02/12/2011. Les bases de la microscopie. Plan. Plan. La loupe : Grossissement = h

Transcription

1 Les bases de la microscopie Plan Introduction/rappels La microscopie en transmission Techniques de contraste La microscopie de fluorescence Images Plan But de la microscopie: voir la structure fine des objets Introduction/rappels La loupe : La microscopie en transmission Techniques de contraste h h Loupe Rétine œil La microscopie de fluorescence Grossissement = h h (de 1,5x à 10x) Images Agrandir plus...le microscope! Ce que l on peut observer. B A A2 A1 Rétine Objectif B1 Oculaire œil B2 Grossissement = grossissement de l objectif x grossissement de l oculaire agrandissement jusqu à 2000x! 1

2 Agrandir... Agrandir ne suffit pas! Nature de la lumière. La lumière est une onde électromagnétique Vitesse de propagation : c = m.s -1 Résolution! Longueur d onde (couleur) Grossissement identique! Spectre visible Conséquence: Interférences Conséquence: Diffraction La tache de diffraction diminue quand diminue Conséquence: Interférences Conséquence: Diffraction Disque de diffraction Abbe (1873) Source ponctuelle idéale Objectif Point lumineux 2

3 Conséquence: Diffraction Résolution Critère de Rayleigh : d = 0,61 N.A. N.A. : ouverture numérique de l objectif La lumière violette donne une meilleure résolution que la rouge NA Ouverture numérique Lambda/NA N.A. = n sin(µ) n : indice de réfraction µ : demi-angle du cône d illumination N.A. 0,12 0,87 Critère de Rayleigh : d = 0,61 N.A. N.A. : ouverture numérique de l objectif faible résolution haute résolution Plan Le microscope à transmission Introduction/rappels Anatomie du microscope La microscopie en transmission Oculaires Techniques de contraste Objectifs Echantillon La microscopie de fluorescence Images Condenseur Lampe 3

4 Source lumineuse Soleil, lampe à incandescence, lampe halogène,... Illumination Illumination critique Objectif Illumination de Köhler Plan objet Condenseur diaphragme d ouverture Lampe diaphragme de champ condenseur Objectifs Principales spécifications : - ouverture numérique (ex. : 1,4) - grandissement (ex.: 60x) - milieu d immersion (air, eau, huile) - type de correction Les aberrations Différents types d objectifs suivant l application : 4

5 Les objectifs à l infini: principe. Objectifs corrigés à l infini Objectif «à l infini» B A A2 A1 Rétine Objectif Lentille de tube B1 Oculaire œil B2 Objectifs à immersion Réfraction Objectifs à immersion Les caméras: principe général. Les puits de potentiels. Un capteur CCD Classique: Une matrice 2D de puits de potentiel arrangés en colonnes un registre parallèle registre série un amplificateur de sortie une structure semi-conducteur une conversion photon-électron un confinement des électrons par potentiel Résolution spatiale 5

6 Transfert de l information. Le registre parallèle. Readout Sequence of a CCD Only subset of pixels shown! Amplifier Output Node Read Out Résolution temporelle Performances: Plan Introduction/rappels La microscopie en transmission Le rendement quantique Le bruit Le bruit provient principalement de trois sources : - Le bruit de photon: il est inhérent au capteur et dépend de la statistique d arrivée des photons incidents - Le courant d obscurité: il est issu des électrons générés par effet thermique. - Le bruit de lecture: il est généré par l électronique de la caméra. Techniques de contraste La microscopie de fluorescence Images Autres techniques de contraste Le contraste de phase (Zernike) Transmission Contraste de phase Contraste interférentiel (DIC/Nomarski) Déphasage à la traversée d un milieu d indice n2 > n1 6

7 Le contraste de phase Contraste interférentiel (DIC, Nomarski) Choisir un anneau de phase adapté à l'objectif Bien régler la position phase Le contraste dépend des différences de chemin optique entre les deux ondes. Polarisation de la lumière Un autre type de contrastes: la microscopie de fluorescence. Plan Introduction/rappels La microscopie en transmission Techniques de contraste La microscopie de fluorescence Images Imagerie de fluorescence. Imagerie de fluorescence. Avantages : Faiblement invasif Spécificité de la détection Multi marquage Problèmes : Bruit de fond Fading usure du fluorophore Phototoxicité espèces réactives de l oxygène Excitation Émission S2 S1 Eex <10-12 s S0 Diagramme de Jablonski Eem s 10-9 s Eex > Eem ex < em 7

8 Les sources de lumières. Sélection de la lumière dans un microscope. Lampe à vapeur de mercure Spectre de la lumière émise Les types de filtres. Filtres et sources Les types de filtres. Spectres d emmissions normalisés?! 8

9 Anatomie d un microscope Anatomie d un microscope Anatomie d un microscope droit Anatomie d un microscope inversé Anatomie du microscope Anatomie du microscope 9

10 Exemple d images. Transformed African Green Monkey Kidney Fibroblast Cells (COS-1 Line) problèmes classiques. labeled with Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 568 conjugated to goat secondary antibodies that target mouse anti-fibrillarin (nucleoli) and rabbit anti-giantin (targeting the Golgi complex) primary antibodies, respectively. Nuclei were stained with Hoechst Combinaison des techniques de contraste Limites du microscope classique Cellules 3T3 (DAPI) Point Spread Function (PSF) mauvaise discrimination des objets suivant l axe optique (profondeur) S affranchir de la lumière provenant des autres plans de l échantillon : la microscopie confocale! Plan Images Introduction/rappels Les choses à comprendre pour pouvoir analyser une image : La microscopie en transmission Comment elle se forme Coordonnée spatiales Techniques de contraste Les niveaux de gris La microscopie de fluorescence Les modes de représentation Images 10

11 Images pixels Objet à observer Objectif Pixels (picture elements) Image physique x16 Capteur Image analogique numérisation Image numérique : 256*256 pixels Détail de l image : observation des points élémentaires Image numérique Echantillonnage: critère de Nyquist. Simplification 1D Echantillonnage: critère de Nyquist. Simplification 1D Y.Usson pixels Niveaux de gris 11

12 MEDIANNE MOYENNE 02/12/2011 Niveaux de gris Look up tables Blanc LUT «standard» B LUT «inverse» 0 Noir N On utilise pas toutes les couleurs!!!! Traitement 1: réduire le bruit Traitement 1: réduire le bruit Principe : Pour chaque pixel de l image, on attribue la valeur médiane d un zone comportant ce pixels et ses voisin. Avantage : 5 5 Un bruit de type poivre et sel donnera des valeurs très différentes de son voisinage. Il modifiera fortement une valeur moyenne, mais pas une médiane Traitement 2: simplifier l information Traitement 2: simplifier l information 12

13 Traitement 2: simplifier l information Traitement 3: identifier les objets Dilatation/fermeture: masque Fermeture Traitement 3: identifier les objets Ouverture/remplissage : Traitement 3: identifier les objets connexité et labellisation Connexité à 4 voisin Connexité à 8 voisin remplissage érosion remplissage Trouve 4 objets Trouve 1 objets Traitement 3: identifier les objets connexité et labellisation Visualiser des objets complexes en 3D Trouve 3 objets 13

14 Visualiser des objets complexes en 3D Visualiser des objets complexes en 4D + tracking Visualiser des objets complexes en couleur! Visualiser des objets complexes en couleur et dans le temps! 14