Androstenedione Saliva ELISA

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1 Fiche technique Androstenedione Saliva ELISA Test immuno-enzymatique pour la détermination quantitative d'androstènedione dans la salive. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1 USAGE PRÉVU Méthode immunoenzymatique colorimétrique par compétition pour la détermination quantitative d'androstènedione libre dans la salive. 2 SIGNIFICATION CLINIQUE L'androstènedione (ou Δ4-androstènedione) est une hormone stéroïdienne produite dans les glandes adrénales et les gonades comme intermédiaire de la voie biochimique de la synthèse de la testostérone, de l'estrone et de l'œstradiol. Il s'agit du précurseur commun des hormones sexuelles mâles et femelles. L androstènedione sécrétée dans le plasma peut être convertie par les tissus périphériques en testostérone et en œstrogène. L androstènedione a une action androgène relativement faible, environ 20 % de la testostérone. Les taux d'androstènedione dans le sérum excèdent toutefois souvent ceux de testostérone tant chez les sujets sains que malades. De plus, les taux de production et de sécrétion excèdent ceux de testostérone même chez les femmes chez lesquelles on relève une conversion supplémentaire de l'androstènedione en testostérone. Chez les femmes en pré-ménopause, les glandes adrénales et les ovaires synthétisent environ la moitié de l'androstènedione totale (environ 3 mg/jour). En ménopause, la synthèse d'androstènedione est à peu près réduite de moitié en raison d'une réduction de la synthèse par les ovaires. L'androstènedione est malgré tout le principal stéroïde produit par l'ovaire en post-ménopause. La corrélation élevée entre les taux dans le sérum et dans la salive permet d'estimer précisément les taux d'androstènedione en effectuant le test sur la salive. 3 PRINCIPE DE LA MÉTHODE L'androstènedione «libre» (antigène) présent dans l'échantillon rentre en compétition avec l'antigène marqué à la peroxydase par rapport à l'anticorps anti-androstènedione adsorbé sur microplaque (phase solide). La séparation libre-lié est obtenue par simple lavage de la phase solide. L enzyme présent dans la réaction liée catalyse la réaction entre le substrat (H 2 O 2 ) et le substrat TMB (TMB) en développant une coloration bleue qui vire au jaune après ajout de la solution d'arrêt (H 2 SO 4 ). L intensité de la couleur développée est inversement proportionnelle à la concentration de l'androstènedione «libre» dans l'échantillon. La concentration de l'androstènedione dans l'échantillon est calculée sur la base d'une série d étalons. 4 RÉACTIFS, MATÉRIAUX ET INSTRUMENTS 4.1 Réactifs nécessaires fournis dans le coffret Quantité Symbole Composant 1 x 12 x 8 MTP Microplaque Barrettes sécables. Anticorps anti-androstènedione adsorbée sur microplaque. 1 x 1.0 ml ENZCONJ CONC Conjugué Enzymatique, Concentré (100 x) Contient: Conjugué Androsténedione-HRP 5 x 1.0 ml CAL 0-4 Étalon 0-4 0; 20, 100,400; 1000 pg/ml Contient: Androsténedione. UNITÉS SI: pg/ml x = pmol/l 2 x 1.0 ml CONTROL 1+2 Contrôle 1+2 Consulter les concentrations exactes sur les étiquettes des flacons ou sur le certificat CQ. 1 x 30 ml DILBUF Tampon de Dilution Contient: Tampon phosphate ph 7.5 BSA 1 g/l. 1 x 20mL WASHBUF CONC Tampon de Lavage, Concentré (50 x) Contient: NaCl 45 g/l; Tween20 55 g/l. 1 x 15 ml TMB SUBS Solution Substrat TMB Contient: H 2O 2-TMB 0.26 g/l (éviter tout contact avec la peau). 1 x 15 ml TMB STOP Solution d Arrêt TMB Contient: 0.15 mol/l Acide sulfurique. 4.2 Réactifs nécessaires non fournis dans le coffret Eau distillée. 4.3 Matériaux et instruments auxiliaires Distributeurs automatiques. Lecteur pour microplaques (450 nm, nm). Dispositif de prélèvement de salive Version 10.0 (01) 2016/08 1 / 6

3 Remarques Conserver tous les réactifs à 2 C - 8 C, à l'abri de la lumière. N'ouvrir le sachet du Microplaque enrobé (MTP) qu'après l'avoir ramené à température ambiante et refermez-le tout de suite après avoir prélevé les bandes à utiliser; une fois ouvert, il est stable jusqu'à la date d'échéance du coffret. Éviter de détacher la feuille adhésive des bandes qui ne sont pas utilisées pendant l'analyse en cours. 5 AVERTISSEMENTS Ce coffret est exclusivement pour usage in vitro et l'essai doit être exécuté par un personnel expert. Ne pas utiliser pour usage interne ou externe chez les Humains ou les Animaux. Utilisez les dispositifs de protection individuelle prévus pendant toute opération avec les réactifs fournis. Suivez les Bonnes Pratiques de Laboratoire (GLP) pour la manipulation des produits sanguins. Certains réactifs contiennent de petites quantités de Proclin 300 comme conservateur. Eviter tout contact avec peau et les muqueuses. Le Chromogène TMB contient un irritant qui peut être nocif si inhalé, ingéré ou absorbé à travers la peau. Pour empêcher des lésions, éviter toute inhalation ou ingestion par la peau ou les yeux et tout contact cutané ou oculaire. La solution d'arrêt est constituée d'une solution d'acide sulfurique dilué. L'acide sulfurique est poison et corrosif et peut être toxique s'il est ingéré. Pour prévenir toute brûlure chimique possible, éviter le contact avec la peau et les yeux. Éviter l'exposition du réactif TMB/H 2 O 2 à la lumière directe du soleil, aux métaux et aux substances oxydantes. Ne pas congeler la solution. Cette méthode permet de déterminer des concentrations d'androstènedione de 5 pg/ml à 1000 pg/ml. L'administration de stéroïdes naturels ou synthétiques peut altérer les taux d'androstènedione dans la salive. 6 PRÉCAUTIONS D'USAGE Observer rigoureusement l'ordre des passages indiqué dans le présent protocole. Les résultats présentés ici ont été obtenus en utilisant les réactifs spécifiques énumérées dans ces Instructions d'utilisation. Tous les réactifs doivent être conservés à une température contrôlée de 2 C - 8 C dans leurs conteneurs originaux. Les exceptions sont clairement marqués. Les réactifs sont stables jusqu'à la date d'expiration lorsqu'ils sont conservés et manipulés conformément aux instructions fournies. Avant usage, laisser reposer tous les éléments des coffrets et les échantillons à température ambiante (22 C - 28 C) et mélanger avec soin. Ne pas échanger des éléments du coffret provenant de lots différents. Les dates d'échéance rapportées sur les étiquettes des récipients d'expédition et sur celles de tous les ampoules doivent être observées. Ne pas utiliser d'éléments au-delà de leur date d'échéance. Si vous utilisez des équipements automatisés est de la responsabilité de l'utilisateur de s'assurer que le kit a été correctement validées. Un lavage incomplet ou peu soigné et une aspiration insuffisante du liquide dans les puits des tests ELISA peuvent provoquer un manque de précision et/ou un arrière-plan élevé. Il est important de maintenir constants les temps de réaction dans chaque puits afin d'obtenir les résultats susceptibles d'être répétés. Le pipetage des échantillons ne doit pas durer plus de 10 minutes afin d'éviter tout résultat incorrect. S'il se prolonge au-delà des 10 minutes, il est recommandé de suivre l'ordre de distribution. Si vous devez utiliser plus d une microplaque, il est conseillé de répéter la courbe dose-réponse. L ajout de la solution de substrat donne lieu à une réaction cinétique qui est interrompue par l'ajout de la solution de blocage. Par conséquent, il est nécessaire d'ajouter le substrat et la solution bloquante dans la séquence même afin d'éliminer toute variation temporelle pendant la réaction. Observer les instructions relatives à l'exécution du contrôle de qualité dans les laboratoires cliniques en testant les contrôles et/ou les groupes de sérum. Observer la plus grande précision dans la reconstitution et la distribution des réactifs. Ne pas utiliser des échantillons microbiologiquement contaminés ou des échantillons hautement lipémiques ou hémolysés. Les lecteurs de microplaques mesurent dans le sens vertical. Ne pas toucher le fond des puits. Version 10.0 (01) 2016/08 2 / 6

4 7 PROCÉDURE 7.1 Préparation des étalons (CAL 0, CAL 1, CAL 2, CAL 3, CAL 4) Avant utilisation, laisser sur l'agitateur rotatif pendant au moins 5 minutes. Les étalons sont prêts à l'emploi; les concentrations suivantes d'androstènedione correspondent aux étalons: CAL 0 CAL 1 CAL 2 CAL 3 CAL 4 pg/ml Pour des échantillons avec des concentrations majeures de 1000 pg/ml, diluer l'échantillon (1:2) avec du CAL 0. Stables 6 mois à 2 C - 8 C à compter de l'ouverture des flacons. UNITÉS SI : pg/ml x 3,487 = pmol/l 7.2 Préparation du conjugué dilué Préparer immédiatement avant l'usage. Diluer 10 μl de conjugué (ENZCONJ) à 1 ml de tampon d'incubation (DILBUF). Agiter doucement. Stables pendant 3 heures à température ambiante (22 C - 28 C). 7.3 Préparation de la solution de lavage Avant l'usage, diluer le contenu de chaque flacon de solution de lavage concentrée et tamponnée (WASHBUF) (50x) avec de l'eau distillée jusqu'à un volume de 1000 ml. Pour préparer des volumes moindres, respecter le rapport de dilution de 1:50. La solution de lavage diluée est stable à 2 C - 8 C pendant au moins 30 jours. 7.4 Préparation de l'échantillon et de les contrôles Ce kit permet la détermination de l'androstènedione dans les échantillons de salive. Il est conseillé, pour prélever un échantillon, d'utiliser des éprouvettes en verre pour centrifugation. Ne pas utiliser collecteur d'échantillon disponible dans le commerce comme les "SALIVETTE". Aucun autre type de dispositifs de prélèvement disponible en commerce n'a été testé. Les contrôles sont prêts à l'emploi Méthode et limites Recueillir les échantillons de salive dans les temps prescrits. En l'absence d'indications spécifiques aux fins du prélèvement de la salive, il est possible de recueillir les échantillons à tout moment en tenant toutefois en compte les facteurs suivants. a. Si le prélèvement de la salive doit être effectué le matin, il faut le faire avant de se laver les dents. b. Pendant la journée, attendre au moins une heure après avoir mangé, après avoir pris des médicaments oraux ou se brosser les dents. c. Il est très important d'obtenir un échantillon liquide non contaminé par la nourriture, des produits cosmétiques, du sang, du chewing-gum ou d'autres matières étrangères Traitement de la salive 1. Faire passer la salive à travers la paille et jusque dans l'éprouvette en verre. 2. Centrifuger l'échantillon pendant 15 minutes à 3000 t/min. 3. Le déposer à 20 C pendant au moins 1 heure. 4. Centrifuger encore pendant 15 minutes à 3000 t/min. 5. L'échantillon de salive est alors près pour être testé. 6. Conserver l'échantillon à 2 C - 8 C pendant une semaine ou à -20 C pendant une période de temps plus longue. Version 10.0 (01) 2016/08 3 / 6

5 7.5 Procédure Amener tous les réactifs à température ambiante (22 C - 28 C). À la fin de l'essai, conservez les réactifs immédiatement à 2-8 C; évitez la longue exposition à la température ambiante. Les bandes de puits non utilisé doit être appelé immédiatement dans le sachet refermable contenant déshydratant et stocké à 2 C - 8 C. Pour éviter la potentielle contamination microbienne et/ou des chimique ne pas retourner les réactifs inutilisés dans les flacons original. Afin d'augmenter la précision des résultats de l'épreuve est nécessaire de travailler en double: préparer deux puits pour chaque point de la courbe d'étalonnage (CAL 0-CAL 4), deux pour chaque contrôle, deux pour chaque échantillon et un pour l'échantillon blanc Réactif Étalon Échantillons / Contrôles Blanc Étalon CAL 0-CAL 4 50 µl Échantillons / Contrôles 50 µl Conjugué dilué 150 µl 150 µl Laisser incuber 1 h à +37 C. Laver la plaque 3 x avec 300 μl de tampon de lavage dilué. Egoutter l excès de solution en retournant la plaque et en la tappant sur du papier absorbant. Note iimportante: Pendant chaque pas de lessive, secouez doucement la plaque depuis 5 secondes. Laveur automatique: Si vous utilisez un équipement automatisé, lavez les puits au moins 5 fois Substrat TMB 100 µl 100 µl 100 µl Laisser incuber 15 minutes à température ambiante (22 C -28 C), à l'abri de la lumière. Solution d'arrêt 100 µl 100 µl 100 µl Agiter doucement la microplaque. Lire l'absorbance à 450 nm (Longueur d onde de référence: nm) ou en mettant à zéro avec le blanc dans les 5 minutes. 8 CONTRÔLE DE QUALITÉ Chaque laboratoire devrait analyser les échantillons dans la gamme des niveaux élevés, normaux et base d'androstènedione pour vérifier les prestations de l'analyse. Ces échantillons devraient être traités comme inconnus et les valeurs déterminées devraient être dans chaque test effectué. Les tableaux de contrôle de la qualité devraient être observés afin de suivre les prestations des réactifs fournis. Des méthodes statistiques appropriées devraient être employées pour vérifier la tendance. Le laboratoire devrait définir des limites d'acceptabilité des prestations d'analyse. Les autres paramètres qui devraient être contrôlés incluent les interceptions de 80, 50 et 20% de la courbe d'étalonnage pour évaluer la reproductibilité. De plus, la capacité d'absorption maximale devrait être constante avec l'expérience précédente. La déviation significative par rapport aux prestations établies peut indiquer un changement non observé des états ou une dégradation expérimentale des réactifs du coffret. Des réactifs frais doivent être utilisés pour déterminer le motif des variations. 9 RÉSULTATS 9.1 Extinction moyenne Calculer l'extinction moyenne (DO) de chaque point de la courbe d'étalonnage et de chaque échantillon. 9.2 Courbe d'étalonnage Sur un graphique des valeurs d'absorbance, tracer les valeurs calculées des extinctions moyennes (DO) de chaque étalon (CAL 0-CAL 4) en fonction des concentrations. Tracer la meilleur courbe passant par les points d'étalonnage (par ex. : logistique à quatre paramètres). 9.3 Calcul des résultats Sur le graphique, faire une interpolation des valeurs d'absorbance relatives à chaque échantillon et en lire la concentration correspondante en pg/ml. Version 10.0 (01) 2016/08 4 / 6

6 10 VALEURS DE RÉFÉRENCE Du fait que les valeurs d'androstènedione salive ont un rythme circadien, nous suggérons de recueillir les échantillons à la même heure (8 A.M.) : Les valeurs suivantes peuvent servir d'indication préliminaire jusqu'à ce que chaque laboratoire établisse sa propre fourchette de valeurs normales. pg/ml Normales FEMMES : P.C.O. - Hirsutisme HOMMES : Il est important de noter que la détermination d'une gamme de valeurs attendues dans une méthode donnée pour une population de «normal» est tributaire de nombreux facteurs, tels que la spécificité et la sensibilité de la méthode en usage, et la population étudiée. Par conséquent, chaque laboratoire devrait examiner la gamme spécifiée par le fabricant comme un guide général et de produire leur propre gamme de valeurs attendues sur la base des laboratoires où la population autochtone habite. 11 PARAMÈTRES CARACTÉRISTIQUES 11.1 Précision Intra-essai La variabilité à l'intérieur du même coffret a été déterminée en répliquant (16x) la mesure de deux contrôles salivaires différents. La variabilité intra-essai est 8,5% Inter-essai La variabilité entre dosages différents a été déterminée en répliquant (10x) la mesure de deux contrôles salivaires différents avec des coffrets appartenant à des lots différents. La variabilité inter-essai est 11% Exactitude L'épreuve de récupération conduite sur des échantillons enrichis avec pg/ml d'androstènedione a donné une valeur moyenne (±SD) de 102,60% ± 13,23% Sensibilité La concentration minimale d'androstènedione mesurable qui pouvent être distinguées par l'étalon zéro est de 5 pg/ml avec une limite de confiance de 95% Spécificité L'anticorps employé présente les réactions croisées suivantes, calculées à 50% selon Abraham : Androstènedione 100 % Testostérone 1,2 % Épitestostérone 0,2 % 5α-dihydrotestostérone 0,1 % DHEA 0,1 % Progestérone 1x10-3 % Estrone 1x10-3 % Cortisol 1x10-3 % 11.5 Corrélation Le coffret d' Androstenedione Saliva ELISA (RE52671) a été comparé à un coffret disponible en commerce. 38 échantillons de salive ont été testés. La courbe de régression est : y = 0,46x + 5,51 r 2 = 0,983 y = Androstenedione Saliva ELISA (RE52671) x = Salimetrics ELISA pour l'androstènedione salive 12 DISPOSITIONS RELATIVES À L'ÉLIMINATION DES DÉCHETS Les réactifs doivent être jetés conformément aux lois en vigueur. Version 10.0 (01) 2016/08 5 / 6

7 13 BIBLIOGRAPHIE 1. Judd H. and Yen S. J. Clin. Endoc. & Metab., (1973) 2. Abraham G. J. Clin. Endoc. &M.39, 340 (1974) 3. Hillier S.G. 79th Year book Medical Publishers Inc: Chicago. (1985) 4. Venturoli S. et al Fertility and Sterility, 48(1), 78 (1987) 5. Venturoli S. et al Hormone Res., 24, 269 (1986) 6. D. Riad et al Endocr. Reviews, 3 (4) (1982) 14 SUGGESTIONS POUR LA RÉSOLUTION DES PROBLÈMES / DÉPANNAGE ERREUR CAUSES POSSIBLES / SUGGESTIONS Aucune réaction colorimétrique du dosage non distribution du conjugué contamination du conjugué et/ou du substrat erreurs dans l'exécution du dosage (par ex., distribution accidentelle des réactifs dans le mauvais ordre ou en provenance des mauvais flacons, etc.) Réaction trop faible (DO trop basse) conjugué non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original) temps d'incubation trop court, température d'incubation trop basse Réaction trop intense (DO trop élevée) conjugué non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original) temps d'incubation trop long, température d'incubation trop élevée mauvaise qualité de l'eau utilisée pour la solution de lavage (bas degré de déionisation) lavages insuffisants (conjugué non entièrement aspiré) Valeurs inexplicablement hors plage contamination des pipettes, embouts ou récipients lavages insuffisants (conjugué non entièrement aspiré) CV% intra-essai élevé les réactifs et/ou les bandes n'ont pas atteint la température ambiante avant usage le dispositif de lavage pour microplaques ne lave pas correctement (suggestion : nettoyer la tête du dispositif de lavage) CV% inter-essai élevé conditions d'incubation non constantes (temps ou température) contrôles et échantillons non distribués en même temps (avec les mêmes intervalles) (contrôler l'ordre de distribution) variabilité intrinsèque des opérateurs Version 10.0 (01) 2016/08 6 / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /