Pourquoi l imagerie par spectrométrie de masse?

Transcription

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2 Imagerie tissulaire par spectrométrie de masse Nouvelles perspectives pour l identification de biomarqueurs en santé humaine Charles.pineau@rennes.inserm.fr i

3 Pourquoi l imagerie par spectrométrie de masse? La protéomique sur tissus est très contraignante: extraction des protéines disponibilité des échantillons abondance des protéines d intérêt Obtenir des informations sur la composition protéique dans chaque région du tissu Reconstruire une carte bidimensionnelle de la densité des ions (image) correspondant aux signaux détectés Comparer les profils moléculaires (images) entre p p ( g ) un tissu normal et pathologique

4 Stoeckli et al. Nature Medicine 2001; 7: Le principe

5 Quelle aproche pour quelle question?

6 L imagerie par spectrométrie de masse en 4 étapes 1. Réalisation des coupes histologiques 2. Application de matrice 3. Analyse par spectrométrie de masse 4. Reconstruction d image

7 Préparation des coupes de tissus congelés Cryostat head Embedding media Tissue specimen Cryostat blade Conductive MALDI target Tissue sections

8 L imagerie par spectrométrie de masse en 4 étapes 1. Réalisation des coupes histologiques 2. Application de matrice 3. Analyse par spectrométrie de masse 4. Reconstruction d image

9 Application de matrice BRUKER ImagePrep Vibrational Vaporization Aerosol generation Active drying: Nitrogen gas Conductive glass slide Tissue SprayHand Vaporization Matrix droplets ~ 20 µm diameter

10 Application de matrice Shimadzu Chemical Inkjet Printer Piezo print head

11 Application de matrice RapidSpotter ARM Acoustic ejection Labcyte Portrait 630 MALDI reagent multi spotter Acoustic ejection

12 L imagerie par spectrométrie de masse en 4 étapes 1. Réalisation des coupes histologiques 2. Application de matrice 3. Analyse par spectrométrie de masse 4. Reconstruction d image

13 Matrix Spotted Tissue Section MALDI TOF Mass Spectrometer Mass Spectrum Archived for each Geometrical Coordinate Acquire Mass Spectrum At Each Position Reflector mode Linear mode

14 L imagerie par spectrométrie de masse en 4 étapes 1. Réalisation des coupes histologiques 2. Application de matrice 3. Analyse par spectrométrie de masse 4. Reconstruction d image

15 Ion Density Maps can be Generated from a Single Experiment

16 Low Relative Intensity High Distribution of each m/z value can be displayed as an Ion Density Map

17 Hundreds of Ion Density Maps can be Generated from a Single Experiment

18 Intégration Imagerie MALDI et histologie Cornett, et al. Mol Cell Proteomics 2006; 5:

19 Selection de régions d intérêt Cornett, et al. Mol Cell Proteomics 2006; 5:

20 Visualisation des données Cornett, et al. Mol Cell Proteomics 2006; 5:

21 Identification de protéines directement à partir du tissu La désorption de protéines à partir de tissus et leur analyse par MALDI MS permet la mesure de la masse/charge (m/z) mais ne permet pas directement l identification de la protéine Deux raisons principales: La nature extensive de nombreuses modifications posttraductionnelles et leur dynamique La redondance des m/z mesurés à un point précis de la coupe

22 Identification de protéines directement à partir du tissu Digestion enzymatique in situ et analyse par spectrométrie de masse MS/MS analysis sur le tissu digéré Permetet l identification tio de protéines à partir de régions très localisées de la coupe (~200 mm diamètre) Permet également la détection de protéines de Mw relativement élevés (>30 kda) typiquement peu détectables en mode d ionisation MALDI

23 Identification de protéines directement à partir du tissu Application de matrice et de trypsine Shimadzu Chemical Inkjet Printer Piezzoprint head

24 Identification de protéines directement à partir du tissu Le Workflow Tissue Section Groseclose et al., J. Mass Spectrom. 42, (2007)

25 Correlation d image entre protéines intactes et peptides de digestion trysique Myelin Basic Protein Da Intact Protein Tryptic Peptides Identified La distribution de la protéine intacte est parfaitement superposable à celle des peptides issus de la digestion par la trypsine

26 Analyse de sequence MS/MS des peptides trypsiques L ion précurseur est sélectionné et fragmenté Les ions fils sont détectés

27 Analyse de sequence MS/MS des peptides trypsiques

28 Plusieurs protéines peuvent être identifiées à partir d une seule coupe de tissu Neurogranin PEP 19

29 Développements récents Mise à disposition d outils statistiques puissants (ClinProTools; Bruker Daltonics) Imagerie sur coupes formaldéhyde/paraffine (tous les groupes) Imagerie sur Tissu Microarrays (Caprioli s lab) Utilisation de matrices ioniques (Fournier et coll. Lille) Digestion en mode Spraycoating (Bruker Daltonics R&D) Utilisation de caches perforés 30 µm (Fournier et coll. Lille)

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