CandiSelect

Transcription

1 CandiSelect Milieu de culture chromogénique sélectif utilisé pour l'isolement des levures, l'identification directe de Candida albicans, et l'identification présomptive de C. tropicalis, C. glabrata et C. krusei 2014/10 Sommaire 1. INTÉRÊT CLINIQUE 2. RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST 3. PRINCIPE DU TEST 4. RÉACTIFS 5. PRÉCAUTIONS D'UTILISATION 6. ÉCHANTILLONS 7. PROCÉDURE 8. LIMITES DU TEST 9. VALEURS ATTENDUES 10. PERFORMANCES 11. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1 (FR)

2 1. INTÉRÊT CLINIQUE CandiSelect est un milieu gélosé chromogénique sélectif pour l'isolement et la différenciation des levures. CandiSelect permet l'identification directe de Candida albicans et l'identification présomptive d'autres espèces de levures pathogènes, notamment C. glabrata, C. tropicalis et C. krusei. 2. RÉSUMÉ ET EXPLICATION L'incidence des infections fongiques invasives a régulièrement augmenté ces deux dernières décennies. Avec les récents progrès survenus en matière d'intervention médicale et chirurgicale et la population croissante de patients immunodéprimés, la diversité des agents pathogènes fongiques humains continue d'augmenter. Il est communément admis que les espèces de Candida sont une cause fréquente d'infections nosocomiales s'accompagnant d'une importante morbidité, mortalité et augmentation du coût des soins de santé (1). Bien que C. albicans soit l'espèce la plus impliquée, le nombre d infections dues à d autres espèces est en augmentation, certaines d'entre elles présentant une sensibilité réduite aux agents antifongiques (2). Par conséquent, l'identification rapide des levures au niveau de l'espèce est nécessaire afin de mieux orienter le traitement thérapeutique (3). CandiSelect est un milieu gélosé chromogénique sélectif pour l'isolement et la différenciation des levures : identification directe de C. albicans basée sur la détection de son activité enzymatique hexosaminidase spécifique; identification présomptive de C. tropicalis, C. glabrata et C. krusei, basée sur la détection de l'activité enzymatique phosphatase spécifique, associée à la morphologie des colonies typique de chaque espèce, détection de cultures mixtes de levures. 3. PRINCIPE DU TEST CandiSelect est constitué d une riche base nutritive comprenant des substrats chromogènes, pour la détection des activités enzymatiques spécifiques des levures, permettant ainsi la différenciation des espèces par simple lecture de la couleur et de la morphologie des colonies (1). La présence de chloramphénicol et de gentamicine inhibe la croissance de la plupart des bactéries. La lecture des boîtes CandiSelect peut être effectuée après une incubation de heures : C. albicans se visualise avec des colonies de couleur rose à mauve caractéristique, C. tropicalis, C. glabrata et C. krusei avec des colonies de couleur bleu-vert ; l'identification présomptive de chaque espèce repose sur l'intensité de la couleur associée à la morphologie typique des colonies. 4. RÉACTIFS 4.1. DESCRIPTION CandiSelect (CANDI) est disponible sous le conditionnement suivant : Identification sur l'étiquette Description Présentation / Préparation CandiSelect Boîte de Petri 20 x 90 mm / Prêt à l'emploi Formule approximative du milieu (g/l) Inducteurs de croissance et d'enzyme 40 Hydrates de carbone 10 Peptones 7,6 Agents contrastants 3 Mélange de chloramphénicol + gentamicine 0,5 Mélange de sels 0,4 Substrats chromogènes 0,2 Agar STOCKAGE ET CONDITIONS DE DE MANIPULATIONS Les réactifs peuvent être utilisés jusqu'à la date de péremption indiquée sur l'emballage et imprimée sur les boîtes. Présentation Gélose opaque en Petri Conservation +2-8 C, à l'abri de la lumière Conserver les boîtes dans leur emballage d'origine jusqu'à utilisation, à l abri de la lumière. Refermer le sachet après chaque retrait de boîtes. 5. PRÉCAUTIONS D UTILISATION Pour le diagnostic in vitro uniquement. À usage professionnel uniquement. 2 (FR)

3 5.1. CONSIGNES D HYGIENE ET DE SÉCURITÉ La manipulation de ce milieu est strictement réservée à un personnel qualifié, formé aux procédures de laboratoire et connaissant les risques potentiels. Porter des vêtements de protection adaptés, des gants et des lunettes ou masque, et procéder de manière appropriée en appliquant les Bonnes Pratiques de Laboratoire (3-8). Respecter les techniques d aseptisation et les précautions d usage contre les risques microbiologiques durant toutes les procédures. Éliminer tous les échantillons et le matériel utilisés pour réaliser le test comme des déchets infectieux. Les déchets de laboratoire, chimiques ou biologiques dangereux doivent être manipulés et éliminés conformément à toutes les réglementations locales, régionales et nationales applicables (4,8,9). Pour connaître les recommandations liées aux risques et les précautions relatives à certains produits chimiques contenus dans ce milieu de culture, consulter la fiche de données de sécurité (FDS) disponible sur ou sur demande PRÉCAUTIONS RELATIVES A LA PROCÉDURE PRÉPARATION Minimiser l'exposition du milieu CandiSelect à la lumière (< 6 heures, voir Limites du test 8a). Avant l'ensemencement, laisser les boîtes se stabiliser à température ambiante (18-30 C) à l'abri de la lumière. La surface de la gélose du CandiSelect doit être lisse et humide. Ne pas utiliser les boîtes de Petri qui présenteraient des signes de contamination, dessèchement, fissures ou tout autre signe de détérioration MODE OPÉRATOIRE Effectuer le test à température ambiante (entre 18 et 30 C). Ne pas modifier la procédure de test. 6. ÉCHANTILLONS Se reporter aux directives ou normes correspondantes pour de plus amples informations sur les procédures de prélèvement/ et de manipulation des échantillons (7-10). Utiliser des milieux de transport appropriés et se reporter aux procédures recommandées par le fabricant des dispositifs de prélèvement/transport. 7. PROCÉDURE 7.1. MATÉRIEL FOURNI CandiSelect 7.2. ÉQUIPEMENT REQUIS NON FOURNI Souches de contrôle de qualité Réactifs et matériel de laboratoire 7.3. PROCÉDURE DE TEST Ensemencer le milieu CandiSelect directement à partir de l échantillon par la méthode conventionnelle d isolement en cadran: à partir du dépôt de l'échantillon, effectuer des stries à intervalles rapprochés afin d obtenir des colonies bien isolées, présentant une coloration et une morphologie bien distinctes (voir Limites du test 8h). Incuber les boîtes en position inversée, dans une étuve à C, en atmosphère ambiante, pendant heures, à l'abri de la lumière. Ne pas incuber dans un incubateur à CO CONTRÔLE QUALITÉ Un contrôle de qualité doit être réalisé selon les recommandations locales, nationales ou législatives en vigueur, les exigences de certification et les procédures standardisées de contrôle qualité du laboratoire. Se reporter aux normes en vigueur relatives aux procédures de Contrôle Qualité (10). Contrôler les boîtes de tout signe de détérioration (voir Section ci-dessus). Les performances du milieu CandiSelect peuvent être testées à l'aide des souches de contrôle de qualité suivantes. Préparer une suspension 0.5 Mac Farland pour chaque souche. Diluer la suspension au 1:10ème avec une solution saline stérile, déposer 10 μl à la surface du milieu CandiSelect et réaliser des stries d isolement. Souches Résultats attendus à C Couleur et morphologie des colonies sur CandiSelect C. albicans ATCC C. tropicalis ATCC 750 E. coli ATCC S. aureus ATCC Croissance en 24 heures Croissance en 24 heures Colonies de couleur rose à mauve, lisses à rugueuses (Smooth à Rough - S-R) Colonies de couleur bleu-vert intense colonies sphériques, lisses (Smooth - S) Absence de croissance en 48 heures - Absence de croissance en 48 heures - 3 (FR)

4 7.5. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Lire les boîtes après 24 à 48 heures d incubation. Résultats après h à C Couleur des colonies Morphologie typique des colonies Interprétation ID directe Colonies de couleur rose à mauve Colonies lisses à rugueuses (S-R) C. albicans Colonies de couleur bleu-vert intense Colonies sphériques, lisses (S) C. tropicalis ID présomptive Colonies de couleur bleu-vert pâle Colonies de couleur bleu-vert Colonies plates et brillantes, lisses (S), présentant le plus souvent un motif de couleur caractéristique : «œil de poisson» (colonies avec un centre plus foncé) Colonies larges, aspect sec, contour irrégulier, rugueuses (R) C. glabrata C. krusei Blanche ou légèrement colorée Aucune morphologie typique Pas d'identification présomptive Si aucune croissance ou coloration distincte n'est observée en 24 heures, prolonger l incubation jusqu'à 48 heures. Les résultats du test doivent être interprétés en tenant compte de l'historique du patient, de la source de l'échantillon, de la morphologie, de l aspect microscopique des colonies et, si nécessaire, des résultats de tout autre test effectué. Pour une identification définitive, réaliser des tests conventionnels complémentaires OBSERVATIONS D'autres tests d'identification, tels que des tests d'agglutination au latex ou l'analyse des caractéristiques biochimiques, morphologiques et métaboliques, et des tests de sensibilité aux antifongiques peuvent être effectués directement à partir de colonies isolées sur CandiSelect [AuxaColor 2 (code 56513) et FUNGITEST (code 60780)]. Remarque : Les tests AuxaColor 2 et FUNGITEST ne sont pas disponibles aux États-Unis. 8. LIMITES DU TEST a) Une exposition prolongée à la lumière ( 6 heures) peut conduire à une diminution de la sensibilité et/ou de la coloration des souches de contrôle de qualité ou d isolats de patients. Minimiser l'exposition des boîtes CandiSelect à la lumière (< 6 heures) avant et pendant l'incubation. Une incubation sous CO 2 peut conduire à des cultures faussement négatives. Incuber uniquement en atmosphère ambiante. b) Les performances du CandiSelect ont été optimisées pour une incubation à C de heures. Les boîtes peuvent être lues à tout moment durant cette période. Des températures d'incubation inférieures ou supérieures (ex. 33 ou 39 C) et/ou une durée d'incubation plus courte (< 20 heures pour C. albicans et < 24 heures pour les autres espèces de Candida) peuvent réduire la sensibilité du CandiSelect. La combinaison des deux facteurs (température et durée d'incubation) peut conduire à des variabilités de colorations et de taille des colonies. c) De rares souches de levures ayant des exigences métaboliques particulières peuvent ne pas se développer sur CandiSelect (à savoir C. zeylanoides, C. curvata, C. norvegica, C. sake). d) Une durée d'incubation prolongée jusqu'à 72 heures est recommandée pour la recherche des cryptocoques. e) Les souches de C. dubliniensis (espèce rarement isolée (11,12) ) ont une activité hexosaminidasique et présentent des colonies de couleur rose à mauve sur CandiSelect, toutefois la coloration est souvent plus pâle et apparaît plus tardivement que celle du C. albicans (à 48 heures d'incubation). f) Certaines souches de C. ciferri et C. stellatoidea peuvent présenter des colonies de coloration rose à 48 heures sur CandiSelect, toutefois elles peuvent être facilement distinguées par leur taille de colonies beaucoup plus petites que celles de C. albicans. g) De rares souches de C. albicans présentent des colonies blanches en 24 heures d'incubation, mais la coloration rose de ces colonies apparaît en 48 heures d'incubation. h) Certains échantillons peuvent colorer non spécifiquement le milieu CandiSelect au niveau du dépôt de l'inoculum sur la boîte. L'interprétation de la couleur des colonies doit être effectuée sur des colonies bien isolées et dissociées du point d ensemencement. i) Les souches Candida ayant une faible activité phosphatasique peuvent présenter des colonies de couleur blanche à bleu-vert pâle après 48 heures d'incubation. j) Des espèces rares de Candida peuvent se développer en formant des colonies ressemblant à celles des espèces C. tropicalis, C. glabrata ou C. krusei. 9. VALEURS ATTENDUES Les espèces du genre Candida sont fréquemment impliquées dans les infections fongiques invasives. La candidémie (une des formes de candidose invasive), est la quatrième cause la plus fréquente de septicémie chez les patients hospitalisés aux États-Unis. Une étude conduite par le CDC a démontré qu une candidémie survient chaque année, chez 8 personnes sur Les personnes à haut-risque de candidémie sont les enfants nés prématurés, les patients hospitalisés en chirurgie, et les patients ayant un système immunitaire déficient (13). 4 (FR)

5 10. PERFORMANCES DU TEST ÉTUDE DE REPRODUCTIBILITÉ Un panel de huit souches de levures connues a été testé en duplicat par deux opérateurs différents. La répétabilité des performances culturales (croissance et coloration des colonies) a été testée sur deux lots différents de CandiSelect sur quatre jours. Les lectures ont été effectuées à 24 et à 48 heures d'incubation. Tous les résultats ont été conformes à ceux attendus PERFORMANCES CLINIQUES Une étude prospective a été réalisée en France avec 517 prélèvements (urines 30%, aspirations bronchiques 21%, expectorations 15%, trachées 11%, prélèvements génitaux 3% et 20% de divers) sur CandiSelect en comparaison avec CandiSelect 4 et deux autres milieux chromogéniques. La lecture et l'interprétation des résultats ont été effectuées en suivant les instructions du fabricant. Chaque souche a été identifiée par la technologie Maldi-Tof. Une culture positive à levures a été détectée dans 241 échantillons (prévalence 46,6%), 204 échantillons contenaient une seule espèce de levure, tandis que deux espèces de levure ont été retrouvées en mélange dans 37 échantillons. Un total de 278 souches ont été isolées. Identification directe 191 souches de C. albicans (68,7%) ont été identifiées sur tous les milieux de culture. Seules les colonies colorées ont été considérées comme positives. CandiSelect a permis la détection de souches supplémentaires de C. albicans à 24 heures par rapport aux autres milieux. Après 48 heures d incubation, CandiSelect a une sensibilité de 91,6%, qui est supérieure à celle de CandiSelect 4 et des deux autres milieux. Sensibilité CandiSelect CandiSelect 4 Chromogène A Chromogène B Délai 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h C. albicans 153 (80,1%) 175 (91,6%) 128 (67,0%) 167 (87,4%) 88 (46,1%) 150 (78,5%) 123 (64,4%) 165 (86,4%) Identification présomptive L'identification présomptive de C. glabrata (36 souches isolées), C. tropicalis (18 souches isolées) et C. krusei (5 souches isolées) a été réalisée selon la coloration ou non des colonies : - 86% des souches de C. glabrata ont été isolées en 48 heures sur CandiSelect. - 89% des souches de C. tropicalis ont été isolées en 48 heures sur CandiSelect. - Toutes les souches C. krusei (100%) ont été isolées en 48 heures sur CandiSelect. Elles étaient facilement reconnaissables par la morphologie rugueuse caractéristique et la couleur bleu-vert des colonies. Sensibilité Nombre de souches CandiSelect CandiSelect 4 Chromogène A Chromogène B 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h C. glabrata 36 (13%) 25 (69%) 31 (86%) 25 (69%) 32 (89%) 25 (69%) 30 (83%) 27 (75%) 30 (83%) C. tropicalis 18 (6,5%) 12 (67%) 16 (89%) 15 (83%) 17 (94%) 11 (61%) 17 (94%) 14 (78%) 17 (94%) C. krusei 5 (1,8%) 3 (60%) 5 (100%) 3 (60%) 5 (100%) 3 (60%) 4 (80%) 2 (40%) 5 (100%) Détection d'échantillons en mélange 74 souches de levures ont été isolées dans les 37 prélèvements où deux espèces ont été retrouvées en mélange. 86,5% de ces prélèvements présentaient un mélange de C. albicans avec C. glabrata (45,9%), avec C. tropicalis (24,3%), avec C. parapsilosis (10,8%) et avec C. krusei (5,4%). Cette étude a démontré que CandiSelect permet l'identification directe de C. albicans et la détection des levures les plus fréquemment rencontrées, et permet la détection des différentes espèces dans les échantillons avec un mélange de levures. Le milieu CandiSelect présente une sensibilité supérieure (86,5 %) à celle de CandiSelect 4 et des deux autres milieux à 24 et 48 heures. N = 74 CandiSelect CandiSelect 4 Chromogène A Chromogène B 24 heures 52 (70,3 %) 52 (70,3 %) 45 (60,8 %) 48 (64,9 %) 48 heures 64 (86,5 %) 62 (83,8 %) 59 (79,7 %) 63 (85,1 %) LIMITES DE DÉTECTION Pour déterminer la limite de détection du CandiSelect, six souches ont été testées sur deux lots (C. albicans ATCC et ATCC 10231, C. glabrata ATCC 66032, C. tropicalis ATCC 750, C. krusei ATCC et C. parapsilosis ATCC ). L inoculum a été réalisé avec 10 µl d une dilution au 1:10 de suspension. L ensemencement a été réalisé à partir de 10 µl d une suspension à 0.5 Mac Farland diluée au 1:10ème. Des boîtes de milieu Sabouraud ont été 5 (FR)

6 utilisées pour déterminer la concentration de l'inoculum de chaque dilution. Le nombre de colonies a été dénombré après incubation à C en atmosphère ambiante, pendant 24 et 48 heures. Les données ont permis de déterminer que la limite de détection du milieu CandiSelect est équivalente aux milieux Sabouraud et CandiSelect 4, c est à dire entre CFU/mL en fonction des espèces SENSIBILITÉ ANALYTIQUE Des suspensions de souches d identification connue à 0.5 Mac Farland ont été réalisées en solution saline à partir de cultures de heures à 30 C sur milieu Sabouraud (certaines souches ont nécessité 48 heures d incubation). Les suspensions ont ensuite été diluées au 1:100ème ; puis un ensemencement par stries a été réalisé en déposant 10 µl de cette dilution finale sur les boîtes CandiSelect. CandiSelect a été ensemencé avec 63 souches caractérisées de 25 espèces de levure (dont 15 C. albicans, 5 C. tropicalis, 5 C. glabrata et 5 C. krusei) à la concentration de 10 5 CFU/mL. Parmi ces 63 souches, 59 (93,7%) ont été isolées sur CandiSelect en 48 heures. Les 4 souches qui n ont pas poussé étaient C. zeylanoides, C. curvata, C. norvegica, C. sake (voir Limites du test 8c). N = 63 CandiSelect Délais de lecture 24 h 48 h Sensibilité 82,5% 93,7% L'étude a démontré que le milieu CandiSelect permet : l'identification directe de Candida albicans : toutes les souches de C. albicans testées (100%) ont présenté une coloration rose à mauve en 24 heures. l'identification présomptive d'autres espèces de Candida : toutes les souches testées de C. tropicalis et C. krusei (100 %) se sont développées en produisant la coloration attendue en 24 heures ; C. glabrata s'est développée en 48 heures présentant des colonies avec un «œil de poisson» caractéristique SPÉCIFICITÉ ANALYTIQUE CandiSelect a été ensemencé avec 63 souches caractérisées de 25 espèces de levures (dont 15 C. albicans, 5 C. tropicalis, 5 C. glabrata et 5 C. krusei) pour déterminer leur spécificité de coloration et la sélectivité du milieu en 48 heures. Spécificité de la coloration rose Parmi les 25 espèces testées, seule l'espèce C. dubliniensis présente des colonies de couleur rose à mauve caractéristique en 48 heures (voir Limites du test 8e). Deux autres espèces, C. ciferri (1 souche testée) et C. stellatoidea (1 souche testée), produisent des colonies incolores à 24 heures, qui se sont colorées en rose en 48 heures (voir Limites du test 8f). Spécificité de la coloration bleu-vert (voir Limites du test 8i et j) La coloration bleu-vert des colonies de C. tropicalis, isolées en amas ou individuellement, est d une intensité homogène. En revanche, les colonies de C. parapsilosis et C. guilliermondii présentent une coloration hétérogène ce qui permet de les différencier des colonies de C. tropicalis. La souche de C. rugosa testée a présenté des colonies de couleur bleu-vert et de morphologie proche de celles de C. krusei. La souche de C. lusitaniae testée a présenté des colonies de couleur bleu-vert et de morphologie proche de celles de C. tropicalis. Pour une identification définitive, réaliser des tests conventionnels complémentaires. Sélectivité du milieu CandiSelect a été ensemencé avec les souches S. aureus ATCC et E. coli ATCC avec 10 µl de dilutions au 1:10ème de suspensions 0.5 Mac Farland La croissance des deux souches a été inhibée en 48 heures d'incubation, conformément au résultat attendu. 11. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Sendid B. and al. Prospective evaluation of the new chromogenic medium CandiSelect 4 for differentiation and presumptive identification of the major pathogenic Candida species. J Med Microbiol Apr;56 (Pt 4): Pfaller M.A. and D.J. Diekema (2007). Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev.20: Pappas PG, Rex JH, Sobel JD, Filler SG, Dismukes WE, Walsh TJ, Edwards JE, Infectious Diseases Society of America. Guidelines for treatment of candidiasis. Clin Infect Dis Jan 15;38 (2): Garner, J.S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services (2009). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 5th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 5. Isenberg, H.D. (ed.) Clinical microbiology procedures handbook, vol. 1. American Society for Microbiology. Washington, D.C. 6. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work. Official Journal L262, 17/10/2000, p Basic laboratory procedures clinical bacteriology. J. Vandepitte et al. World Health Organization. Geneva nd edition. 6 (FR)

7 8. Clinical and Laboratory Standards Institute Approved Guideline M29-A3. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 3rd ed. CLSI, Wayne, PA. 9. Miller JM, HT Holmes, K Krisher General principles of specimen collection and handling. Clinical Microbiology procedures handbook ASM Washington. 10. Clinical and Laboratory Standards Institute Volume 24 Number 19. M22-A3. Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media; Approved Standard - Third Edition. 11. Pfaller M.A. and al (2012). Epidemiology and outcomes of candidemia in 3648 patients: data from the Prospective Antifungal Therapy (PATH Alliance ) registry, Diagnostic Microbiol and Infect Dis Tortorano A. M. and al (2004). Epidemiology of candidaemia in Europe: Results of 28-Month European Confederation of Medical Mycology (ECMM). Hospital-Based Surveillance Study. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 23: Invasive candidiasis CDC website: Les plaques doivent être stockées à l'abri de la lumière. Certificats d'analyse disponibles sur Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette - France Tél. : +33 (0) /10 Fax : +33 (0) (FR)