Les protéines du lactosérum: une source potentielle de peptides antimicrobiens

Transcription

1 Les protéines du lactosérum: une source potentielle de peptides antimicrobiens Julie Jean et Émilie Turgeon Colloque STELA mai

2 Empoisonnements alimentaires: une préoccupation réelle! r 76 millions de cas estimés hospitalisations morts - Pertes de 35 milliards $US Mead et al., 1999, Buzby and Roberts, 1997

3 Pathogènes alimentaires Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Shigella Yersinia Bacillus cereus Salmonella nterobacter sakazakii Escherichia coli O157:H7 Campylobacter jejuni Clostridium perfringens MAPAQ, 2008

4 Groupes d aliments d suspects Poissons et fruits de mer Eau et glace Divers Viandes et volailles (40,4%) Oeufs et produits à base d oeufs Fruits et légumes Pain et céréales Lait et produits laitiers (4,7%) MAPAQ, 2008

5 Pathogènes du lait cru Yersinia (1) Salmonella (1) Escherichia coli O157:H7 (1) Campylobacter jejuni (12) MAPAQ, 2008

6 Barrières res microbiologiques traditionnelles Traitements thermiques Réfrigération Ajout d agent de conservation et de sel Emballage

7 Nouvelles tendances du marché - Recours aux barrières microbiologiques traditionnelles est de plus en plus limité - Réduction des antimicrobiens chimiques conventionnels: - Sel (maladies cardiovasculaires) - Dérivés des additifs chimiques (cancer) Recherche d alternatives dont les antimicrobiens naturels (peptides à activité antimicrobienne)

8 Origines des peptides antimicrobiens Végétale (defensines) Microbienne (bactériocines) Marine (dérivés du chitosane) Animale (laitiers)

9 Peptides laitiers bioactifs Caséines α-lactalbumine β-lactoglobuline Lactoferrine Immunoglobulines Transferrine Albumine de sérum Facteurs de croissance

10 Activités s biologiques des peptides laitiers - antihypertension - immunomodulation - antithrombotique - ANTIMICROBIENNE!

11 Peptides antimicrobiens d origine d laitière - Caséines caséine α S2 ( ) cationique (casocidin-i) caséine κ (63-117) (casecidin) caséine αs1 (1-23) (isracidin) - Protéines sériques β-lactglobuline: βlgdt-1 (15-20), -2 (25-40), -3 (78-83) et -4 (92-100) α-lactalbumine: αlac-1 (61-68)S-S(75-80) lactoferrine: lactoferricine B (17-41) - Autres protéines mineures du lait (immunoglobulines, ) - Modification de charges des protéines/peptides laitiers (anti-hiv, anti-hcmv)

12 Spectre d action d de peptides laitiers Gram+ Gram Levure/Moisi. Virus Casocidin I Casecidin Isracidin βlgdt 1, 2, 3, 4 αlac 1, 2 Lactoferricine B Peptides modifiés

13 Mécanismes d actiond Peptides antimicrobiens Modèle en douve de tonneau Modèle des pores toroïdaux Modèle des pores en tapis

14 Objectif Identifier et caractériser des peptides antibactériens issus de l hydrolyse trypsique des protéines du lactosérum

15 Objectifs spécifiques 1. Préparer un hydrolysat trypsique de protéines du lactosérum 2. Séparer, par focalisation isoélectrique, l hydrolysat trypsique en fractions peptidiques 3. Évaluer l activité antibactérienne des fractions peptidiques 4. Caractériser la composition en peptides des fractions par RP-HPLC

16 Préparation de l hydrolysat l trypsique BiPRO (solution aqueuse 5% p/v) ph 8,0, 37 C, 0,005M CaCl 2 Trypsine bovine (ration E:S de 1:100) Suivi du degré d hydrolyse (DH) par osmométrie Arrêt de la réaction à DH= 5,0% Inactivation thermique (75 C, 5 min) de l enzyme Lyophilisation de l hydrolysat trypsique

17 Préparation des fractions peptidiques Reconstitution de l hydrolysat trypsique (12,5 mg/ml) Ajout de l hydrolysat dans la chambre de focalisation isoélectrique (appareil Rotofor) Séparation de l hydrolysat pendant 3 4 hrs Collecte des 20 fractions peptidiques mesure du ph Combinaison en 4 fractions (F1 F4) selon le ph

18 Séparation par focalisation isoélectrique - F1 (ph<3,75) F2 (3,75<pH<4,5) F3 (4,5<pH<7,5) F4 (ph>7,5)

19 Mise en évidence de l activitl activité inhibitrice Trois méthodes: test de diffusion sur gélose, test de microtitration et dénombrement microbien Souches indicatrices: Listeria ivanovii HPB 28 * Listeria innocua RBL 29 E. coli MC 4100 * E. coli ATCC Fractions peptidiques: 10 mg/ml

20 Activité inhibitrice en microplaque 0, 18, 24 heures Densité optique à650 nm Croissance bactérienne en microplaque avec et sans fractions peptidiques Dénombrement sur gélose

21 Activité inhibitrice contre E. coli (MC 4100)

22 Activité inhibitrice contre E. coli (ATCC 25922)

23 Activité inhibitrice contre Listeria ivanovii DO

24 Activité inhibitrice contre Listeria innocua Dénombrement (UFC/ml)

25 Validation contre des pathogènes : Listeria monocytogenes Scott A3 Escherichia coli O157:H7 ATCC 35150

26 Validation contre des pathogènes : L. monocytogenes

27 Validation contre des pathogènes : E. coli O157:H7 (ATCC 35150)

28 Caractérisation risation des fractions par HPLC Appareil HPLC Agilent série 1100 Colonne Luna C-18, 5 µm (Phenomenex) Débit 0,2 ml/min, 40 C Solvant A: 0,11% (v/v) TFA Solvant B: acétonitrile:eau:tfa (90:10:0,1) Gradient: 1% B (0-1min) 100% B ( min) 60% B (1-90 min) 1% B ( min) 100% B ( min) 1% B ( min)

29 Profils HPLC des fractions peptidiques

30 Conclusions Des fractions peptidiques antimicrobiennes issues de l hydrolyse trypsique des protéines du lactosérum ont été identifiés Une fraction (fraction 1 acide) s est avérée la plus prometteuse en terme d activité inhibitrice Une activité inhibitrice significative a été observée contre les Gram + (Listeria) et Gram (E. coli)

31 Perspectives Identification des peptides responsables de l activité antibactérienne dans la fraction 1 par LC-MS Identification et caractérisation de peptides antifongiques (Jérémie Théolier) Produire à plus grande échelle les peptides antimicrobiens déjà identifiés (Véronique D-Mathieu) Réaliser des essais dans des matrices fromagères pour le contrôle de la qualité et de l innocuité (Jérémie Théolier)

32 Remerciements Sylvie Gauthier Julie Jean Ismaïl Fliss Michel Britten Diane Gagnon, Alain Gaudreau, Marie-Andrée Brunet, Céline Paquin, Marie-Michelle Gagnon