FORMES MYÉLO-SANGUINES DU LYMPHOME DU MANTEAU : INTÉRÊT DE LA CYTOLOGIE ET L IMMUNOPHÉNOTYPAGE

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1 J sci pharm biol 2014;15, 1 : EDUCI ADJAMBRI AE 1,2 KASSI HY 1 KOUAMÉ DR 2 N GUESSAN-BLAO R 2 SAWADOGO D 1,2 MARFAING-KOKA A 3 FORMES MYÉLO-SANGUINES DU LYMPHOME DU MANTEAU : INTÉRÊT DE LA CYTOLOGIE ET L IMMUNOPHÉNOTYPAGE RESUME Le lymphome du manteau représente 3 à 10% des lymphomes non hodgkiniens. Dans les formes myélo-sanguines, la cytologie permet un diagnostic d orientation. Il est caractérisé par la translocation chromosomique t(11;14) (q13;32), qui est responsable d une surexpression de la cycline D1. Nous rapportons les observations de 5 patients âgés de 36 à 70 ans. L objectif était de decrire l intérêt de la cytologie et de l immunophénotypage en absence de syndrome tumoral. Un seul patient a présenté une adénopathie et une splénomégalie. Les frottis sanguin et médullaire ont mis en évidence des cellules de petite ou moyenne taille à chromatine mature avec un noyau irrégulier. Le phénotype est caractéristique de celui du lymphome du manteau dans trois cas avec le cluster de différenciation 5 positif, le CD23 négatif et le score de Matutes égal à 1. La population est monoclonale κ dans 4 cas, λ dans 1 cas. La présence de la translocation t(11,14) a été retrouvée chez tous les patients. Dans la majorité des cas, il n y avait pas d anomalies additionnelles à la translocation dans cette forme indolente du lymphome à cellules du manteau. La cytogénétique et la biologie moléculaire constituent les seuls arguments pour le diagnostic de certitude. Mots-clés : Cytologie, Immunophénotypage, Lymphome du manteau, Myélosanguine SUMMARY Mantle cell lymphoma represents 3 to 10% of non-hodgkin s lymphomas. In myelo-blood forms, cytology allows an orientation s diagnosis. It is characterized by the translocation chromosome t (11; 14) (q13; 32), which is responsible for overexpression of cyclin D1. We report the observations of 5 patients aged from 36 to 70 years. The aim was to describe the interest of cytology and immunophenotyping in the absence of tumor syndrome. One patient presented both Lymphadenopathy and splenomegaly. Blood and bone marrow smears have highlighted cells of small to 1- Laboratoire hématologie biologie CHU de Yopougon, Abidjan Côte d Ivoire 2- Département d Hématologie, Immunologie et Biologie Générale, Université Félix Houphouet Boigny, Abidjan Côte d Ivoire 3- Laboratoire hématologie biologie Hôpital Antoine Béclère, Clamart France. Correspondance : ADJAMBRI ADIA EUSÈBE - Adresse : 21 BP 632 Abidjan eusebeadjambri@yahoo.fr

2 43 medium size to mature chromatin with a core of irregular. The phenotype is characteristic of mantle cell lymphoma in three cases with the cluster of differenciation 5 positive, the negative CD23 and matutes score equal to 1. This score of Matutes is equal to 2 in both cases with a positive CD23 expression. The population is monoclonal κ in 4 cases, λ in 1 case. The presence of translocation t (11.14) was found in all patients. In the majority of cases, there were no additional abnormalities to the translocation in this indolent form of mantle cell lymphoma. Cytogenetics and molecular biology are the only arguments for the definitive diagnosis of mantle cell lymphoma. Keywords: Cytology, Immunophenotyping, Mantle cell lymphoma, Myelo-blood Le lymphome à cellules du manteau (LCM) est une prolifération lymphoïde B maligne très hétérogène qui ne représente que 3 à 10% des lymphomes non hodgkiniens (LNH) [Jaspers 2010]. La cellule tumorale dérive d une cellule B naïve qui n a en général pas subi de mutation somatique, située dans la zone du manteau entourant le centre germinatif [Jares 2007]. La dissémination sanguine du LCM permet un diagnostic cytologique d orientation de cinq variants morphologiques de lymphome du manteau [Jaspers 2010]: la forme classique constituée de cellules tumorales très hétérogènes, de taille petite à moyenne avec un noyau irrégulier, à chromatine lâche ; deux formes variantes à petites cellules (lymphocytoïde et monocytoïde) et deux formes variantes blastoïdes (lymphoblaste classique et blastoïde pléomorphe). Classiquement la cellule tumorale exprime le marqueur CD5, mais peu ou pas le CD23 [Swerdklow 2008]. Sur le plan cytogénétique, le LCM se caractérise par la présence de la translocation t(11 ;14)(q13 ;q32) qui n est pas restreinte à cette hémopathie. Cette translocation juxtapose le gène de la chaîne lourde des Ig (IgH) du locus 14q32 à une région en 11q13 désignée sous le nom de Bcl-1. Cette translocation entraine l augmentation de la transcription du gène de la cycline D1 (CCDN1) avec pour INTRODUCTION conséquence une surexpression de cette protéine [Rosenwald 2003]. L hémogramme au moment du diagnostic retrouve une hyperlymphocytose pour 20 à 50% des patients [Le Gouill 2011]. En l absence d hyperlymphocytose, la présence d une population de cellules lymphoïdes tumorales circulante est cependant détectable chez plus de 60 % des patients [Thieblemont 2010]. Face à toute suspicion de lymphome, la démarche diagnostique commence par rechercher au sein du prélèvement sanguin, une prolifération de cellules lymphoïdes dont la morphologie est atypique. Le biologiste est ensuite amené à orienter ses hypothèses diagnostiques soit vers une hémopathie lymphoïde chronique à type de leucémie lymphoïde chronique (LLC), leucémie à tricholeucocyte, facilement reconnaissable, soit vers d autres formes de lymphoprolifération dont la phase leucémique du lymphome du manteau. Dans les formes disséminées du LCM, la biologie moléculaire constitue le seul argument pour le diagnostic. Cependant une parfaite analyse cytologique par des biologistes expérimentés d une part et l acquisition de cytomètres dans le cadre de la prise en charge des personnes vivant avec le Virus de l Immunodéficience Humaine d autre part, nous permet d améliorer et affiner nos diagnostics en réalisant l immunophénotypage.

3 44 L objectif de ce travail était de décrire l intérêt de la cytologie et de l immunophénotypage dans le diagnostic du lymphome à cellules du manteau. PATIENTS Les 5 cas rapportés dans l étude sont des patients adressés en consultation d hématologie ou hospitalisés à l hôpital Antoine Béclère de Clamart (France), chez qui on a suspecté un syndrome lymphoprolifératif. MÉTHODES Le diagnostic a été porté sur des arguments morphologiques, immunologiques, cytogénétiques et moléculaires. Un examen anatomopathologique couplé à l immunohistochimie a été réalisé lorsqu il y avait une adénopathie. Analyse cytologique Elle a été réalisée au microscope optique sur frottis sanguin et médullaire après coloration au May-Grünwald-Giemsa (MGG). La reconnaissance des formes du LCM s est faite sur la base de la classification OMS. La reconnaissance des formes du LCM s est faite sur la base de la classification OMS. Au plan cytologique, il existe cinq variants morphologiques de lymphome du manteau dont la forme classique constituée de cellules tumorales très hétérogènes, de taille petite à moyenne avec un noyau irrégulier, à chromatine lâche. Plusieurs formes variantes sont individualisées. Il est reconnu deux formes variantes à petites cellules: une variante lymphocytoide, mimant une LLC et une variante monocytoide, ressemblant aux lymphomes de la zone marginale. Il est aussi reconnu deux variantes blastoides: une forme blastoide classique avec des cellules ressemblant aux lymphoblastes et une forme blastoide pléomorphe comportant des cellules de grande taille et pléomorphes. MATÉRIEL ET MÉTHODES Analyse immunophénotypique L analyse immunophénotypique a été réalisée par cytométrie en flux (appareil Navios 8 couleurs, Beckman Coulter). Elle permet la détermination de la nature B des cellules ainsi que leur caractère monotypique. Les anticorps monoclonaux couplés aux fluorochromes utilisés pour détecter les marqueurs de membrane sont : anti CD19-PE (phycoérythrine), CD20-PE-Cy5, CD5-FITC (isothiocyanate de fluoresceine), CD79b-FITC, FMC7- FITC, CD23-PE et la recherche d expression d isotype de chaîne légère d immunoglobuline de membrane (kappa/ lambda) k-fitc et λ-pe. Ces marqueurs ont servi au calcul du score de Matutes. Analyse cytogénétique conventionnelle et moléculaire La translocation réciproque entre les chromosomes 11 et 14 t(11;14)(q13;q32) est une caractéristique majeure de cette entité. Cette translocation est mise en évidence par la mise en culture des cellules du sang ou de la moelle et réalisation d un caryotype conventionnel. La méthode d hybridation moléculaire sur les chromosomes à l aide de sondes (FISH : Fluorescence In Situ Hybridization) reconnaissant les zones d intérêt Ig H et BCL1 est plus sensible. Elle a été utilisée sur lames de coupes ganglionnaires ou lorsque le caryotype conventionnel sur le sang ou la moelle n était pas contributif. La recherche de l hyperexpression de la cycline D1 a été réalisée par RT-PCR ou reverse transcription polymerase chain reaction.

4 45 CARACTÉRISTIQUES ÉPIDÉMIOLO- GIQUES ET CLINIQUES Les patients avaient un âge compris entre 36 et 70 ans. A l examen clinique trois patients n ont pas présenté de syndrome tumoral. (Tableau I) CYTOLOGIE Tous les patients ont bénéficié d un prélèvement sanguin et médullaire dont l examen des frottis (sang et moelle) a montré la présence de cellules de petite ou moyenne taille à chromatine mature avec un noyau irrégulier et encoché. La morphologie de ces cellules lymphoïdes correspond à la forme classique du lymphome à cellules du manteau. Chez un patient, on a observé des prolymphocytes comme ceux retrouvés dans la leucémie prolymphocytaire. L hémogramme n a pas RÉSULTATS mis en évidence d hyperlymphocytose chez deux patients (Tableau II). IMMUNOPHÉNOTYPAGE Le phénotype était caractéristique de celui du lymphome à cellule du manteau dans trois cas avec le CD5 positif, le CD23 négatif et le score de matutes égal à 1. Ce score de Matutes était égal à 2 dans deux cas avec une expression du CD23 positive. L immunoglobuline de surface fréquemment exprimé était de type Kappa (Tableau III). CYTOGÉNÉTIQUE La présence de la translocation t(11,14) a été retrouvée chez tous les patients (Tableau IV). Dans la majorité des cas, il n y avait pas d anomalies additionnelles à cette translocation. Tableau I : Données épidémiologiques et cliniques Cas 1 Cas 2 Cas 3 Cas 4 Cas 5 Sexe F M M F M Age (ans) Sueurs nocturnes Asthénie ± perte de poids Adénopathies Splénomégalie Tableau II : Données cytologiques Cas 1 Cas 2 Cas 3 Cas 4 Cas 5 Leucocytes (/mm 3 ) Lymphocytes (/mm 3 ) Hémoglobine (g/dl) 10,1 13,8 14,1 14,1 15,6 Plaquettes (G/l)

5 46 Tableau III: Immunophénotypage lymphocytaire Marqueurs Cas 1 Cas 2 Cas 3 Cas 4 Cas 5 CD19 Pourcentage (%) CD Ig S expression Types Forte Kappa Forte Kappa Forte Kappa Forte Lambda Forte Kappa CD CD CD79b FMC Score de Matutes Tableau IV : Etude cytogénétique et biologie moléculaire Cytogénétique conventionnelle FISH / RT-PCR compétitive Cas 1 46, XX, der(1) t(1 ;?)(q34 ;?), t(11 ;14)(q13 ;q32) Présence de réarrangement IgH/CCND1 Cas 2 46, XY, t(11 ;14)(q13 ;q32) Présence de réarrangement IgH/CCND1 Cas 3 46, XY, t(11 ;14)(q13 ;q32) Hyper-expression de la Cycline D1 Cas 4 46, XY, t(11 ;14)(q13 ;q32) Présence de réarrangement IgH/CCND1 hyper-expression de la Cycline D1 Cas 5 46, XY, t(11 ;14)(q13 ;q32) Hyper-expression de la Cycline D1 Le lymphome du manteau est considéré comme un lymphome agressif nécessitant une polychimiothérapie intensive. Toutefois il a été rapporté dans la littérature un certain nombre de cas d évolution indolente avec une dissémination sanguine et médullaire [Ondrejka 2011]. Ces formes en général n évoluent que tardivement. En cas de dissémination sanguine, il est donc plus facile de réaliser des analyses cytologique et immunophénotypique sur les cellules lymphoïdes sanguines pour affiner le diagnostic avec les équipements actuellement disponibles dans nos structures. Tous les patients avaient un bon état général au moment du diagnostic du lymphome. Une splénomégalie a été a été observée chez deux patients (cas 1 et 3), associée à une adénopathie profonde chez le cas 3. Une anomalie DISCUSSION additionnelle à la translocation t(11 ;14) a été mise en évidence dans le cas 1. Ces variantes cliniques se caractérisant sans syndrome tumoral au diagnostic ou simplement associées à une splénomégalie et une atteinte myélosanguine, ont été décrites dans la littérature; et ces présentations auraient une évolution indolente [Thieblemont 2010]. L examen morphologique des frottis sanguins de ces patients montrait des cellules lymphoïdes circulantes de petite taille prédominante avec parfois des irrégularités nucléaires. Chez trois patients l hyperlymphocytose mimait un syndrome lymphoprolifératif chronique, mais l analyse du frottis n a pas mis en évidence d ombres de Gumprecht qui un critère fondamental du diagnostic cytologique de la LLC [Guillaume 2002]. L hémogramme des deux autres patients montrait un taux normal de lymphocytes.

6 47 Mais les anomalies cytologiques des frottis sanguin et médullaire suspectant un clone de cellules malignes ont conduit à l immunophénotypage lymphocytaire. Dans le diagnostic différentiel des lymphomes du manteau avec les autres lymphomes malins non hodgkinien, la positivité du CD5 a été déterminante. En effet, Le CD5 était positif chez tous nos patients, c est un marqueur qui, en situation non pathologique, est exprimé sur le lymphocyte T et une sous population minoritaire de lymphocytes B [Benattar 2003, Guillaume 2002]. Nos résultats sont en accord avec les données de la littérature affirmant que le CD5 est positif dans le cas du lymphome du manteau et de la leucémie lymphoïde chronique (LLC), et négatif dans les autres lymphomes non hodgkinien B (LNH B) [Bonnet 2011]. Le score de Matutes était inférieur à 3 chez tous les patients, excluant la LLC. En ce qui concerne l expression des chaînes légères, ces cellules tumorales exprimaient fortement une immunoglobuline de surface de type kappa. Ce qui n est pas le cas dans la littérature où l immunoglobuline de surface de type lambda est le plus rencontré [Le Gouill 2010, Weisenburger 1996]. Cette différence peut s expliquer par le faible échantillonnage de notre population. Le FMC7 et CD79b étaient positifs chez tous les patients, et chez deux patients, les cellules lymphomateuses exprimaient le CD23, marqueur habituellement négatif dans le lymphome du manteau. Dans les lymphomes à cellule B de bas grade ayant un CD5 positif, la recherche du CD23 et le FMC7 est utile pour distinguer le LCM et de la LLC. Typiquement le LCM est CD23-/FMC7+. L expression du CD23 est variable dans la littérature allant de 0 à 45% [Ahmad 2002, Gao 2009, Kelemen 2008]. La cytométrie apporte des informations complémentaires permettant de mieux définir les lymphomes et en particulier en précisant la monoclonalité. L avantage de disposer des cytomètres dans nos pays à ressources limitées grâce au programme de lutte contre le VIH-SIDA, permet la réalisation de l immunophénotypage et ainsi affiner nos diagnostics. L immunophénotypage a permis d avoir des arguments plus précis en faveur de la LCM en précisant le caractère monoclonal de la population cellulaire typée. Cependant cette technique n a pas permis de typer 2 cas. Ce qui rend indispensable, la cytogénétique et la biologie moléculaire pour un diagnostic de certitude. La présence d une translocation t(11 ;14) (q13 ;q32) a été retrouvée chez tous les patients. Cette translocation t(11 ;14) est considérée comme l anomalie cytogénétique caractéristique du LCM, mais elle peut être observée plus rarement dans d autres pathologies malignes lymphoïdes B (myélome, leucémie à prolymphocyte ou lymphome splénique à lymphocytes villeux). Les anomalies cytologiques et la caractérisation phénotypique des cellules lymphoïdes permettent d éliminer ces diagnostics [Troussard, 1997]. Cette translocation est responsable de la surexpression du gène CCND-1 qui favorise la progression dans le cycle cellulaire des cellules tumorales. L expression de cette cycline D1 est caractéristique du LCM. Mais une étude a permis de mettre évidence le gène CCND-2 dans le lymphome du manteau lorsque la recherche de la cycline D1 était négative [Seto 2013]. Le LCM est une maladie hétérogène dans sa présentation clinique, et biologique. Il existe donc un challenge pour le cytologiste à identifier cette lymphopathie parfois débutante. L étude cytologique couplée CONCLUSION à l immunophénotypage oriente vers le diagnostic des cellules du manteau. L étude histologique reste l examen clé du diagnostic de certitude du lymphome du

7 48 manteau et l anatomopathologiste se réfère aux éléments d orientation obtenus par la cytologie. Mais, en l absence d adénopathie, l analyse des frottis sanguin et médullaire associée à l étude immunophénotypique permet une approche aisée et relativement précise dans la forme myélo-sanguine du LCM. Cependant l intégration de la Ahmad E, Garcia D et Davis BH (2002). Clinical utility of CD23 and FMC7 antigen coexistent expression in B-cell lymphoproliferative disorder subclassification. Cytometry ;50:1 7. Beà S, Ribas M, Hernández JM et al. (1999) Increased Number of Chromosomal Imbalances and High-Level DNA Amplifications in Mantle Cell Lymphoma Are Associated With Blastoid variants. Blood ; 93 (12) : Benattar L et Flandrin G. (2003) Nouvelles approches diagnostiques des lymphomes malins B. Annales de Biologie Clinique ; 61(5) : Bonnet C, Caers J, De Prijck B et al. (2011) Lymphome du manteau : prise en charge. Revue Médicale Suisse ; 7 (306) : Delsol G. (2010) Les anomalies moléculaires dans les lymphomes. Bulletin du cancer ; 97 (11) : Gao J, Peterson L, Nelson B, Goolsby C et Chen YH. (2009) Immunophenotypic variations in mantle cell lymphoma. American Journal of Clinical Pathology ;132(5): Guillaume N, Alimardani G, Capiod JC et Claisse JF. (2002) Pertinence des analyses cytologiques et immunophénotypiques dans le diagnostic de la leucémie lymphoïde chronique B. Annales de biologie clinique ; 60 (6) Jares P, Colomer D et Campo E. (2007) Genetic and molecular pathogenesis of mantle cell lymphoma: perspectives for new targeted therapeutics. Nature Reviews Cancer ; 7 (10) : Jaspers A, Baron F, Bonnet C et al. (2010) Le lymphome du manteau. Revue Médicale de Liège ; 65 (4) : Kelemen K, Peterson LC, Helenowski I et al (2008). CD23+ mantle cell lymphoma: a clinical pathologic entity associated with superior outcome compared with CD23 disease. Am J Clin Pathol. ;130: RÉFÉRENCES cytogénétique et la biologie moléculaire mettant en évidence la translocation t(11 ;14) qui entraine une dérégulation de la cycline D1, protéine majeure du cycle cellulaire de la phase de transition G1-S, constituent les seuls arguments pour le diagnostic de certitude du LCM. Le Gouill S. (2010) Lymphome à cellules du manteau. In Tumeurs malignes rares ; pp Le Gouill S, Dousset C, Gastinne T et al. (2011) Le lymphome à cellules du manteau. Hématologie ; 17 (5) : Ondrejka SL, Lai R, Smith SD et Hsi ED. (2011) Indolent mantle cell leukemia: a clinicopathological variant characterized by isolated lymphocytosis, interstitial bone marrow involvement, kappa light chain restriction, and good prognosis. Haematologica.; 96(8) : Orchard J, Garand R, Zadie D et al. (2003) A subset of t(11;14) lymphoma with mantle cell features display smutated IgVH genes and includes patients with good prognosis, nonnodal disease. Blood ; 101 (12) : Rosenwald A, Wright G, Wiestner A et al. (2003) The proliferation gene expression signature is a quantitative integrator of oncogenic events that predicts survival in mantle cell lymphoma. Cancer Cell. ; 3 (2) : Seto M, (2013) Cyclin D1-negative mantle cell lymphoma. Blood ; 121 (8) : Swerdklow S, Campo E, Seto M et Muller-Hermelink H. (2008) Mantle cell lymphoma. In WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissue. IARC Press, Lyon, France; pp Thieblemont C. (2010) Les lymphomes à cellules du manteau. In Cahier de formation Bioforma ; 45 : Troussard X, Frétigny M, Delabesse E et al. (1997) Formes leucémiques révélatrices de lymphome du manteau sans syndrome tumoral. Hématologie ; 3 (4) : Weisenburger DD et Armitage JO. (1996) Mantle cell lymphoma. An entity comes of age. Blood; 87 :