École doctorale PPP. Alain Guillet 13 décembre Tests paramétriques ou non paramétriques 2. 4 Tests statistiques sur des données normalisées 3
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- Maximilien Desjardins
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1 École doctorale PPP Alain Guillet 13 décembre 2011 Table des matières 1 Bonne pratique 2 2 Tests paramétriques ou non paramétriques 2 3 Comparaison de ratios 3 4 Tests statistiques sur des données normalisées 3 5 ANOVA one-way, two-way, post-hoc tests : comment choisir ANOVA I, ANOVA II et ANOVA à mesures répétées Tests post hoc Contrastes Interprétation des données d une régression non linéaire Comparaison de plusieurs modèles sur un même jeu de données Comparaison de courbes entre différents groupes Comparaison des valeurs d EC 50 ou des pentes en présence de plusieurs groupes Références 8 1
2 1 Bonne pratique Avant de récolter les données, il est préférable de rencontrer un statisticien, ou quelqu un qui a suffisamment de notions statistiques, afin qu il puisse vous aider à calculer les tailles d échantillons qu il faudrait idéalement mais aussi pour discuter du design expérimental car celui-ci peut être parfois impossible à analyser dû à une trop grande complexité ou des groupes mal balancés, c est-àdire, qui n ont pas tous le même nombre d observations. On peut remarquer que des logiciels comme G*Power [4] ou comme PASS, accessible sur le serveur de logiciels statistiques (cf. http :// permettent facilement de calculer une taille d échantillons ou une puissance en donnant divers paramètres. Si vous ne calculez pas de taille d échantillons alors dans l idéal, avoir une vingtaine d observations par groupe permet d avoir quelque chose de «valide». En effet, il est très facile d avoir des faux positifs [5] ou des faux négatifs sur de petits échantillons. Quand une observation est bizarre, il est toujours préférable de la garder dans les données surtout quand on a peu de données, l idéal étant alors d augmenter la taille de l échantillon afin de voir si on trouve d autres observations avec ce genre de valeurs. On devrait l enlever seulement sur des considérations expérimentales et pas statistiques. Par exemple, si une valeur est impossible alors on peut l enlever mais dans tous les cas, quand on retire une observation, on doit le mentionner et également préciser la raison du retrait. Enfin, il est recommandé de faire des analyses descriptives avant de se lancer dans des analyses statistiques. En effet, elles permettent de détecter si quelque chose n a pas marché dans la collecte des données et donnent une meilleure compréhension des données ainsi que des résultats des analyses statistiques que l on fera après. 2 Tests paramétriques ou non paramétriques Quand on travaille sur de petites échantillons ou bien que les hypothèses d un test paramétrique ne sont pas toutes vérifiées, il est alors recommandé de travailler avec des tests non paramétriques. Si le problème est dû à la non normalité des données, on peut essayer une transformation mathématique (log, arcsin, carré, racine carré, inverse, etc.) afin de valider l hypothèse de normalité sur les données transformées et on utilisera un test non paramétrique seulement si aucune des transformations essayées ne fonctionne. On pourrait se demander pourquoi travailler avec des tests paramétriques si leurs équivalents non paramétriques fonctionnent dans tous les cas. La raison est que les tests paramétriques sont plus puissants que les non paramétriques, c està-dire, ils vont détecter avec moins de données une différence statistiquement significative et également parce que certaines choses ne sont pas possibles en non paramétrique. La table 1 reprend quelques tests paramétriques et leurs équivalents non paramétriques. 2
3 Table 1 Analyses paramétriques et non paramétriques équivalentes Analyse paramétrique Analyse non paramétrique équivalente Test t pour échantillons indépendants Test t pour échantillons appariés ANOVA I ANOVA II Coefficient de corrélation de Pearson 3 Comparaison de ratios Test de Mann-Whitney Test des rangs signés de Wilcoxon Test de Kruskal Wallis Test de Friedman Coefficient de corrélation de Spearman On veut comparer des rapports, par exemple représentant l intensité de fluorescence dans la membrane divisée par l intensité de fluorescence dans le cytoplasme en fonction de trois traitements réalisés sur des cellules. On a ici six à sept observations par traitement. On peut donc faire une ANOVA I pour comparer les moyennes des trois groupes, ce qui nous permettra de dire s il y a des différences dues au traitement. Il est toujours préférable de travailler avec le logarithme du ratio plutôt que directement avec le ratio car ce type de données suit une lognormale. 4 Tests statistiques sur des données normalisées On normalise souvent les données pour essayer d avoir des résultats comparables d une expérience à l autre en se servant d une espèce de contrôle. Attention, il faut que celui-ci n interagisse pas avec les actifs que l on va utiliser dans les expériences. Après une normalisation, il est possible de faire des analyses statistiques comme on les fait sur des données non normalisées, c est-à-dire, en utilisant l ANOVA, le test t, etc. Une autre façon d analyser ce genre de données est de faire des ANOVA à mesures répétées (cf. partie 5.1) ou bien des modèles mixtes afin d éviter de devoir normaliser les données tout en tenant compte des différences entre les différentes expériences. L idée de ces analyses est qu il y a une base commune à l intérieur de chaque expérience et dont on va tenir dans les analyses. C est en fait la même idée que celle derrière la normalisation. Les modèles mixtes étant des modèles complexes à maîtriser, il faut absolument faire appel à quelqu un connaissant ce type de modèles. Enfin, un problème récurrent avec les données normalisées est celui de la représentation graphique. En effet, il y a différentes sources d erreur avec de telles données : l erreur autour de la moyenne d un traitement donnée et l erreur dans la répétition de l expérience. Il peut y en avoir d autres dans des cas plus compliqués. Si les différentes expériences sont indépendantes les unes des autres, on n a alors quelque chose d assez simple : σ = σ 2 experience n experience + σ 2 repetition n experiencen repetition, où σ est l écart-type et n est le nombre 3
4 d expériences ou de répétitions. Par exemple, une expérience peut être un morceau d aorte que l on va couper et sur lequel on fera plusieurs répétitions ou plusieurs traitements. Une autre expérience étant la même chose faite sur un autre morceau d aorte. Dans des cas plus compliqués, il y aura aussi des termes de covariance pour tenir compte des dépendances. Si vous ne voulez pas vous poser trop de questions, vous devriez reporter ce que l analyse statistique reporte comme estimation de la moyenne et comme erreur de l estimation. Ceci est aussi valable si vous faites une ANOVA à mesures répétées ou un modèle mixte, autrement dit même si vous n avez pas fait de normalisation. 5 ANOVA one-way, two-way, post-hoc tests : comment choisir On utilise l ANOVA lorsque l on souhaite comparer les moyennes de différents groupes en fonction d une ou plusieurs variables catégorielles, i.e. le sexe, le traitement reçu, etc. 5.1 ANOVA I, ANOVA II et ANOVA à mesures répétées On parle d ANOVA I ou one-way ANOVA en anglais lorsque l on compare les moyennes d au moins trois groupes en fonction d une seule variable explicative. Par exemple, la comparaison de la concentration d une drogue dans le sang en fonction du traitement reçu par les patients. En théorie, cette analyse n est applicable que si les données sont indépendantes les unes des autres, suivent une distribution normale dans chaque groupe et s il y a homoscédasticité des variances entre les groupes, c est-à-dire que si on fait un test statistique afin de voir si les variances entre groupes sont différentes, le résultat du test doit être un non rejet. Dans les faits, l ANOVA est robuste au non respect de la normalité (attention car si on s éloigne trop de la normalité, les résultats seront biaisés) et tous les logiciels de statistique permettent d utiliser une correction, en général de Welch, en cas d hétérogénéité des variances entre les groupes. L ANOVA II est une ANOVA où on aura plusieurs variables explicatives voire des interactions entre les variables explicatives. Par exemple, on fera une telle analyse si l on veut comparer la concentration dans le sang d une drogue en fonction du sexe et de l hôpital dans lequel elle a été administrée. Les hypothèses sont les mêmes que pour l ANOVA I. Enfin, l ANOVA à mesures répétées est une ANOVA dans laquelle on va comparer des moyennes entre plusieurs groupes mais où les observations sont liées. C est typiquement le cas quand on suit un paramètre biologique d un patient que l on voit plusieurs fois au cours du temps ou bien que l on utilise un même tissus avec plusieurs traitements. Ces hypothèses sont la normalité et la sphéricité des variances, souvent vérifiée à l aide du test de Mauchly. Les logiciels fournissent des corrections, comme Greenhouse-Geisser ou Huynh-Feldt, dans le cas où l on rejette l hypothèse de sphéricité. 4
5 5.2 Tests post hoc En général, savoir qu une variable explicative est significatives n est pas suffisant car l on souhaite savoir quels sont les groupes dont les moyennes diffèrent. Si on prend le cas de trois groupes, un groupe contrôle, un groupe ayant reçu le traitement t 1 et un autre le t 2, on peut très bien vouloir savoir s il y a des différences entre le contrôle et chacun des traitements. On pourrait penser qu il serait alors suffisant de faire deux tests t afin de comparer le groupe contrôle avec le traitement t 1 dans un premier temps, puis de comparer le groupe contrôle avec le traitement t 2. Le problème est qu en multipliant le nombre de tests, on augmente le risque de détecter par hasard une différence, c est pourquoi les tests post hoc existent. Parmi les tests post hoc les plus connus, on peut citer : Bonferroni : c est un test très simple à mettre en œuvre car il suffit de corriger les p-valeurs par le nombre de comparaisons que l on va faire. Par exemple, si on a trois comparaisons, on multipliera par trois les p-valeurs données par les trois tests statistiques en prenant comme maximum 1. Cette correction est la plus facile à mettre en œuvre avec des tests non paramétriques comme le test de Kruskal-Wallis. Tukey : ce test post hoc permet de comparer tous les groupes deux à deux. Dunnett : le test de Dunnett est utilisé uniquement si on souhaite comparer tous les groupes à un groupe donné, par exemple un groupe contrôle. Il en existe beaucoup d autres mais bien souvent les trois présentés ci-dessus suffisent dans la plupart des situations. 5.3 Contrastes Un contraste est une somme pondérée des moyennes des groupes que l on veut comparer et est réalisé après une ANOVA. C est une sorte d équivalent des tests post hoc mais où l on va utiliser des groupes poolés en spécifiant des poids. Ils sont préférables à faire des ANOVA séparées car ils tiennent compte de l ensemble des paramètres, ce qui n est pas vrai quand on fait des ANOVA indépendantes les unes des autres. Prenons comme exemple une étude dans laquelle on a trois traitements sur deux lignées différentes. Une ANOVA II avec une interaction permet de dire s il y a une différence de moyenne entre traitements, entre lignées et entre l interaction des deux. Imaginons que l on souhaite alors savoir s il y a des différences entre traitements à l intérieur d une des lignées, la bonne solution sera d utiliser des contrastes en les définissant sur l interaction lignée x traitements, dont chaque niveau est noté l 1 t 1,l 1 t 2, l 1 t 3, l 2 t 1, l 2 t 2, l 2 t 3, de la manière suivante : Comparaison Contraste l 1 t 1 vs l 1 t l 1 t 1 vs l 1 t l 1 t 2 vs l 1 t Table 2 Définition de contrastes pour comparer les traitements à l intérieur d une lignée. 5
6 6 Interprétation des données d une régression non linéaire La régression non linéaire permet de modéliser un lien non linéaire entre deux ou plusieurs variables dont une est la variable réponse, en particulier, on l utilisera dans les modèles dit «dose-réponse». La principale difficulté ici est de trouver l équation décrivant le mieux la relation entre la variable à expliquer et les autres et de donner des valeurs de départ aux inconnues dans l équation. Une fois le modèle trouvé, on l ajuste sur les données récoltées. On obtient alors des coefficients, une marge d erreur sur ces coefficients et des p-valeurs qui permettent de savoir si les coefficients sont significativement différents de 0. Enfin, il ne faut pas oublier de vérifier quelques hypothèses sur les résidus pour s assurer que la régression non linéaire est valide d un point de vue statistique. Celles-ci sont : l indépendance des observations, la normalité des résidus si on a défini qu ils suivaient une normale avant l analyse (cela peut être une autre distribution) et l homoscédasticité des résidus. L essentiel de ce qui est repris dans cette partie vient du livre [6]. 6.1 Comparaison de plusieurs modèles sur un même jeu de données Si les modèles sont hiérarchisés l un dans l autre, i.e. un des deux modèles contient toutes les variables explicatives de l autre ainsi que d autres variables, alors on va faire une ANOVA afin de comparer les deux modèles ajustés. Il en résultera un test F et une p-valeur qui nous permettra de conclure si les deux modèles sont équivalents ou pas. Une autre méthode est d utiliser un critère comme l AIC ou le BIC. Le modèle qui aura la plus petite valeur sera le «meilleur» modèle pour ces données. L avantage de ces coefficients est qu ils permettent la comparaison de modèles non hiérarchisés mais on ne s appuie pas sur un test, autrement dit si on a deux AIC proches, il se peut très bien que la différence soit suffisamment petite pour que dans les faits il n y ait pas de différence statistiquement significative entre les deux. 6.2 Comparaison de courbes entre différents groupes On commence par ajuster un modèle global sans tenir compte du fait qu il y a plusieurs groupes. Puis, on fait un modèle par groupe. Enfin, on va comparer la somme des carrés moyens du modèle fait globalement avec la somme des sommes des carrés moyens trouvées pour chacun des modèles réalisé par groupe à l aide d un test F. On conclut alors sur une différence statistiquement significative en regardant la p-valeur. 6
7 6.3 Comparaison des valeurs d EC 50 ou des pentes en présence de plusieurs groupes Remarque : on va ici travailler avec EC 50 mais il est parfois préférable d utiliser son logarithme, c est particulièrement vrai si les valeurs de la variable explicative, par exemple la concentration, sont également espacées sur une échelle logarithmique. On veut savoir si EC 50 est différent dans au moins un groupe par rapport aux autres, alors la bonne pratique est d ajuster un modèle global en prenant toutes les observations en même temps, puis d ajuster un modèle par groupe en fixant EC 50 à la valeur trouvée par le modèle global. On modélise à nouveau la réponse pour chaque groupe mais cette fois-ci sans donner de valeur à EC 50. Puis, on poole les sommes des carrés moyens pour les modèles partageant la valeur d EC 50 ; on fait de même avec ceux ne partageant aucune valeur. Enfin, un test F va nous permettre de dire si les sommes des carrés moyens sont statistiquement significatives en tenant compte des différences entre degrés de liberté. Une autre méthode possible et bien souvent utilisée car plus simple à réaliser est de calculer les modèles en partageant tous les paramètres sauf celui de l EC. Enfin, la troisième méthode présenté ici est de comparer les estimations données par les deux modèles pour l EC 50 à l aide d un test t. Cette dernière méthode donne des résultats qui sont ne sont pas toujours fiables car les paramètres estimés par les modèles non linéaires, en particulier ceux concernant l erreur sur la moyenne, peuvent être mal estimés. Pour comparer les pentes au lieu des EC 50, on utilise la même démarche que celle expliquée dans le paragraphe ci-dessus. 7
8 Références [1] Douglas G. Altman : Practical Statistics for Medical Research (Statistics texts). Chapman & Hall, 1 édition, novembre [2] P. Dagnelie : Statistique théorique et appliquée : 2. Inférence statistique à 1 et 2 dimensions. Statistique théorique et appliquée. De Boeck, [3] P. Dagnelie : Statistique théorique et appliquée : Statistique descriptive et bases de l inférence statistique. Numéro vol. 1. De Boeck, [4] F. Faul, E. Erdfelder, A. Buchner et A. G Lang : Statistical power analyses using G*Power 3.1 : Tests for correlation and regression analyses. Behavior Research Methods, 41: , [5] John Ioannidis : Why Most Published Research Findings Are False. PLoS Med, 2(8):e124+, août [6] H. Motulsky et A. Christopoulos : Fitting models to biological data using linear and nonlinear regression : a practical guide to curve fitting. Oxford University Press,
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