ETUDE DES MARQUES H3K27me3, H3K9me3 ET H4K8ac DANS DES CELLULES DE CANCER DU SEIN EN LIGNEE CONTINUE TRAITEES PAR LES PHYTO-ŒSTROGENES DU SOJA
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1 ETUDE DES MARQUES H3K27me3, H3K9me3 ET H4K8ac DANS DES CELLULES DE CANCER DU SEIN EN LIGNEE CONTINUE TRAITEES PAR LES PHYTO-ŒSTROGENES DU SOJA Julie DURIF Master 2 Nutrition Humaine et Santé ~ Année e CBRV ~ Département D d Oncogd Oncogénétique du Centre Jean Perrin
2 The soybean phytoestrogens are they involved on the posttranslational modifications of histones in the breast cancer cell line? ASLIHAN DAGDEMĐR
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4
5 Cancer du Sein / Tissu Normal IH
6 Cancer du Sein / Tissu Normal
7 Cancer du Sein / Tissu Normal
8 Cancer du Sein / Tissu Normal
9 ETUDE DES MARQUES ÉPIGÉNÉTIQUES MÉTHYLANTES ET ACÉTYLANTES DANS LES CANCERS SPORADIQUES DU SEIN ET LE TISSU SAIN CORRESPONDANT 9 Gaëlle Judes Master 2 Nutrition Humaine et Santé Département d Oncogénétique du Centre Jean Perrin
10 Introduction Epidémiologie: Cancer du sein cancer le plus fréquent chez la femme Atteint environ 1 femme sur 11 Responsable de 18% des décès par cancer chez la femme Rappels bibliographiques: 10 à 15% des cancers du sein sont héréditaires mutations génétiques certaines concernent les gènes BRCA1 et BRCA2. Production de deux protéines BRCA1 et BRCA2 réparation des dommages subis par l'adn. Cancer sporadique Représente 90-95% tous les cancers du sein Accumulation de mutations acquises non corrigées au niveau des gènes somatiques Mutations Activation d oncogènes Répression d oncosuppresseurs 10
11 Introduction Epigénétique: L étude de changements héréditaires de la fonction du génome sans entrainer une modification au niveau de la séquence d ADN. Méthylation de l ADN Modification des histones Méthylation des histones: augmentation de la basicité et hydrophobicité des histones Méthylation 11
12 Introduction Acétylation des histones: réduction de l interaction entre l ADN et les nucléosomes ADN accessible pour les facteurs de transcription 12
13 Objectif Déterminer si les gènes étudiés tendent vers un profil d activation ou de répression dans les tumeurs du sein en comparant au tissu normal associé 13
14 Marques d histone H3 3 marques d histone: H3K27 me3 (EZH2) : marque de répression de la transcription H3K9 acétylé H3K4 acétylé Marques d activation de la transcription
15 Gènes 6 gènes BRCA1 Méthylation du promoteur Absence ou diminution de son expression EZH2 Méthyltransférase et composant du complexe polycomb 2 répressif Maintient de la marque répressive H3K27 me3 Expression anormale cancer du sein Concentration excessive marqueur de l agressivité du cancer de l invasion et de la progression 15
16 Gènes Lien entre BRCA1 et EZH2 Augmentation de EZH2 Surexpression de EZH2 inhibe phosphorylation de BRCA1 Augmentation de CDc25C rôle essentiel au niveau du point de contrôle G2/cycline B1 dans le cycle cellulaire 16
17 Gènes 17
18 Gènes ER-β Code pour récepteurs aux œstrogènes, inhibe prolifération ER-α Code pour récepteurs aux œstrogènes, stimule la prolifération Lien entre BRCA1 et ER-α BRCA1 inhibition de la transcription de ER-α, diminution de la prolifération Mutation de BRCA1 ou inactivation par d autres mécanismes 18
19 Gènes P300 Code pour une histone acétyle transférase Lien entre P300/BRCA1/ER-α BRCA1 diminue de l expression de P300 (coactivateur transcriptionnel de Er-α) Deux mécanismes d action de BRCA1: Direct Indirect via P300 Rôle du gène BRCA1 dans le cancer du sein: Maintenir l intégrité génomique Limiter l étendue de la stimulation oestrogénique 19
20 Gènes SRC3 Famille p160, oncogène et coactivateur du récepteur aux stéroïdes Gène qui a un domaine (AD1) liant l histone acétyle transférase P300 Rôle important dans la prolifération cellulaire dans le cancer du sein Augmente la fonction des récepteurs ER-α 20
21 Patients Tissus sains pour chaque patient donc pas de biais entre les individus Tumeurs : critères clinico-pathologiques Type de cancer Grade SBR Infiltration ganglionnaire Récepteurs aux œstrogènes Récepteur aux progestérones Ki67 Surexpression HER2 Taille tumeur
22 Tissus 4 patients P P 1 Type de cancer Adénocarcinome canalaire invasif bifocal Grade SBR Infiltration ganglionnaire RE RP KI67 Surexpression HER2 Taille tumeur (cm) 2 aucune / / / / 1,7 droit / sein Autres cancers P 2 Adénocarcinome canalaire infiltrant 2 un ganglion métastasé positif 100% +++ positif 70% de + à +++ < 10% négative 3 gauche / P 3 Carcinome canalaire infiltrant 3 Emboles lymphatiques tumoraux 30% + négatif 60% négative 1,8 gauche Carcinome canalaire infiltrant grade 1 en 1998 P 4 Adénocarcinome lobulaire invasif 2 ganglions bénins positif 100% +++ positif 10% de + à % / 1,4 droit / Relation entre les marques d histones et les facteurs clinicopathologiques
23 Protocole Isolation de l ADN Cross-linking : lier les protéines (histones) à l ADN Lysat Chromatine Input Q-PCR Lyse Fragmentation Q-PCR Clearing : Clivage par sonication Anticorps dirigés contre la protéine d intérêt 23 Isolation de l ADN Elution de l ADN Capture magnétique
24 Résultats P2 Gènes contrôles TSH2B gène contrôle des marques répressives C-Fos gène contrôle des marques activatrices 24
25 Résultats P2 25
26 RÉSULTATS P4 H3K4 ac et H3K9 ac Fold enrichment over HEATHLY TISSUE 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 ChIP H3K4ac BRCA1 EZH2 P300 SRC3 ERA ERB TUMOR TISSUE SAIN 26
27 Résultats P4 H3K27 3me Fold enrichment over HEATHLY TISSUE 2,00 1,60 1,20 0,80 0,40 0,00 ChIP H3K27 me3 TUMOR TISSUE SAIN
28 HISTONE LYSINE TRIMETHYLATION AND ACETYLATION IN SPORADIC BREAST CANCER CELL LINES Aslihan Dagdemir 2nd year of doctorate
29 Objective Understanding the impacts of Histon Methylation Inhibitor and Anti-HDAC activity in breast cancer cell lines?
30 Material and Methods Treatment with cell lines Cross linked Chromatin Immuno- Precipitation Quantitative PCR
31 Breast CancerCell Line MCF 7 : Pleural effusion breast adenocarcinoma(era+/erb+). MDA-MB-231: Pleural effusion breast adenocarcinoma (Era-/ERb+). SUM1315: Cells from mammarian adenocarcinoma MCF-7 MDA-MB-231 SUM1315
32 CONTROL without treatments in medium Traitement 48h DZNep Histone Methyltransferase Inhibitor (5 µm) SAHA ANTI-HDAC (1µM) Nabu ANTI-HDAC (2mM)
33 Antibodies Anti-H3 K4 Ac Mark of activating transcription Anti-H3 K9 Ac Mark of activating transcription Anti-H3 K27 me3 Mark of repressing transcription Anti-IgG Mark of negative control
34 Results recovery % input = 2^[(Ct input-log input dilution) - Ct ChIP]*100 C-FOS TSH2B CONTROL IgG 0,01 0,01 DZNep IgG 0,00 0,00 NaBu IgG 0,01 0,01 SAHA IgG 0,01 0,03 ***Each experiment was performed triplicate
35 ***Each experiment was performed triplicate
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38 PERSPECTIVES Breast Cancer
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