Cours de Cytologie & Physiologie cellulaire. Dr A. DEKAR - MADOUI

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1 Cours de Cytologie & Physiologie cellulaire Dr A. DEKAR - MADOUI Promo:

2 Le cytosquelette Médecine dentaire Dr A. DEKAR - MADOUI Promo:

3 Définir le terme cytosquelette Citer les 3 éléments composants le cytosquelette Pour chaque élément: Objectifs pédagogiques -Décrire ses caractéristiques morphologiques (aspects en microscopie électronique) - Donner ses composants moléculaires - Indiquer leurs distributions cellulaire et tissulaire.

4 Objectifs pédagogiques (suite) Donner leurs propriétés physiologiques in situ et in vitro Préciser l effet de quelques drogues corrélativement à leurs applications en thérapeutique Expliquer le mode d intervention de chaque élément dans les processus de biomotilité. Décrire quelques pathologies humaines liées à leur dysfonctionnement

5 INTRODUCTION Le milieu intracellulaire est structuré par un enchevêtrement de Fibrilles qui constituent un support pour les organites membranaires

6 GENERALITES

7 Le cytosquelette: édifices protéiques d aspect filamentaire Dispersés dans le hyaloplasme et le nucléoplasme *Assemblés en réseaux dans le nucléoplasme et le hyaloplasme. *Organisés en structures complexes:( cils et flagelles) Rôle dans le: La morphologie / structure Support des organites Changement de la morphologie réalisation de mouvements coordonnés

8 Eléments constitutifs du cytosquelette Microtubules MT labiles Microfilaments fins d actine filaments épais de Myosine Filaments intermédiaires MT stables Cell.non musculaires: Cell musculaires Disques A des cellules musculaires striées spécifique à chaque type cellulaire

9 Architecture moléculaire des éléments du cytosquelette

10 Répartition cellulaire des éléments du cytosquelette Cas des cellules épithéliales

11 Partie I: Les microtubules Plan Introduction Technique de mise en évidence Ultrastructure et architecture moléculaire Biogenèse Variétés et distribution Propriétés Fonctions

12 Partie I: Les microtubules Plan Introduction Variétés et distribution Technique de mise en évidence Ultrastructure et architecture moléculaire Biogenèse Propriétés Fonctions

13 Les microtubules Microtubules labiles Microtubules stables Dérivés centriolaires (cils + flagelles) Centrioles

14 Les MT labiles Dans les cellules différenciée ( interphase) Dispersés dans le hyaloplasme des différents types cellulaires occupent l axone et les dendrites des neurones dans les cellules en division Forment le fuseau achromatique ( mitotique) au cours des mitoses

16 Techniques de mise en évidence Technique de coupes minces et coloration positive Technique de coloration négative après isolement Ultrastructure Technique d immunofluorescence Architecture moléculaire Répartition

17 Techniques de mise en évidence Technique de coupes minces et coloration positive Technique de coloration négative après isolement Ultrastructure Technique d immunofluorescence Architecture moléculaire Répartition

18 Microtubules en coupes minces et contraste positif Cylindre creux de: 25 nm de diamètre 5nm d épaisseur Longueur variable

19 Aspect ultrastructural des MT en coupe transversale(a ) et en, coupe longitudinale (b). a b

20 La technique d immunofluorescence révèle une distribution centrifuge des MT. Ici marquage de la tubuline à la Rhodamine (en rouge )

21 Distribution des MT labiles dans des cellules différenciées et des cellules en mitose ( marquage par la fluoresceine).

22 Révélation de la répartition des MT labiles (en rouge) dans un axone neuronal en croissance

23 Microtubules isolés après contraste négatif Dans le plan longitudinal : le cylindre comprend : 13 protofilaments formées de la succession de protéines globulaires: les tubulines α β Dans le plan transversal : la surface du MT comporte 13 monomères de tubulines α β alternés

25 Les MT se forment à partir de protéines cytosoliques globulaires: Les tubulines α et β Le monomère α est stable toujours fixé au GTP Le monomère β est instable Peut fixer du GTP ou GDP

26 Par sa capacité d echanger du GDP par du GTP, le monomère de tubuline β est déterminant dans la biogenèse des MT GTP

27 Conditions de la formation d un microtubule ( voir planche tirage)

28 Origine des MT labiles cellulaires La matrice de MAPs des centrosomes est le Centre Organisateur des Micro tubules (COMT) c est donc leur site de nucléation Centrosome = diplosome + matrice de MAPs matrice de MAPs = différentes isoformes de tubulines : α,β, γ

29 Les MT irradient du centrosome vers la périphérie cellulaire ( voir schéma 2 p. 14)

30 Les MT (en vert) irradient de l aire golgienne ( en jaune) vers la surface membranaire

31 Les tubulines γ s organisent en anneau distribués à la Surface du centrosome ce sont les complexes TURC. Ils constituent les points de nucléation des MT

32 Le TURC de tubulines γ constitue un modèle ( amorce= gabarit ) pour la disposition hélicoïdale des dimères αβ qui composent le MT

33 Les MT se forment sur un gabarit formé de tubulines γ

34 Mode de Biogenèse (Voir Schéma 1 page 14)

35 Nucléation (amorce) et croissance( allongement): deux étapes essentielles dans la formation d un MT

36 Etapes de la polymérisation (voir planche) 1 Association longitudinale de tubulines α et β et formation d un protofilament 2 Association latérale de 13 protofilaments en un feuillet 3- élongation du MT

37 Des monomères de tubuline au microtubule (voir schéma 1 p. 14)

38

39 Mécanisme de biogenèse des MT Conditions requises (in vitro) : monomères α, β; GTP; Mg++ Association Tu α Tu β -GTP Allongement en un oligomère rectiligne: protofilament Association latérale de 13 protofilaments en un feuillet fermeture du feuillet et formation d un cylindre creux: le MT

41 Propriétés des microtubules Orientés (polarisés): * extrémité (+) * extrémité (-) Dynamiques: *s allongent par polymérisation * se raccourcissent par dépolymérisation Association à des protéines intrinsèques: Sensibles aux drogues: (Vinblastine, vincristine colchicine) Taxol

42 Polarité Extrémité (+) Extrémité (-)

43 POLARITE des MT

44 La polarité débute dans le dimère de tubulines α, β, (+) (-) Coiffe GTP

45 Dynamique Les vitesses de polymérisation et de dépolymérisation sont inégales aux extrémités (+) et (-). Cette dynamique est un phénomène cyclique déterminées par les coiffes GTP/GDP( voir schéma 3 P57)

46 La coiffe GTP favorise la polymérisation et la coiffe GDP induit la dépolymérisation ( phénomène catastrophe )

47 Visualisation microscopique des microtubules en dépolymérisation

48 La persistance de la coiffe GTP assure la croissance du MT alors que la coiffe GDP favorise sa désintégration Coiffe GTP Coiffe GDP

49 La dynamique des MT est de type tapis roulant, elle dépend des conditions du milieu ( voir schéma 3 P. 57)

50 PROTEINES ASSOCIEES AUX MICROTUBULES MAP s structurales MAP s motrices MAP 2 (dendrites du neurone ) MAP 4 (toutes les cell.) Tau (axone ) Dynéines Kinésines Endocytose exocytose Organisation, assemblage et stabilisation des MT Déplacement des organites Transport des vésicules

51 MAP s structurales Stabilisatrices Déstabilisatrices Neurones MAP 2, Tau Autres cellules MAP4 Clip 170 Les seules à retenir Katanine Op 18

52 Répartition des MAPs dans le neurone MAP2 Dendrites Corps cellulaire Tau Axone Rôle structural Rôle dans la structure du neurone & indirectement dans la neurotransmission

53 Distribution des MAPs dans la cellule nerveuse

54 MAPs structurales dans les neurones

55 Stabilisation par MAP 2

56 Les tau recouvre chaque MT empêchant sa dépolymérisation

57 Altération des Tau (par hyperphosphorylation) et atrophie neuronale dans les neuropathies dégénératives

58 Agrégats de protéines tau hyperphosphorylées ( révélées par immunomarquage (en M.Ph) dans la maladie d Alzheimer

59 PROTEINES ASSOCIEES AUX MICROTUBULES MAP s structurales MAP s motrices MAP 2 (dendrites) MAP 4 (toutes les cell.) Tau (axone ) Dynéines Kinésines Endocytose exocytose Organisation, assemblage et stabilisation des MT Déplacement des organites Transport des vésicules

60 Les MAPs Motrices Dynéine et Kinésine, protéines à 3 domaines Tête, queue et domaine intermédiaire Tête: * site de fixation aux tubulines du MT * site de phosphorylation et d hydrolyse d ATP Queue : *fixation à la membrane d un compartiment intracellulaire organite ou vésicule à déplacer

61 Protéines motrices associées aux microtubules

62 Chargement des compartiment et déplacement le long des MT

63 Mécanisme de déplacement des kinésines sur un MT (Voir planche tirage)

64 Le mouvement effectué par une tête réalise un pas de 8nm, il débute par: * l hydrolyse d ATP de la tête arrière lié à un monomèreβ, libération de la tête, rotation vers l avant et liaison au monpmère β suivant; * Echange ADP / ATP Liaison au monomère B suivant.

65 Pas de course d une kinésine sur un MT

66 Sensibilité aux drogues Drogues déstabilisatrices Drogues stabilisatrices Colchicine Vinblastine Vincristine taxol

67 La colchicine : poison extrait de la plante Colchicum automnale (colchique) site spécifique sur le dimère bloque la polymérisation bout +

68 rouge = colchicine liée sur le dimère de tubuline

69 La vinblastine: extraite de la pervenche de madagascar site spécifique sur le dimère bloque la polymérisation bout +

70 Le Taxol : extrait de l écorce de l'if du pacifique se lie aux monomères β et conduit à la formation de MT stables et empêche leur dépolymérisation

71 Liaison du taxol sur la tubuline

72 Ces molécules exogènes extraites de plantes perturbent la dynamique des MT Elles sont utilisées comme anti-cancereux, la migration des chromosomes étant le résultat de la dynamique des MT, ces drogues sont exercent une action antimitotique

73 Microtubules stables Structures complexes : Centrioles + dérivés ( cils et flagelles)

74 Les centrioles représentent le centre cellulaire Des cellules eucaryotes

75 Les deux centrioles de la cellule constituent un diplosome Ils sont perpendiculaires l un à l autre

76 Micrographie montrant un des deux centrioles en coupe transversale dans l aire golgienne Golgi

77 Leur disposition dans la cellule permet de les visualiser en deux plan sur coupe Cylindre creux de 0,25 µm et de Ø et de 0,5 µm de long

78 La paroi est formée de 9 triplets de MT périphériques inclinés par rapport à l axe Extrémité proximale Extrémité distale

79 Les triplets de MT sont désignés de l intérieur vers l extérieur par les lettres A,B,C (voir planche I P. 18) Coupe transversale à l extrémité proximale Détail d un triplet de MT = Pont de Nexine Coupe transversale à l extrémité distale

80 Protéines associées Le MT A est relié au MT C voisin par des bras de dynéine. Les triplets de l extrémité distale sont reliés au centre par 9 bras radiaires ( en rayons de roue)

81 Cycle cellulaire et Duplication des centrioles

82 Les centrioles se dupliquent à la prophase d une mitose. À partir de la matrice de MAPs qui les accompagne. Chaque centriole père donne un centriole fils

83 Micrographies de MET montrant la duplication du centriole père et l apparition d un centriole fils

84 Cycle cellulaire et Duplication des centrioles

85 Cinétique de la duplication d un centriole : l es centrioles fils naissent latéralement au père

86 Rôles Duplication Mise en place des dérivés centriolaires Mise en place du fuseau mitotique * Duplications multiples * migrations des nouveaux centrioles sous la membrane * Élongation de chacun en cil Elongation du centriole distal en flagelle

87 Ultrastructure des centrioles Cil Centriole = corpuscule basal