilisant des algorithmes (ANRS AC11 ou Stanford HIV Database): sensible résistance intermédiaire résistant Détermination du tropisme après analyse de la boucle V3 de la GP120 par l algorithme geno2pheno: CCR5 ou CXCR4

143 Tests génotypiques de résistance GSS (genotypic sensitivity score): Σ des ARV actifs selon l algorithme utilisé et présents dans un régime thérapeutique. à prédictivité de la réponse thérapeutique

144 Détermination du tropisme par tests génotypiques Tests prédictifs basés sur le séquençage du gène env (boucle V3) Algorithmes de prédiction du tropisme viral basés sur les corrélations génotype-phénotype Détection du tropisme X4 à partir de 20% de la population globale (limite Sanger) 11 I G P R I S K R T N N N P R C T G Q A F Y A T G D I R Q A H C 25

145 Cas particuliers :

146 Résistance et variabilité Nombreuses mutations sélectionnées par les ARV sur des virus de sous-type B sont polymorphiques chez les virus non-b: o Résistance au Tipranavir: M36I, H69K, L89M o Résistance à l Etravirine : V90I, E138A, and V106I o Résistance à la Rilpivirine : E138A o Résistance/Sensibilité intermédiaire aux INSTI : E157Q Conséquences sur les voies génétiques utilisées par le virus pour acquérir une résistance aux antirétroviraux o V106M et INNTI pour sous-type C o K65R et TDF pour sous-type C VIH-1 groupe O : Résistance naturelle aux INNTI VIH-2: Résistance naturelle aux INNTI et au fuzeon

147 Résistance et variabilité Nombreuses mutations sélectionnées par les ARV sur des virus de sous-type B sont polymorphiques chez les virus non-b: o Résistance au Tipranavir: M36I, H69K, L89M o Résistance à l Etravirine : V90I, E138A, and V106I o Résistance à la Rilpivirine : E138A o Résistance/Sensibilité intermédiaire aux INSTI : E157Q Conséquences sur les voies génétiques utilisées par le virus pour acquérir une résistance aux antirétroviraux o V106M et INNTI pour sous-type C o K65R et TDF pour sous-type C VIH-1 groupe O : Résistance naturelle aux INNTI VIH-2: Résistance naturelle aux INNTI et au fuzeon Algorithmes d interprétation de la résistance spécifiques

148 Epidémiologie de la résistance aux ARV :

149 Epidémiologie de la résistance Prévalence de mutations de résistance transmise 10 % Cohorte Patients naïfs de traitement année Prévalence Références PRIMO 1446 primo-infectés ,9% Chaix et al., 2008 ANRS C03 Aquitaine 263 patients séroconversion >18 mois ,1% Recordon-Pinson et al., 2009 EuroSIDA 525 chroniquement infectés ,4% Bannister et al., 2008 ODYSSEE 466 chroniquement infectés ,6% Descamps et al., 2010 ODYSSEE 661 chroniquement infectés ,0% Descamps et al., 2012 EuroCoord- CHAIN SPREAD patients chroniquement infectés 4140 patients chroniquement infectés ,5% Wittkop et al., ,3% Hofstra et al., 2015

150 Epidémiologie de la résistance par classe Résistance chez le patient en primoinfection Résistance chez le patient naïf d ARV Chaix et al., AIDS 2009 Descamps et al., JAC 2010

151 Recommandations pour l évaluation de la résistance aux antirétroviraux

152 Intérêt du génotype de résistance VIH Pour le premier traitement ARV : prescrire un test génotypique de résistance lors du diagnostic de l infection à VIH pour fonder son choix de premier traitement en tenant compte de ses données. Dans le cas d un traitement virologiquement efficace : prendre en compte l antériorité thérapeutique en termes de résistance et de tolérance avant de changer un traitement ARV Dans les situations d échec virologique : construire un schéma thérapeutique comportant si possible 3 molécules actives, sur la base de l histoire thérapeutique et génotypique.

153 Génotypes ARN, ADN et cumul des génotypes :

154 Arrêt du traitement à disparition des mutations des résistances Génotype de résistance peu informatif

155 Séquençage Sanger Sanger 20% Suppression incomplète: Défaut de puissance Taux plasmatique insuffisants Défaut d observance Pré-existence de résistance 150 copies/ml CV lim seq

156 Test de résistance sur ADN proviral Quand CV est positive mais inférieure à 150 cp/ml (limite technique pour génotypage ARN) Quand CV est indétectable ou inférieure à 20 cp/ml, pour un switch o Si présence de DRM : valeur prédictive + pour un échec virologique o Si absence de DRM : pas de valeur prédictive Si génotypes antérieurs disponibles, réinterprétation + cumul des données Sinon regarder historique des CV et des traitements

157

158 Génotypes cumulés

159 à associer à la pharmacologie des Antirétroviraux

160 Pharmacologie en bref Tous les ARV ne s associent pas entre eux. Certaines associations sont déconseillées d un point de vue pharmaco. Ne pas hésiter à faire appel aux pharmacologues et à faire des dosages des ARV. De manière schématique : o les INNTI sont inducteurs enzymatiques du CYP3A4. o Les IP boostés ou le STB (à cause du cobicistat) sont inhibiteurs enzymatiques du CYP3A4.

161 Pharmacologie en bref Attention : les patients VIH vieillissent et ont de plus en plus de comorbidités et donc de co-prescriptions. Plusieurs sites existent pour vérifier les interactions médicamenteuses dont : o o

162 Exemple : ARV et DAA VHC

163 Merci pour votre attention

164 PRINCIPE DE LA PCR ARN ADN transcription inverse (RT) dénaturation de l ADN synthèse d ADN hybridation des amorces sens et anti-sens 35 à 45 cycles : production exponentielle du fragment encadré par les amorces

165 Principe du séquençage nucléotidique selon SANGER didéoxynucléotides