1) Catalogue non exhaustif des voies de signalisation. 2) Discussions sur la signalisation lymphocytaire T

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1 M2 Biologie des Eucaryotes T cell signaling : from physiology to pathology Jacques Nunès 1) Catalogue non exhaustif des voies de signalisation 2) Discussions sur la signalisation lymphocytaire T Institut de Cancérologie de Marseille

2 Récepteur Signaux de transduction Apoptose rolifération Différenciation Adhérence

3 Différents types de couplage [ récepteur / activité enzymatique ] R R R E E A E R = récepteur E = enzyme effectrice A = molécule adaptatrice

4 Récepteurs liés à des protéines G hétérotrimériques R ( récepteur β adrénergique) α GD β γ α GT AT E ( adénylate cyclase ) AM cyclique Récepteurs liés à des molécules à domaines adaptateurs R ( récepteur à l EGF, DGF...) E Ras GD Ras GT

5 Domaines adaptateurs 30 types différents ( Trends Biochem. Sci. 22 pp ) 260 domains ( ROSITE database 03/2005) Les domaines plus célèbres ( aa) : - Src -homology 2 ( SH2 ) - Src -homology 3 ( SH3 ) - leckstrin -homology ( H )

6 Les domaines Src -homology Structure des TKs de la famille Src NH2 COOH Myr SH3 SH2 K AT SH1 Y Y Site de localisation membranaire xx YEEI/L domaine catalytique Région d autorégulation

7 SH2 YEEI/L Les domaines SH2 - Les domaines SH2 reconnaissent des sites peptidiques contenant une tyrosine phosphorylée. - Haute affinité de fixation entre domaines SH2 et des phosphopeptides ( Kd = nm ). - De nombreuses molécules contiennent des domaines SH2 = Notion de spécificité Séquence Y E E I Y - π Y ϕ X M Y ϕ X ϕ Y X X L X Y (V/I) N (V/I) rotéines se fixant Src, Lck, Fyn, Fgr Crk, Nck, Abl Sous-unité régulatrice de la I3K LCγ Lck, ZA70 Grb2

8 Les domaines TB hosphotyrosine Binding domain ( 150 aa) reconnaissent aussi des sites peptidiques contenant une tyrosine phosphorylée : Shc TB L D D N - Y The Shc TB domain bound to TrkA phospho-peptide (red) From Cell Signaling Technology TM website :

9 Les domaines SH3 SH3 xx - Les domaines SH3 reconnaissent des sites peptidiques (10 aa) contenant des prolines (ro - rich). - Faible affinité de fixation entre domaines SH3 et des peptides ro - rich ( Kd = µm ). - Deux types de peptides ro - rich peuvent être reconnus par des domaines SH3 = spécificité Classe I Classe II R A L L R Y V V R R R A L L R Y V V R R Src SH3 Grb2 SH3

10 Structure de la forme non active de Src

11 Régulation de l activité des Src kinases

12 Les domaines leckstrin Homology - résents dans de nombreuses molécules ayant des fonctions différentes : transduction, cytosquelette. - Ces domaines reconnaissent des sous-unités βγ des protéines G trimériques, des KCs, des phosphoinositides... - Ces domaines H permettraient de localiser une protéine au niveau d une membrane.

13 Les phosphoinositides interagissent avec différents domaines d interaction protéiques domaine H I(3) domaines FYVE domaines X I(3,4) 2 I(3,4,5) 3 domaines H domaines X D après B. ayrastre et al., 2001

14 Les grandes voies de la transduction Mobilisation du calcium intracytoplasmique Activation de phospholipases C spécifiques des phosphatidylinositol 4,5 di-phosphate : -LC β sont régulées par des protéines G trimériques, -LC γ sont régulées par des TKs. tdins(4,5)2 DAG LC OH KC Ins3 Récepteur aux Ins3 Ca 2+

15 Les grandes protéines G hétérotrimèriques Récepteurs à 7 segments transmembranaires adrénaline thrombine Adénylate cyclase G AMc G DAG + Ins3 LC β [ ligand/récepteur ] GD γ α β i α + GT GD γ β γ α β GT [ effecteurs ] LC β1 LC β2

16 Différentes petites protéines G famille Ras famille Rho famille Rab Expression de gènes Morphologie cellulaire Transport intracellulaire

17 Les activités td Ins 3 kinases ( I 3-kinase ) ( Trends Biochem. Sci. 22 p 267) tdins(4,5)2 tdins(3,4,5)3 I 3-kinase Récepteur au DGF SH3 ( YMDM ) Y- SH2 p110 ( YVM ) Y- SH2 p85 I 3-kinase I2 I3? Akt / KB TKs

18 Les grandes voies de la transduction après stimulation d un récepteur à activité tyrosine kinase kinase kinase Rho Cytosquelette Ras LC γ I 3-k Ca 2+ / KCs Expression des gènes Fonctions cellulaires

19 «DGF R signaling» DGF R Interactions Src Y IYV avec des protéines kinase à domaines SH2 I 3-k Nck Y MDM Y VM GA Y MA kinase Ras Grb2 Shp-2 Y TAV LC γ1 Y IIL

20 Signaling pathways in human cancer adapted from Stein and Waterfield. Molecular Medicine Today. September 2000

21 Méthodes d étude - I Mesure de la concentration en Ca 2+ intracytoplasmique. Substrats des TKs : analyse des protéines phosphorylées par western blot en utilisant un anticorps anti-phosphotyrosine. Analyse d une protéine : immunoprécipitations suivi d un test d activité enzymatique in vitro ou western blot. Utilisation de molécules chimèriques contenant des domaines adaptateurs isolés (ex. GST Src SH2). Cartographie peptidique.

22 Immunoblot (Western-blot) - art I Lyse Lysats contenant les protéines cellulaires Marqueurs de poids moléculaires précolorés Cellules Transfert sur membrane de nitrocellulose - + Migration en gel de polyacrylamide (SDS-AGE) Coloration ou Western-blot

23 Immunoblot (Western-blot) - art II Membrane contenant les protéines séparées par électrophorèse Coloration des protéines au Rouge onceau Immunoblot Incubation avec un anticorps spécifique d une protéine, uis incubation avec un anticorps secondaire couplé à la peroxydase. Réaction de chimio-luminescence. Révélation par autoradiographie.

24 Méthodes d étude - II II Modèles cellulaires : Expression de la protéine à étudier dans un système cellulaire qui ne l exprime pas : reconstitution d un système de transduction. cellules COS (rein), cellules d insectes ( papillon...)... Inhibition de l expression ou de l activité de la protéine à étudier inhibiteurs pharmacologiques, RNAi Visualisation (microscopie confocale, imagerie en temps réel, microscopie électronique )

25 Méthodes d étude - III Modèles animaux : les levures : Saccharomyces cerevisiae... les nématodes : Caenorhabditis elegans les mouches : Drosophila les souris génétiquement modifiées - inactivation génique knock out - remplacement par un gène muté knock in - transgénèse.

26 Signalisation lors de l activation lymphocytaire T

27 T cells and tumours ardoll Nature p1011

28 Contacts entre une cellule T et une cellule dendritique Nat. Immunol. Oct. 2001

29 BOTH SECIFIC LIGAND AND COSTIMULATION SIGNALS ROVIDED BY A ROFESSIONAL AC ARE REQUIRED FOR THE CLONAL EXANSION OF NAIVE T CELLS CA Cellule T CYTOKINES (IL-2) CMH Reconnaissance antigénique TCR 1 ROLIFÉRATION DIFFÉRENCIATION B7 Costimulation CD28 2 ADHÉRENCE Modulation du TCR et/ou co-récepteurs Absence de CD28 Antigène = peptide altéré Absence des CD28 ligands : les molécules B7 NON RÉONSE ANERGIE IGNORANCE AICD

30 Costimulation induite par la molécule CD28 lors de l activation du récepteur T (TcR) CMH / antigène B7.1 ou B7.2 TcR CD28 Signal 1 Signal 2 Anergie production IL-2 Bcl-X L FasL Apoptose rolifération cytotoxicité Survie cellulaire

31 Structure du complexe récepteur T CD4 TcR CD3 ζ ζ ε γ ε δ Lck Fyn Immunoreceptor tyrosine-based activation motif = ITAM YxxI/L (x) 6-8 YxxI/L

32 ITAM Tyrosine phosphorylation state Y L Y L TKs famille Src Y L Y L O 4 - O 4 - Y L Y L O 4 - O 4 - Y L Y L O 4 - O 4 - O 4 - kinase kinase ZA- 70 kinase ZA-70 Associée au complexe TcR / CD3 ZA-70 phosphorylée

33 «TCR signaling» tentative... TcR CD3 ζ ζ Ras GD Mek Erk LAT Fyn Grb2 Sos Ras c-raf Mek GT Erk MA Kinase Cbl Lck ZA-70 Shc?? Cyclosporine ( CsA ) SL-76 Vav Grb2 LAT Ca 2+ Calcineurine I3 Jun Kinases LC γ1 Hydrolyse des I2 DAG KC LAT p85 p110 I 3' Kinase S6-kinase rotéines ribosomales Akt Fos / Jun NF-AT1 A-1 NF-κB NF-AT Transcription du gène IL-2

34 Calcineurine (Ser/Thr phosphatase) est inhibée par des immunosuppresseurs Ca 2 + Cyclosporine A -Cyclophiline A Calmoduline B FK506 -FKB Calcineurine NFAT NFAT

35 Severe combined immunodeficiencies = SCID Réponses immunitaires (cellules T et B) affectées. 40 % des cas sont liés à des mutations héréditaires sur le chromosome X, 60 % des cas sont liés à des mutations sporadiques ou héréditaires sur les autosomes. Lymphopénie avec diminution des lymphocytes TcR/CD3 +, dans certains cas seule une sous-population T est affectée ( CD4 + ou CD8 + ) suggérant un problème de maturation des cellules T = problème de tranduction du signal?

36 Activation cellulaire T / SCID Défaut d expression de la chaine CD3γ ou CD3ε Défaut d expression de la chaine IL-2 Rγ Défaut dans la transmission des signaux de transduction? Cellule T TCR IL-2 CD28 rolifération - Différenciation

37 «TCR signaling» tentative... TcR CD3 ζ ζ Ras GD Mek Erk LAT Fyn Grb2 Sos Ras c-raf Mek GT Erk MA Kinase Cbl Lck ZA-70 Shc?? Cyclosporine ( CsA ) SL-76 Vav Grb2 LAT Ca 2+ Calcineurine I3 Jun Kinases LC γ1 Hydrolyse des I2 DAG KC LAT p85 p110 I 3' Kinase S6-kinase rotéines ribosomales Akt Fos / Jun NF-AT1 A-1 NF-κB NF-AT Transcription du gène IL-2

38 Cellules T issues des patients SCID: Dosage des ions Ca 2+ intracellulaires libérés lors d une stimulation du récepteur T Les cellules (BL) sont marquées avec une sonde fluorescente (Indo-1) qui émet à des longueurs d onde différentes suivant si elle est sous forme libre ou liée aux ions Ca 2+. Les cellules sont stimulées par des anticorps anti- CD3 ou par un ionophore du Ca 2+ (ionomycine). Les cellules sont analysées en cytométrie de flux. D après Chan et al. (1994) Science Vol. 264 p1599

39 Immunoblots réalisés sur des lysats de cellules T issues des patients SCID Western -blots Western-blot Anti-phosphotyrosine D après Chan et al. (1994) Science Vol. 264 p1600

40 NH2 ZA-70 Sites de mutations chez les patients immunodéficients SH2 SH2 Kinase COOH Mutations chez les patients immunodéficients 1 - rotéine plus courte (aa C-ter 503) dû à une délétion de 13pb 2 - Substitution Ser 518 en Arg dû à une mutation ponctuelle 3 - Insertion d un tripeptide Leu-Glu-Lys dû à la création par une mutation ponctuelle d un nouveau site de splicing Adapté de Hivroz et Fischer Current Biology 1994, Vol. 4 p732

41 KNOCK OUT DU GENE DE ZA-70 - as de lymphocytes dans le sang périphérique - Blocage sous une forme immature dans le thymus Negishi I et al. Nature 1995, Vol. 376 p435

42 ZA-70 et leucémie lymphocytaire chronique B - ZA-70 expression and prognosis in chronic lymphocytic leukaemia. Orchard JA, Ibbotson RE, Davis Z, et al. Lancet. 2004;363: ZA-70 compared with immunoglobulin heavy-chain gene mutation status as a predictor of disease progression in chronic lymphocytic leukemia. Rassenti LZ, Huynh L, Toy TL, et al. N Engl J Med. 2004;351: ZA-70 directly enhances IgM signaling in chronic lymphocytic leukemia. Chen L, Apgar J, Huynh L, et al. Blood : Antigen stimulation of the leukemic clone is increasingly implicated in the pathogenesis of CLL. Chen and colleagues provide evidence that expression of ZA-70 in CLL B cells renders IgM signaling more effective and thereby could contribute to the more rapidly progressive clinical course of ZA-70 positive CLL.

43 artie intracytoplasmique de la molécule CD28 SKRSRLLHSDYMNMTRRGTRKHYQYARDFAAYRS SH2 SH3 SH3 I3 -kinase Grb2, GRID Lck Itk, Tec Grb2, GRID TKs

44 Cellule T Cellule présentant l Ag LFA-1 CD11a / CD18 ICAM-1, 2, 3 CD54, CD102, CD50 CD2 CD4 ou CD8 TcR CD3 CD28 CD48, CD58, CD59 CMH B7-1, 2 CD80, CD86 LFA-1 CD11a / CD18 ICAM-1, 2, 3 CD54, CD102, CD50 Synapse immunologique, microdomaines/rafts, nombre de récepteurs...

45 Visualisation de la synapse immunologique Exemple : utilisation du domaine H de la protéine Akt fusionné à la GF pour visualiser une augmentation de I(3,4,5) 3 membranaires H Akt-GF GF

46 Les activités I 3-kinases tdins(4,5)2 tdins(3,4,5)3 I 3-kinase Récepteur SH3 ( YxxM ) Y- SH2 p110 ( YxxM ) Y- SH2 p85 I 3-kinase I2 I3 H Akt

47 Déplacement intracellulaire d un domaine H (Akt) fusionné à la Green Fluorescence rotein (GF) lors de la formation de la synapse immunologique Cellule présentant l antigène Video-Imaging Cellule T exprimant HAkt-GF Harriague and Bismuth, Nat. Immunol. 2002

48 The I3 -kinase / Akt pathway in human cancer TEN I 2 I 3 H Akt I3 - kinase Cellular targets : MDM2, mtor, TSC2, GSK3β, FKHR, NF-κB, BAD... Transformation, cell cycle, DNA repair, apoptosis adapted from Vivanco and Sawyers. Nature Reviews Cancer. July 2002

49 Expression du domaine H Akt-GF dans des cellules lymphocytaires T Lymphocyte T normal (prélèvement sanguin) Lymphocyte T leucémique (cellule Jurkat) F. Garçon, UMR599 INSERM Les cellules cancéreuses n exprimant pas TEN ont des taux de I3 membranaires élevés visualisés ici par la localisation du H Akt-GF

50 Membrane rafts / microdomaines Simons K. Functional rafts in cell membranes. Nature p569 He H-T. Menbrane rafts and signaling by the multichain immune recognition receptors. C. O. I p250 Seed B. Membrane compartmentation and the response to antigen C. O. I p265 Fractions insolubles dans un détergent non ionique TX-100 enrichis en sphingolipides (longues chaînes acylées saturées) et cholestérol = phase liquide ordonnée Hai-Tao HE (CIML)

51 GI-anchored proteins (Thy-1...) Rafts et protéines acylées TM proteins (LAT...) Intracellular proteins (Lck...)

52 Rafts et détection 1) Méthodes d extraction (tests biochimiques) 2) Marquage des molécules présentes dans les rafts (visualisation) Schütz et al. (2000) EMBO J. 19:

53 Nature du ligand Nombre de récepteurs T Nombre de molécules d adhérence Adhérence roximité (synapse, rafts, réseau d actine) Costimulation Rétrocontrôle Signal activateur harmacologie

54 Tout ce que vous avez voulu savoir sur la signalisation : TAEZ STKE Reviews, rotocols,teaching resources, Connection maps