NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE

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1 NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE Dr Frédérique GOURIET Fédération de Bactériologie Virologie et Hygiène hospitalière URMITE CNRS-IRD UMR

2 Immunochromatographic or agglutination assay Direct examination and culture Real-time PCR Syndrome and disease- -based sampling kits Point of care (POC) laboratory assays < 2 hours Automated blood culture monitoring Diversified culture conditions Transport Local, national and /or international alert Phenotypic identification and antibiotic susceptibility testing Core laboratory Molecular detection and identification Real-time genome sequencing Manual biochemotype and antibiogram PCR Automated biochemical phenotype and antibiogram MALDI-TOF MS Unidentified or unusual bacterium New or atypical bacterium SMS message, Laboratory website Phenotypic microarray Sequencing Metagenomics Strain 2 collection

3 Nouvelles applications de la spectrométrie de masse au laboratoire de Microbiologie 3

4 Nouvelles applications de la spectrométrie de masse au laboratoire de Microbiologie Identification de souche bactérienne identification directe sur flacon d hémocultures Identification directe sur les urines Biotypage des bactéries detection d une épidémie Surveillance d une épidémie Identification de clones Détection rapide de la résistance aux antibiotiques par MALDI-TOF Carbapénémases chez les bactéries à gram négatif

5 Apport de la Spectrométrie de masse pour le diagnostic microbiologique Analyse MALDI-TOF Micro-organisme inconnu Dépôt sur une cible Interprétation des données Banque de données 5

6 Interprétation des résultats Comparaison par souches 3 niveaux d identification Log supérieur ou égal à 2: identification d espèce Log entre 1,7 et 2,0: identification de genre Log < à 1,7: absence d identification Biologie moléculaire Incrémentation de la Base de données Bruker Biotyper 6

7 Performances des différents Spectromètre disponible pour la microbiologie

8 Problèmes d identification :Discordance MALDI_Tof et identification classique Phénotypique en spectrométrie de masse

9

10 Identification phénotypique classique / spectrométrie de masse Problèmes du choix du système d identification: Gram Tests d orientation (catalase, oxydase ) Diversité phénotypique: Base de données: nombre importants de souches par espèce Chevauchement des phénotypes Choix multiples Souches déficientes Variant Inoculum insuffisant Choix préalable inutile Colonie ou échantillon hémoculture/urines Une seule base de donnée pouvant être constituée par une seule souche par espècemodulable Profils protéiques provenant en grande partie par des protéines ribosomales Résultat rapide Coût concurrentiel

11 Détection d une épidémie N of patient year 18 souches Issues de13 patients Arbre phylogénétique position des Corynebacterium spp. comparaisons MALDI-TOF (A) et sequences partielle ARN sous unité beta de polymerase gene rpob (B). Emerging Infectious Diseases Vol. 16, No. 8, August 2010

12 Surveillance d une épidémie 622 isolats 5 clusters Cluster associations Origine Geographical Algérie, ST80 (C1) Marseille (C2-C5) Origine Clinique Patients non-mucovicidosique (C5) Patients mucovicidosique C1 and C2 : children C3 and C4 : adults Staphylococcus aureus et mucovicidose MSP Dendrogram C1 C2 C3 C4 C Distance Level Clusters identification de phénotypes

13 Epidémie et origine géographique Klebsiella pneumoniae MSP Dendrogram Marseille - France Algeria Distance Level K. pneumoniae SKP3 SKP4 SKP2 SKP8 OKP5 OKP9 SKP14 SKP7 SKP9 SKP15 SKP29 OKP15 KP61 KP74 SKP28 SKP27 KP63 OKP8 KP73 KP78 OKP10 KP62 SKP22 OKP13 SKP23 SKP26 KP80 KP70 KP76 KP77 SKP30 OKP7 OKP3 OKP6 SKP1 KP64 KP98 SKP25 KP79 SKP6 KP101 KP83 SKP17 SKP21 KP95 KP69 KP81 OKP11 KP96 KP82 SKP16 KP102 KP65 KP85 KP86 KP90 OKP4 KP67 KP87 KP88 OKP14 KP68 KP92 OKP12 KP OKP2 131 CSUR KP89 SKP NCTC P130 0

14 Détection des carbapénémases par MALDI-TOF Klebsiella pneumoniae Sensible Imipénème Test Imipénème IMP : pic spécifique à 300 m/z Intens. [a.u.] x Matrice +Nacl essai-atb-bact ultraflex 0:F8 MS Raw 0.5 Intens. [a.u.] 0.0 x IMP 1 B T0 essai-atb-bact ultraflex 0:G7 MS Raw Intens. [a.u.] 0.0 x IMP 1 B T1 essai-atb-bact ultraflex 0:M10 MS Raw 2 Intens. [a.u.] 0 x IMP 1 B T2 essai-atb-bact ultraflex 0:M20 MS Raw m/z

15 Détection des carbapénémases par MALDI-TOF Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive Test Imipénème IMP : pic spécifique à 300 m/z Intens. [a.u.] x essai-atb-bact ultraflex 0:F7 MS Raw Matrice +Nacl 0.5 Intens. [a.u.] 0.0 x essai-atb-bact ultraflex 0:J15 MS Raw IMP 1 B T0 Intens. [a.u.] x Disparition de l IMP à T1 essai-atb-bact ultraflex 0:A11 MS Raw IMP 1 B T1 2 Intens. [a.u.] 0 x O metabolite IMP 1 B T2 essai-atb-bact ultraflex 0:N19 MS Raw imipenem H HN S OH H N NH C 11 H 17 N 3 O 2 S carbapenemase OH H O H N O S OH H N NH C 12 H 17 N 3 O 4 S m/z

16 Détection des carbapénémases par MALDI-TOF Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive Test Méropénème MER: pic spécifique à 384 m/z Intens. [a.u.] x Matrice+NACL essai-atb-bact ultraflex 0:F7 MS Raw 0.5 Intens. [a.u.] 0.0 x MER 1 B to essai-atb-bact ultraflex 0:M15 MS Raw Intens. [a.u.] 0.0 x Disparition de MER à T1 MER 1 B t1 essai-atb-bact ultraflex 0:J11 MS Raw 0.5 Intens. [a.u.] 0.0 x MER 1 B t2 essai-atb-bact ultraflex 0:J21 MS Raw m/z

17 Détection des carbapénémases par MALDI-TOF Table 1. Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS MALDI-TOF analysis Strain type :No. of isolates (Location of isolates [ No.of isolates]) Range of the ratio of the area of imipenem/metabolite based on the time of incubation No. of isolates detected as carbapenemase producers based on the time of incubation 2h 4h 2h 4h Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC >8 mg/l) < < K. pneumoniae KPC :1 <0.01 < K. pneumoniae NDM-1: 2 <0.01 < P. aeruginosa VIM : 2 <0.01 ND 2 2 P. aeruginosa IMP : 2 <0.01 ND 2 2 A.baumannii bla OXA23-like : 57 (Marseille [17], Algeria [40]) < < A.baumannii bla OXA24-like : 3 (Algeria) < A.baumannii bla OXA23-like + bla OXA24-like : 3 (Algeria) < < Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC 2 mg/l) < < K. pneumoniae ESBL : 31 (Algeria) ND K. pneumoniae non ESBL : 4 (Algeria) ND Escherichia coli ATCC (1) A. baumannii : 43 (Marseille [1], Algeria [42]) Sensitivity = 100% ; Specificity = 100% (t=4h)

18 Diagnostic rapide en microbiologie médicale un véritable challenge Les tests microbiologiques améliorent la prise en charge des malades si les résultats sont disponibles dans le temps du soin. 18

19 Organisation du laboratoire central en microbiologie Regroupement géographique des laboratoires sur un seul site PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE échantillons Prélèvements d environnement - réservoirs - vecteurs > Réception 24/24, 365 jours/an > Enregistrement > Dispatching inoculation automatique Inoculation Manuelle cellules animaux Identification MALDI-TOF Sérologies Automates Identification par séquençage Antibiogramme Génomique au débit automatisé Validation Expertise et conseil thérapeutique Contact avec cliniciens Limites des laboratoires cœur: résultats retardés dans les tests de routine Création de laboratoires secondaire d urgence 19

20 Objectif: laboratoire d urgence Prise en charge médicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les résultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service d urgence => Résultats < 4 heures Afin de répondre à 4 questions cruciales 1 Hospitalisation nécessaire? 2 isolement requis? 3 traitement anti-infectieux nécessaire? 4 analyses complémentaires nécessaires? 20

21 Point of care à l hôpital de la Timone/ et hôpital Nord 60 cm Ordi + imp. 257 cm Placard mural L120 x h70 x p30 60 cm Smart Cycler 113 cm 153 cm Smart Cycler Placard sous paillasse L113 x h85 x p50 50 cm PSM Holten LaminAir 101 cm 66 cm 65 cm Ordi POC Timone 17,2 m 2 92 cm 60 cm Monarch Ordi Ordi 60 cm 2 étagères murales L270 x p36 Frigo bas +4 C GenXpert Micro Zeiss Axiolab Congélo bas -20 C 240 cm 210 cm Placard sous paillasse L113 x h85 x p50 2 étagères murales L160 x p36 Centri Jouan C3i Evier 20 cm 60 cm Vortex Bain Sec Bioblock Stuart 143 cm EZ1 Qiagen 21

22 Critères de sélection des analyses au POC Résultats en moins de 4 heures, transmission SMS bonne valeur prédictive dépistage par syndrome Résultats modifient la prise en charge Immunochromatographie PCR en temps réel 22

23 Exploration par syndrome Pneumonia Meningitis PNEU Flu ICT VRS ICT Mycoplasma pneumoniae PCR Whooping-cough (B. pertussis) PCR Coxiella burnetii PCR Staphylococcus aureus (ICU only) PCR Pneumocystis jiroveci PCR Legionella urinary antigen Pneumococcal urinary antigen MENIN Cytology Enterovirus PCR Herpes virus PCR Varicella zoster virus PCR Meningococcus PCR Pneumococcus PCR Cryptococcus Gynecology GYNECO HIV ICT Group B streptococcus PCR Atopobium vaginae PCR GASTRO Gastro-enteritis, diarrhoea Rotavirus adenovirus ICT Norovirus ICT Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT ANG Pharyngitis Group A streptococcus ICT Infectious mononucleosis MNI test Tropical fever Tropical fever Malaria PCR Malaria ICT Dengue ICT Other Others Blood exposure accident = HIV Tetanus toxin ICT Procalcitonin 23

24 Real-time PCR assays: syndrome-specific strips 190 µl sample + 10µL TISS Une barrette par patient ex: méningite Extraction EZ1 Virus card pure DNA 5 µl in all wells Strip 1 LCR code mix HSV VZV ctra crga PlyN LytA 7SL-RNA TISS Strip 2 CONTRÔLE NEGATIF - rien à rajouter prêt à l emploi Strip 3 CONTRÔLE POSITIF- Rien à rajouter prêt à l emploi 24

25 Real-time PCR assays: syndrome-specific multiplexed strips 1 patient par barrette ex: pneumonie 190 µl sample + 10µL TISS Extraction EZ1 Virus card pure DNA 5 µl cup1 cup2 cup3 Nothing to add Ready to use controls Code Coxiella burnetii M. pneumoniae Bordetella pertussis mix X 7SL-RNA TISS X 7SL-RNA X 7SL-RNA TISS patient Negative control Positive control 25

26 P.O.C: PCR en temps réel Xpert Flu Detection of Flu virus de type A and B, and H1N Preparation : 2 min Result : 77 min Xpert EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation : 5 min Result : 150 min Xpert C. difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation : 2 min Result : 47 min Xpert GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation : 1 min Result : 52 min 26

27 Activité exponentielle Test Diagnostics % Test Diagnostics % Test Diagnostics % influenza virus RSV S. pneumoniae L. pneumophila M. pneumoniae C. burnetii B. pertussis Procalcitonin S. pyogenes EBV EV HSV-1/ S. pneumoniae N. meningitidis M. pneumoniae Rotavirus/adeno C. difficile H. pylori S. agalactiae HIV Plasmodium spp Dengue virus C. tetani Total Cohen-Bacrie S et al., PloS One 2011

28 Activité exponentielle Cohen-Bacrie S et al., PloS One 2011

29 Perspectives: POC délocalisé, Afrique Diagnostic kits Diagnostic kits I.H.U Hospitalization Consultation Emergency room P.O.C. Diagnostic kits Assistance Publique des Hôpitaux de Marseille POC Core Laboratory Other Clinics, hospitals, laboratories In France and abroad Remote POC Remote, mobile POC Remote POC in patient s premices 29

30 Approche syndromique du diagnostic en microbiologie médicale Place des nouveaux outils moléculaires 30

31 Approche syndromique : kit péricardique

32 Application métagénomique Detection : Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide péricardique pour la 1ere fois chez l homme PLoS One Apr 1;9(4):e Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis. Fancello L, Monteil S, Popgeorgiev N, Rivet R, Gouriet F, Fournier PE, Raoult D, Desnues C. 32

33 Approche syndromique : ex Kit endocardite Génome en temps réel 33

34 Application : génome en temps réel Génome en temps réel de S.epidermidis Staphylococcus epidermidis souche isolée de 3 hémocultures sur 3 chez responsable d une endocardite aortique chez un homme de 26 ans génome de 2.5-Mb :sequence unique avec 32 genes de virulence. CSUR P278 J Clin Microbiol May;51(5): Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis. Fournier PE, Gouriet F, Gimenez G, Robert C, Raoult D.

35 remerciements Pr Michel Drancourt Dr jean-paul Casalta Dr Pierre Yves Levy Pr jean Marc Rolain Merci pour votre attention 35