Bactériologie de la tuberculose

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1 Bactériologie de la tuberculose Dr Nicolas Veziris CNR des Mycobactéries, Bactériologie, Pitié-Salpêtrière, APHP CiMi, INSERM, UPMC

2 Impact du retard thérapeutique sur la mortalité Greenaway, AJRCCM 2002

3 Impact de l expertise hospitalière sur les performances diagnostiques de la tuberculose TB pour admissions P 0,2-3,3 3,4-9,9 >10 N hôpitaux N patients Dg initial erroné 56% 58% 16% < Délai traitement > 7 jours 43% 35% 12% < Décès 23% 12% 6% < Greenaway, AJRCCM 2002

4 Et en France? Délai 1ers symptômes 1 ère consultation = 47 jours Délai 1 ère consultation diagnostic = 48 jours Tattevin, IJTLD 2012 Délais longs

5 Comment faire le diagnostic d une maladie peu fréquente? Incidence / 10 5 Cancer bronchique = 50 Tuberculose = 8 Lupus = 4 InVS, 2011

6 Sensibilité, spécificité, VPP, VPN VPP % 100 Sp 99% 99% 99% 99% Prévalence % Sensibilité 50% 70% 90% 100% Série2 Série4 Série6 Série7 VPP Se 50% 70% 90% 100% Prévalence requise 9 10 >90% >99% Même une excellente sensibilité ne permet pas de générer une excellente VPP La VPN est toujours excellente mais ne permet pas «d éliminer» le diagnostic puisque la sensibilité est <100%

7 Nécessité du diagnostic Seul diagnostic de certitude permet bactériologique quantification test de sensibilité CULTURE Typage Importance de l identification des patients bacillifères qui sont : les plus graves les plus contagieux (85% de la contagion) EXAMEN MICROSCOPIQUE

8 Rappel : les mycobactéries Classe : SCHIZOMYCETES Ordre : ACTINOMYCETALES Famille : MYCOBACTERIACEAE Genre : MYCOBACTERIUM (1 seul) Espèces : Pathogènes stricts Pathogènes opportunistes Réservoir Homme ou animal malade Environnement Pouvoir pathogène STRICT OPPORTUNISTE Transmission Espèces Interhumaine CONTAGIOSITE -complexe "tuberculosis" (M.tuberculosis, M. bovis, M.africanum) tuberculose -M. leprae lèpre Pas de transmission interhumaine -100 espèces dont 20 responsables d'infections (M. avium ) ="atypiques" mycobactérioses

9 Définition de la tuberculose Infection par une mycobactérie du "complexe tuberculosis"

10 Taxonomie Genre Mycobacterium Espèces : complexe tuberculosis Mycobacterium tuberculosis africanum bovis microtti canetti caprae pinnipedii

11 Caractéristiques générales des mycobactéries Taille : 0,5 µ x 1-10 µ Exigences nutritionnelles Croissance lente (tps division = 20h) Diagnostic bactériologique difficile Paroi épaisse très riche en lipides et en acides mycoliques (90C) ACIDO ALCOOLO RESISTANCE (BAAR) Résistance naturelle à de nombreux antibiotiques et antiseptiques Difficulté thérapeutique (traitement difficile et prolongé) % GC élevé (65% sauf M. leprae 57,8%) Aérobie stricte (microaérophile)/sensible aux UV Habitat naturel = Humain Pas de multiplication dans l'environnement

12 Paroi des mycobactéries

13 IGRA

14 IDR = intradermoréaction IDR : injection sous-cutanée de tuberculine après désinfection par une solution non alcoolique, lecture à 72h En l absence de vaccination par le BCG, une IDR positive indique que le sujet a été infecté par Mycobacterium tuberculosis et confère un risque de tuberculose maladie de 5 à 10% tout au long de la vie

15 Limite de l IDR Le diagnostic de l infection tuberculeuse repose sur l intra-dermo réaction à la tuberculine (IDR) L IDR mesure une hypersensibilité retardée à la tuberculine Mélange d antigènes de M. tuberculosis, bovis et de mycobactéries atypiques En théorie l IDR est moins spécifique dans les populations vaccinées par le BCG

16 Principe des tests interféron Des sujets sensibilisés par des antigènes tuberculeux vont produire de l interféron gamma en présence de ces mêmes antigènes Un haut niveau de production d interféron gamma serait suggestif d infection tuberculeuse Existence de tests «maison» mais aussi de tests commercialisés : QuantiFERON-TB (cellestis limited, carnegie, victoria, australie) et T SPOT-TB (oxford immunotech, oxford, Grande-Bretagne)

17 Des antigènes spécifiques Deux antigènes codés par des gènes se trouvant dans la région RD1 (région de différenciation 1) ESAT6 (early secretory antigenic target 6) CFP10 (culture filtrate protein 10) Ces antigènes sont «spécifiques» de M. tuberculosis, ils ne se trouvent pas chez bovis BCG ni chez la plupart des mycobactéries atypiques sauf kansasii, marinum, szulgaï

18 Pratique des tests Sang total ou CMNS Ag M Tuberculosis ESAT 6, CFP10 Incubation O/N ou 48h Sécretion IFNg T mémoires mesure IFNg ELISA ELISpot IFNg pg/ml SFC/10 6

19 Quelles indications potentielles pour ces nouveaux tests? Diagnostic de la maladie Remplacement de l IDR pour le diagnostic de l infection tuberculeuse

20 Sensibilité des tests interféron pour le diagnostic de la tuberculose maladie HAS,2015 Sensibilité 80 à 90% pour TB bactériologiquement confirmée

21 Spécificité des test interféron chez les sujets sains Chez sujets à faible risque de tuberculose Spécificité BCG- BCG+ IDR 98% 56% Quantiferon 96% 100% Elispot 92% Méta-analyse Menzies 2007 Spécificité non influencé par BCG

22 Population suspecte d infection tuberculeuse latente Problème : pas de Gold Standard Comparaison avec l IDR et corrélation des résultats avec degré d exposition, vaccination BCG etc. Mesure du risque de développer une tuberculose maladie en fonction du résultat du test et comparativement à l IDR

23 Corrélation avec exposition tuberculeuse Ewer 2003 : 533 écoliers exposés Elispot RD1 vs IDR est plus corrélé à l exposition et non influencé par le BCG Brock 2004 : 125 contacts dont 40 vaccinés le quantiferon gold aussi discriminant sur degré d exposition que quantiferon-tb chez les non vaccinés Chez les vaccinés le seul quantiferon gold est très corrélé à l exposition Harada personnels de santé d un hôpital de Tokyo invités à participer, 332 participants (95% vaccinés BCG) 33 quantiferon gold positifs 304 IDR, mm QFT-G positif significativement associé à travail dans service tuberculeux mais pas l IDR QTF-G mieux correllé qu IDR à exposition TB chez les vaccinés BCG

24 Ces test sont-ils prédictifs de développement d une maladie? Diel, 2010, Méta-analyse VPP progression vers la maladie en cas de test positif = 3 à 15% VPN en de non progression vers la maladie = 98 à 99% dans pays à faible incidence

25 Conclusion tests interféron Infection tuberculeuse latente Apparaissent plus spécifiques que l IDR dans un contexte vaccinal Ces tests comme l IDR ne distinguent pas infection et maladie, un examen clinique et une RX sont toujours nécessaires Valeur prédictive de développement de maladie ultérieure meilleure qu IDR mais reste faible HCSP 2011, HAS 2015 A ne faire que si décision de traiter une éventuelle ITL HAS 2015 Aide au diagnostic TB extra-pulmonaire enfant ITL Enquête autour d un cas avant anti-tnf ITL VIH

26 L IDR manque-t-elle de spécificité chez les sujets vaccinés? Farhat, IJTLD vaccinés avant âge de 1 an 9% IDR>10 mm mais seulement 1% si IDR faite >10 ans après BCG vaccinés après âge de 1 an 42% IDR >10mm et 21% si IDR faite >10 ans après BCG (non amélioré avec seuil à 15mm) IDR faussement positive si vaccin fait après âge de 1 an

27 DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE

28 Prélèvements : qualité, volume Warren AJRCCM 200 Expectoration >5 ml Se=92%, <5mL Se=72% Alisjahbana, IJTLD 2005, Kahn Lancet 2007 Education patient sur qualité prélèvement améliore sensibilité Au moins 5 ml Apprendre aux patients à produire une bonne expectoration

29 Mase, IJTLD 2007 Prélèvements : combien? Apport mineur de la troisième expectoration pour la sensibilité de la microscopie Nelson, JCM 1998 Majorité de culture+ à 2 prélèvements Mathew, JCM 2002 Pas de modification de la VPN avec une 3 ème expectoration Multiplication des prélèvements améliore la sensibilité Pour la microscopie, 2 prélèvements suffisent Pour «éliminer» le diagnostic, 1 à 2 prélèvements suffisent

30 Examens à pratiquer chez les patients n expectorant pas : expectoration induite Expectoration induite > Tubages Zar HJ, Hanslo D, Apolles P, Swingler G, Hussey G. Lancet Jan 8-14;365(9454): Brown M, Varia H, Bassett P, Davidson RN, Wall R, Pasvol G. Clin Infect Dis Jun 1;44(11): Expectoration induite = LBA Brown M, Varia H, Bassett P, Davidson RN, Wall R, Pasvol G. Clin Infect Dis Jun 1;44(11): Conde MB, Soares SL, Mello FC, Rezende VM, Almeida LL, Reingold AL, Daley CL, Kritski AL. Am J Respir Crit Care Med Dec;162(6): Anderson C, Inhaber N, Menzies D. Am J Respir Crit Care Med Nov;152(5 Pt 1): Intérêt de multiplier les expectorations induites (jusqu à 4) Al Zahrani K, Al Jahdali H, Poirier L, René P, Menzies D. Int J Tuberc Lung Dis Sep;5(9):855-60

31 Examens à pratiquer chez les patients n expectorant pas : tubage gastrique Expectoration induite > Tubage Zar HJ, Hanslo D, Apolles P, Swingler G, Hussey G. Lancet Jan 8-14;365(9454): Brown M, Varia H, Bassett P, Davidson RN, Wall R, Pasvol G. Clin Infect Dis Jun 1;44(11): LBA > tubage Rizvi N, Rao NA, Hussain M. Int J Tuberc Lung Dis Feb;4(2):

32 Examens à pratiquer chez les patients n expectorant pas : une étude contradictoire Expectoration induite = Tubages = LBA Bell DJ, Dacombe R, Graham SM, Hicks A, Cohen D, Chikaonda T, French N, Molyneux ME, Zijlstra EE, Squire SB, Gordon SB. Int J Tuberc Lung Dis Jan;13(1):

33 Expectoration post-fibroscopie Une étude retrouve 7% de diagnostic par cette méthode George PM, Mehta M, Dhariwal J, Singanayagam A, Raphael CE, Salmasi M, Connell DW, Molyneaux P, Wickremasinghe M, Jepson A, Kon OM. Respir Med Nov;105(11):

34 Récapitulatif prélèvements Expectorations = 2 Si pas d expectoration ou BAAR- Expectoration induite = LBA > Tubages (niveau 3) Probable intérêt des expectorations post-fibroscopie Probable intérêt des expectorations post-fibroscopie (niveau 2)

35 Laboratoire L3 Pression négative Accès sécurisé via un sas Masque FFP2 en permanence Manipulation sous Poste de Sécurité Microbiologique

36 Recherche de BK dans les crachats par examen microscopique Etape clé +++ Permet de dépister les formes les plus contagieuses (1/2 cas!) Objectif de l OMS = diagnostiquer 70% des tuberculoses M+ Mycobacterium tuberculosis (BK): 1. n est pas présent dans la flore rhinopharyngée 2. peut être coloré spécifiquement (structure originale de sa paroi) : coloration de Ziehl-Neelsen avec la fuchsine phéniquée (colorant fort rose) qui n est pas éliminée par la double action de l acide et de l alcool (comme c est le cas avec toutes les autres bactéries) BK = bacilles colorés en rose autres bactéries = colorées en bleu

37 Mycobacterium tuberculosis (bacille de Koch)

38 Contagiosité selon richesse bactériologique Cas de tuberculose Index de Rôle estimé dans Type proportion contagion la transmission M+ C+ 33 % % Mo C+ 33 % 2 9 % Mo Co 33 % 1 4 % Patients BAAR+ = 80-90% transmission dans la communauté

39 Nécessité de la culture Examen microscopique = étape clé car elle permet de dépister les formes les plus contagieuses (OMS) Ziehl Neelsen (15 min) Auramine (3 min) Seuil = 5x bacilles/ml Mise en culture : INDISPENSABLE car plus sensible (10 à 100 BAAR/ml), permet seule l'identification, la mesure de la sensibilité et le typage tubes fermés (pour éviter la dessiccation, contamination) exigences nutritionnelles +++ (milieux à l œuf : Löwenstein-Jensen) à 37 C plusieurs semaines

40 Culture Identification "classique" : LONG (au moins 3 semaines) FASTIDIEUX A FAIRE dans un L3 Diagnostic en 3 à 4 semaines si M- et 2 à 3 semaines si M+

41 Culture : milieux liquides Gain de temps avec milieux liquides = 1 semaine Malgré gain de temps les délais restent long, intérêt des tests moléculaires

42 Rapidité de la primo-culture Milieux Microscope + Microscope - Solides jours jours Liquides* 5-10 jours jours * : détection précoce de la positivité plutôt que culture rapide * : il faut souvent 1-2 jours de plus pour pouvoir faire les tests

43 Identification des cultures Antigéniques : MPT64 Identification moléculaire SANS amplification (sondes) AVEC amplification Cibles : ARN16S (sondes, nombre de copies ARN 1000X> nombre de copies ADN) ADN (16S, région intergénique 16S-23S, 23S, reca, gyrb, hsp65, rpoβ ) Etapes communes aux deux approches : Inactivation de la souche Extraction des acides nucléiques Autres méthodes diagnostiques Biochimiques

44 La PCR Réaction de polymérisation en chaine PCR mise au point en 1983 par Mullis Nobel en 1993 L amplification génique a pour but d augmenter le nombre de copies d un segment cible d acide nucléique de manière à permettre sa détection Permet en théorie de détecter une molécule d ADN. Grand espoir pour le diagnostic de la tuberculose à partir des expectorations

45

46 Performances de l amplification génique dans le diagnostic bactériologique de la tuberculose à examen microscopique positif Tuberculose Sensibilité Spécificité Prévalence VPP VPN M+ 98% 98% 85% 98% 90% Bonnes performances en cas d examen microscopique des expectorations positif Qu en est-il si l examen microscopique est négatif?

47 Performances de l amplification génique dans le diagnostic bactériologique de la tuberculose Tuberculose Sensibilité Spécificité Prévalence VPP VPN M+ 98% 98% 85% 98% 90% M- 72% 96% 5% a?? 2% b?? Extrarespiratoire (M-) 30% 98% 0,5%?? a : pneumologie, b : autres services

48 Des performances intrinsèques d un test à la réalité : prélèvement respiratoire à examen microscopique négatif Se = 72% Sp = 96% Malade Pas malade Prévalence = 5% 5 95 PCR + 3,6 (5x0.72) PCR - 1,4 (5x0.28) 3,8 (95x0.04) 91,2 (95x0.96) VPP = 3,6/(3,6+3,8) = 49% VPN = 91,2/(91,2+1,4) = 98%

49 Conclusion Amplification génique Pour faire un bon diagnostic il faut faire de bons prélèvements Diagnostic moléculaire à intégrer dans une stratégie diagnostique globale (pas de PCR «pêche à la ligne»)

50 ANTIBIOGRAMME

51 Diagnostic phénotypique des résistances Délai de rendu de Milieux Culture Antibiogramme Solides jours jours Liquides 5-28 jours jours Lenteur des tests phénotypiques Intérêt des tests génotypiques

52 Diagnostic génotypique Mise en évidence de mutations sur les gènes qui confèrent la résistance à l antibiotique Amplification du gène et étude des mutations sur les amplifiats Permettent d accélérer le diagnostic des résistances mais Dépendent de la connaissance des mécanismes de résistance et de l impact des mutations sur le phénotype de résistance Plusieurs tests : INNOLIPA RifTB MTBDRplus Xpert MTB/RIF MTBDRsl

53 Technologies MTBDR, Xpert MTB/RIF

54 Gènes étudiés Rifampicine MTBDRplus Xpert MTB/RIF Gène étudié rpob Isoniazide MTBDRplus katg 315, région régulatrice inha Fluoroquinolones Amikacine Kanamycine Capréomycine MTBDRsl gyra Ethambutol embb 306 rrs

55 Sensibilité et spécificité des tests commerciaux sensibilité spécificité Performances Rifampicine MTBDRplus 98% 99% Xpert MTB/RIF 94% 98% Excellente Isoniazide MTBDRplus 84% 99% Bonne Fluoroquinolones 83% 97% Bonne Amikacine 87% 99% Bonne Kanamycine MTBDRsl 67% 98% Médiocre Capréomycine 79% 95% Bonne Ethambutol 68% 80% Médiocre Theron, 2014; Steingart 2013 ; Feng 2013 ; Ling 2008 Performances - Excellentes pour rifampicine - Bonnes pour isoniazide, fluoroquinolones, amikacine, capréomycine - Médiocres pour kanamycine et éthambutol (amélioré dans MTBDRsl V2)

56 Un test avec mutation rpob est-il toujours prédictif de résistance à la rifampicine? Si sensibilité = 100% pour détection de résistance à la rifampicine et specificité de 98%, alors quelle est la VPP d un test détectant une mutation? France Avec Sans ATCD ATCD Prévalence de la résistance 30% 9% 2% N souches R pour 1000 patients N faux positifs pour 1000 tests (Sp=98%) VPP 94% 82% 50% Bon test de dépistage de la multirésistance (90% des RIF-R sont MDR) VPP dépend de prévalence résistance En cas de faible probabilité, contrôler le test

57 Diagnostic génotypique et niveaux de résistance Différents niveaux de résistance Certaines mutations ne confèrent pas la résistance Aubry AAC 2006 mutation résistance niveaux de résistance diffèrent selon les mutations

58 Conclusion Les performances des tests génotypiques dépendent de la prévalence de la résistance Ils permettent d accélérer le diagnostic des résistance et Nous éclairent sur la complexité de la résistance : Nouveaux mécanismes de résistance Mutations ne conférant pas la résistance Différents niveaux de résistance Il reste à faire un gros travail : cartographie des mutations et de leur impact sur le traitement Tests «rpob» recommandé par le HCSP pour tout nouveau cas de tuberculose si mutation détectée, la confirmer par une autre technique, de préférence sur un autre prélèvement

59 Marqueurs moléculaires

60 Marqueurs moléculaires (empreintes digitales génomiques) = Génotypage : bases de l interprétation des résultats Empreintes différentes = «souches différentes» : exclut un lien épidémiologique entre les cas. Empreintes identiques = «souches non différentes» (et non pas souches identiques) : n exclut pas, mais ne prouve pas, un lien épidémiologique entre les cas.

61 Marqueurs moléculaires : techniques pouvoir discriminant = aptitude à obtenir des empreintes digitales génomiques différentes pour des souches bactériennes de cas manifestement indépendants RFLP : référence à ce jour Spoligotyping : bcp + commode, bcp - discriminant MIRU-VNRT : un peu moins discriminant que RFLP

62 Empreinte digitale génomique (génotypage) Méthode R F L P (Restriction Fragment Length Polymophism) Chromosome Fragments d ADN Coupure par enzyme de restriction à des sites spécifiques Electrophorèse Séparation des fragments selon leur taille Hybridation avec sonde marquée* IS 6110 «Profil RFLP» = nombre (1 à 20) et taille des fragments portant une copie de la séquence IS6110

63 Exemple de profils RFLP de souches de M. tuberculosis Souche de référence Sonde

64 Méthode MIRU-VNTR Minisatellites : régions (loci) contenant un nombre variable de séquences bp répétées en tandem (VNTRs) Supply et al. (2000) ont identifié 41 loci-vntr dans le génome de M. tuberculosis Ces loci ont été appelés Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRUs) 12 MIRUs présentent des variations dans le nombre de VNTR qu ils contiennent Le nombre de VNTRs de chaque locus MIRU peut être déterminé en mesurant la taille du fragment amplifié par PCR

65 Marqueurs moléculaires «empreinte digitale génomique» Utilisations Au laboratoire Le malade Malades «proches» Malades «non proches» mais avec des caractéristiques communes faisant suspecter des liens Population entiére

66 Juste prescription biologique pour le diagnostic bactériologique de la tuberculose: Analyses pertinentes et étapes techniques J0-J1 Microscopie : M+,M0 en cas de prélèvement M+ Amplification génique (PCR) + Détection de la résistance à la rifampicine si facteurs de risque Mise en culture J10-J30 Lecture des cultures identification rapide des cultures positives (mycobactéries du complexe tuberculosis) tests de sensibilité ATB 1ere ligne (au minimum isoniazide et rifampicine) > J30 tests de sensibilité ATB 2eme ligne Génotypage Diagnostic de l infection tuberculeuse / entourage-contacts

67 Conclusion Le diagnostic bactériologique traditionnel (microscopie/culture) reste la référence La positivité de l examen microscopique permet d accélérer le diagnostic Il faut réunir les conditions pour qu il soit positif Des méthodes indirectes permettent d accélerer les diagnostics mais doivent être intégrées dans une démarche diagnostique Intérêt très dépendant de la probabilité de tuberculose à priori