Identification des mycobactéries par spectrométrie de masse Expérience du laboratoire du CHU de Limoges

Transcription

1 Identification des mycobactéries par spectrométrie de masse Expérience du laboratoire du CHU de Limoges Christian Martin

2 Introduction Mycobactéries : identification par des méthodes moléculaires : PCR + hybridation, séquençage SM : méthode rapide d'identification des bactéries Envisager la spectrométrie comme premier moyen d'identifier les mycobactéries atypiques les plus communes Nécessite une adaptation des protocoles pour les mycobactéries et les champignons

3 Principe Système d identification basé sur la méthodologie MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionisation (désorption-ionisation laser assistée par matrice) Time Of Flight (temps de vol) Identification par étude des protéines majoritaires Protéines ribosomales Dépôt d une colonie sur une cible Recouvrement par une matrice Séchage Analyse

4 Vitek MS Middleware Power Ionising Vacuum Negative Station d acquisition Vitek MS Station de préparation

5 Cible jetable 3 Groupes d acquisitions Spot de la souche contrôle - Etalonnage

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7 VITEK MS Bases de données : CE et Saramis actuellement Algorithme ASC (Advanced Spectra Classifer) présence et absence de pics spécifiques Interprétation des résultats : Niveau de confiance Choix Bon 1 Faible disrimination Absence d ID 2-3 NA

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9 Essais souches cliniques : M. avium et M. fortuitum Milieux solides milieux liquides Inactivation 20 min 95 C Sonication ou Fast Prep Incubation dans acide tri-fluoro-acétique RESULTATS : PAS DE SPECTRE Difficulté de calibrage (instable) Changement de la machine en 2013

10 Essais souches cliniques : M. kansasii (2), M. intracelllare (2), M. abscessus, M. lentiflavum et M. xenopi Milieu MGIT (1,5 ml) Culot repris dans 0,5 ml d'éthanol puis vortexer 15 min (billes de verre) Centrifugation du surnageant Inactivation 10 min 95 C Elimination de l'éthanol Ajout de 10 µl d'acide formique à 70% Ajout de 10 µl d'acétonitrile Dépôt de 1 µl + 1 µl de matrice (2 spots) MycoMed (SFM) 15 octobre 2015

11 Résultats essais 2014 Espèces Base CE Base Saramis M. abscessus 0/0 0/0 M. kansasii 0/M. intracellulare 0/0 M. kansasii 0/M. intracellulare 0/0 M. intracellulare 0/0 0/0 M. intracellulare M. intracellulare/m. intracellulare 0/0 M. lentiflavum Serratia/ Clostridium 0/0 M. xenopi 0/0 0/0

12 Essais espèces présentes dans la base - 49 souches

13 Résultats essais 2015 BM SARAMIS VITEK MS V3 M. intracellulare 2/4 3/4 M. avium 6/7 6/7 M. celatum 0/0 0/0 M. chelonae 3/7 3/7 M. chromogenicum 0/2 0/2 M. fortuitum 2/3 2/3 M. gastri* 0/1 0/1 M. gordonae 2/5 3/5 M. kansasii 4/4 3/4 M. lentiflavum 0/1 0/1 M. marinum* 0/2 0/2 M. nonchromogenicum 0/1 0/1 M. scrofulaceum 0/3 0/3 M. simaie 1/1 1/1 M. smegmatis 0/1 0/1 M. terrae 0/2 0/2 M xenopi 1/2 2/2 M. szulgai 1/1 1/1 M. lentiflavum 1/2 1/2

14 Discussion Etude rétrospective à partir d'un souchier Protocole milieux solides consolidés Protocole milieux liquides à venir : Difficultés à obtenir un inoculum suffisant Kit d'identification Absence d'identification (M. gordonae) Faible nombre de mauvaises identifications Switch entre les 2 bases de données Etude prospective reste à faire

15 Discussion Essai d'identification des mycobactéries depuis 2010 Plusieurs bases de données Appareil SM Brücker Etudes prospectives 16 mois Succession de 2 protocoles d'extraction en cours d'étude 243 cultures testées 60 à 73% corectement identifiées /BM Protocole v3 : meilleure identification en milieu liquide

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17 Paris - Lariboisière

18 Protocole plus complexe / autres bactéries Mycobactéries atypiques Conclusion Identification du complexe, de l'espèce Consolidation de l'identification des espèces fréquemment rencontrées (moindre recours à la BM) Place dans la routine reste à optimiser : milieu liquide problème d'inoculum pérodicité (activité, mission du laboratoire) Quid des autres expériences dans le MycoMed?