Diagnostic moléculaire des disomies uniparentales. Dr François PETIT Laboratoire de génétique moléculaire Hôpital Antoine Béclère
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1 Diagnostic moléculaire des disomies uniparentales Dr François PETIT Laboratoire de génétique moléculaire Hôpital Antoine Béclère
2 Introduction
3 Disomie uniparentale (1) Situation normale : origine biparentale pour chaque paire chromosomique
4 Disomie uniparentale (1) Situation normale : origine biparentale pour chaque paire chromosomique Mais sur un caryotype, rien ne permet de distinguer objectivement l origine parentale d un chromosome
5 Disomie uniparentale (2)
6 Disomie uniparentale (2) 1) Pour la plupart des gènes : traduction efficace avec une ou deux copies Pour quelques gènes : une et une seule copie active Gènes soumis à l empreinte parentale
7 Disomie uniparentale (2) 1) Pour la plupart des gènes : traduction efficace avec une ou deux copies Pour quelques gènes : une et une seule copie active Gènes soumis à l empreinte parentale 2) Situation de transmission aberrante d une maladie génétique, après avoir vérifié la parentalité et l absence d anomalie chromosomique chez un parent
8 Disomie uniparentale (3) Dans ces deux situations : nécessité de connaitre l origine parentale des deux chromosomes d une même paire 3 configurations possibles :
9 Disomie uniparentale (4) Disomie biparentale (situation normale)
10 Disomie uniparentale (5) Hétérodisomie uniparentale (gènes soumis à empreinte +++)
11 Disomie uniparentale (6) Isodisomie uniparentale (transmission aberrante +++, gènes soumis à empreinte +)
12 Marqueurs de l origine parentale Nécessité de trouver un marqueur :
13 Marqueurs de l origine parentale Nécessité de trouver un marqueur : - fiable,
14 Marqueurs de l origine parentale Nécessité de trouver un marqueur : - fiable, - précis,
15 Marqueurs de l origine parentale Nécessité de trouver un marqueur : - fiable, - précis, - reproductible,
16 Marqueurs de l origine parentale Nécessité de trouver un marqueur : - fiable, - précis, - reproductible, - facile à analyser.
17 Marqueurs de l origine parentale Nécessité de trouver un marqueur : - fiable, - précis, - reproductible, - facile à analyser. Solution = microsatellites!
18 Microsatellites
19 Microsatellites (1) Définition : répétition en tandem d un motif nucléotidique court (le plus souvent 2 à 4 bases) dans le génome
20 Microsatellites (2) Avantages : structures polymorphes de petite taille, très nombreuses, réparties dans l ensemble du génome Dénomination standardisée : - D : DNA - numéro du chromosome, - S (unique segment), Z (repetitive DNA segment), F (family of homologous sequences) - numéro d incrémentation
21 Origine de la variabilité (1) Erreurs de recopiage des séquences répétées par la DNA polymerase lors des phases de mitose et de méiose : ajout ou suppression de répétition.
22 Origine de la variabilité (2) Si la variabilité est grande, la probabilité que les parents aient un profil différent entre eux est forte. De même, la probabilité que chez un même parent les allèles soient différents est également forte.
23 Modalités de choix (1) Pour rechercher l origine parentale d un chromosome, seuls quelques microsatellites répartis sur le chromosome vont être analysés (méthode par approximation). Ces microsatellites doivent être : - polymorphes, - amplifiables, - non liés à une pathologie.
24 Modalités de choix (2) Polymorphes Panel des allèles possibles pour un microsatellite dans le gène FGA
25 Modalités de choix (3) Amplifiables Les séquences encadrant le microsatellite doivent être uniques dans le génome (Blast) et non polymorphes (SNP). Conditions nécessaires pour permettre une amplification spécifique
26 Modalités de choix (4) Non liés à une pathologie Microsatellites liés à des pathologies : chorée de Huntington, X-fragile, HNPCC Que faire d un résultat pathologique?
27 Détermination allélique
28 Prélèvements Analyse réalisée à partir : - de cellules amniotiques cultivées, - ET d un échantillon sanguin de chaque parent prélevé sur EDTA (surtout pas d héparine!) Refaire les prélèvements des parents à chaque grossesse
29 Extraction des acides nucléiques Analyse à partir d ADN génomique Extraction : - des leucocytes circulants (post-natal +++), - des amniocytes cultivés (anté-natal +++), - des cellules trophoblastiques (en théorie mais problème des anomalies confinées au placenta). Analyse permettant de vérifier en parallèle l absence de contamination maternelle du prélèvement fœtal
30 Amplification (1) Amplification par PCR simplex ou multiplex Base de données UniSTS (NCBI) : permet d obtenir la position chromosomique et génétique, les tailles maxi et mini attendues, les fréquences des haplotypes et surtout les séquences des amorces
31 Amplification (2) Pour une mesure de longueur sur séquenceur, nécessité d avoir une des deux amorces marquées par un fluorochrome Si lecture en simplex : un seul fluorochrome suffit Si lecture en multiplex : plusieurs fluorochromes nécessaires pour distinguer les amplicons de tailles proches Kit PowerPlex 16HS, Promega
32 Amplification (3) PCR multiplex possible mais à manier avec précaution! Risques : - d amplification non spécifique, - d hybridation non spécifiques entre les amorces, - variabilité dans les Tm, - saturation plus rapide de la PCR.
33 Mesure des longueurs (1) Amorces non marquées ou radiomarquées Séparation électrophorétique sur gel de polyacrylamide et coloration des acides nucléiques Quasiment plus utilisées Technique longue et fastidieuse Analyse des marqueurs un par un
34 Mesure des longueurs (2) Amorces marquées avec un fluorochrome Mélange réactionnel contenant tous les amplicons marqués et un marqueur de taille Séparation en électrophorèse capillaire et analyse informatique des signaux fluorescents Séquenceur ABIPrism 3130 (Life Technologies) GeneMapper (Life Technologies)
35 Analyse des profils (1) Déterminer le caractère informatif ou non de l analyse Déterminer l origine parentale (attention : analyse non quantitative!)
36 Analyse des profils (1) Déterminer le caractère informatif ou non de l analyse Déterminer l origine parentale (attention : analyse non quantitative!) Informatif Disomie biparentale
37 Analyse des profils (1) Déterminer le caractère informatif ou non de l analyse Déterminer l origine parentale (attention : analyse non quantitative!) Informatif Disomie biparentale Informatif Hétérodisomie uniparentale maternelle
38 Analyse des profils (1) Déterminer le caractère informatif ou non de l analyse Déterminer l origine parentale (attention : analyse non quantitative!) Informatif Disomie biparentale Informatif Hétérodisomie uniparentale maternelle Informatif Isodisomie uniparentale paternelle
39 Analyse des profils (2) Le caractère informatif ou non est fonction des résultats et de ce que l on recherche en termes de risque
40 Analyse des profils (2) Le caractère informatif ou non est fonction des résultats et de ce que l on recherche en termes de risque Informatif ou non informatif?
41 Analyse des profils (2) Le caractère informatif ou non est fonction des résultats et de ce que l on recherche en termes de risque Informatif ou non informatif? Présence d une contribution potentiellement maternelle et d une contribution potentiellement paternelle
42 Analyse des profils (2) Le caractère informatif ou non est fonction des résultats et de ce que l on recherche en termes de risque Informatif ou non informatif? Présence d une contribution potentiellement maternelle et d une contribution potentiellement paternelle Informatif pour une absence de disomie uniparentale paternelle mais pas pour une disomie uniparentale maternelle!
43 Analyse des profils (3) Quelques exemples :
44 Analyse des profils (3) Quelques exemples : Informatif Disomie biparentale
45 Analyse des profils (3) Quelques exemples : Informatif Disomie biparentale Non informatif
46 Analyse des profils (3) Quelques exemples : Informatif Disomie biparentale Non informatif Informatif Hétéro ou isodisomie uniparentale
47 En pratique
48 Quels marqueurs analyser? (1) En cytogénétique Marqueurs portés par un chromosome «à risque» (porteur de gènes soumis à empreinte) dans un contexte de remaniement chromosomique parental chromosome 14 chromosome 15
49 Quels marqueurs analyser? (2) En génétique N importe quelle partie du génome pour rechercher une disomie uniparentale à l origine d une transmission aberrante d une maladie monogénique Possibilité d étudier des marqueurs sur tout un chromosome ou seulement sur une partie restreinte
50 Combien de marqueurs analyser? Plus on augmente le nombre de marqueurs étudiés, plus le résultat est précis (moins de marqueurs non informatifs) et fin (moins de risque de ne pas mettre en évidence un microremaniement chromosomique) En pratique : entre 5 et 10 marqueurs par chromosome pour une recherche cytogénétique Tenir compte du contexte familial : la consanguinité augmente le nombre de marqueurs non informatifs
51 Comment rendre le résultat? Indiquer le nom et/ou le nombre de marqueurs analysés Indiquer le nombre de marqueurs informatifs en fonction du contexte Donner la conclusion : - le risque de disomie uniparentale complète du chromosome [..] peut être écarté, - mise en évidence d une hétéro/iso disomie a priori complète du chromosome [..], - profil non interprétable.
52 Exemple
53 Dossier n 1 (1)
54 Dossier n 1 (1) DPI pour translocation Robertsonienne : - papa : 46,XY - maman : 45,XX,der(13;14)(q10;q10) DPN sur LA : 45,XX,der(13;14)(q10;q10)mat
55 Dossier n 1 (1) DPI pour translocation Robertsonienne : - papa : 46,XY - maman : 45,XX,der(13;14)(q10;q10) DPN sur LA : 45,XX,der(13;14)(q10;q10)mat Analyse de microsatellites sur le chromosome
56 Dossier n 1 (1) DPI pour translocation Robertsonienne : - papa : 46,XY - maman : 45,XX,der(13;14)(q10;q10) DPN sur LA : 45,XX,der(13;14)(q10;q10)mat Analyse de microsatellites sur le chromosome Quelle est l information recherchée?
57 Dossier n 1 (1) DPI pour translocation Robertsonienne : - papa : 46,XY - maman : 45,XX,der(13;14)(q10;q10) DPN sur LA : 45,XX,der(13;14)(q10;q10)mat Analyse de microsatellites sur le chromosome Quelle est l information recherchée? Hétérodisomie paternelle : non
58 Dossier n 1 (1) DPI pour translocation Robertsonienne : - papa : 46,XY - maman : 45,XX,der(13;14)(q10;q10) DPN sur LA : 45,XX,der(13;14)(q10;q10)mat Analyse de microsatellites sur le chromosome Quelle est l information recherchée? Hétérodisomie paternelle : non Isodisomie paternelle : non
59 Dossier n 1 (1) DPI pour translocation Robertsonienne : - papa : 46,XY - maman : 45,XX,der(13;14)(q10;q10) DPN sur LA : 45,XX,der(13;14)(q10;q10)mat Analyse de microsatellites sur le chromosome Quelle est l information recherchée? Hétérodisomie paternelle : non Isodisomie paternelle : non Hétérodisomie maternelle : oui
60 Dossier n 1 (1) DPI pour translocation Robertsonienne : - papa : 46,XY - maman : 45,XX,der(13;14)(q10;q10) DPN sur LA : 45,XX,der(13;14)(q10;q10)mat Analyse de microsatellites sur le chromosome Quelle est l information recherchée? Hétérodisomie paternelle : non Isodisomie paternelle : non Hétérodisomie maternelle : oui Isodisomie maternelle : non
61 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D14S D14S D14S D14S D14S D14S D14S
62 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D14S D14S D14S D14S D14S D14S D14S
63 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D14S NI D14S D14S D14S D14S D14S D14S
64 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D14S NI D14S I D14S D14S D14S D14S D14S
65 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D14S NI D14S I D14S NI D14S D14S D14S D14S
66 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D14S NI D14S I D14S NI D14S I D14S D14S D14S
67 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D14S NI D14S I D14S NI D14S I D14S I D14S D14S
68 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D14S NI D14S I D14S NI D14S I D14S I D14S I D14S
69 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D14S NI D14S I D14S NI D14S I D14S I D14S I D14S I
70 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D14S NI D14S I D14S NI D14S I D14S I D14S I D14S I Conclusion : le risque de disomie uniparentale complète du chromosome 14 peut être écarté pour cette grossesse
71 Dossier n 2 (1)
72 Dossier n 2 (1) DPI pour translocation Robertsonienne : - papa : 45,XY,der(15;22)(q10;q10) - maman : 46,XX DPN sur LA : 46,XX
73 Dossier n 2 (1) DPI pour translocation Robertsonienne : - papa : 45,XY,der(15;22)(q10;q10) - maman : 46,XX DPN sur LA : 46,XX Analyse de microsatellites sur le chromosome
74 Dossier n 2 (1) DPI pour translocation Robertsonienne : - papa : 45,XY,der(15;22)(q10;q10) - maman : 46,XX DPN sur LA : 46,XX Analyse de microsatellites sur le chromosome Quelle est l information recherchée?
75 Dossier n 2 (1) DPI pour translocation Robertsonienne : - papa : 45,XY,der(15;22)(q10;q10) - maman : 46,XX DPN sur LA : 46,XX Analyse de microsatellites sur le chromosome Quelle est l information recherchée? Hétérodisomie paternelle : non
76 Dossier n 2 (1) DPI pour translocation Robertsonienne : - papa : 45,XY,der(15;22)(q10;q10) - maman : 46,XX DPN sur LA : 46,XX Analyse de microsatellites sur le chromosome Quelle est l information recherchée? Hétérodisomie paternelle : non Isodisomie paternelle : oui mais peu probable
77 Dossier n 2 (1) DPI pour translocation Robertsonienne : - papa : 45,XY,der(15;22)(q10;q10) - maman : 46,XX DPN sur LA : 46,XX Analyse de microsatellites sur le chromosome Quelle est l information recherchée? Hétérodisomie paternelle : non Isodisomie paternelle : oui mais peu probable Hétérodisomie maternelle : oui mais peu probable
78 Dossier n 2 (1) DPI pour translocation Robertsonienne : - papa : 45,XY,der(15;22)(q10;q10) - maman : 46,XX DPN sur LA : 46,XX Analyse de microsatellites sur le chromosome Quelle est l information recherchée? Hétérodisomie paternelle : non Isodisomie paternelle : oui mais peu probable Hétérodisomie maternelle : oui mais peu probable Isodisomie maternelle : oui
79 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D15S D15S D15S D15S D15S D15S D15S D15S
80 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D15S D15S D15S D15S D15S D15S D15S D15S
81 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D15S NI D15S D15S D15S D15S D15S D15S D15S
82 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D15S NI D15S I D15S D15S D15S D15S D15S D15S
83 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D15S NI D15S I D15S I D15S D15S D15S D15S D15S
84 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D15S NI D15S I D15S I D15S NI D15S D15S D15S D15S
85 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D15S NI D15S I D15S I D15S NI D15S I D15S D15S D15S
86 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D15S NI D15S I D15S I D15S NI D15S I D15S NI D15S D15S
87 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D15S NI D15S I D15S I D15S NI D15S I D15S NI D15S I D15S
88 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D15S NI D15S I D15S I D15S NI D15S I D15S NI D15S I D15S I
89 Dossier n 1 (2) Marqueur papa maman enfant Contribution Informativité D15S NI D15S I D15S I D15S NI D15S I D15S NI D15S I D15S I Conclusion : le risque de disomie uniparentale complète du chromosome 15 peut être écarté pour cette grossesse
90
91 Transmission et formes particulières de la maladie de Crigler-Najjar Transmission de la maladie de Crigler-Najjar Maladie autosomique récessive Conseil génétique : - un enfant atteint : parents hétérozygotes, - parents hétérozygotes : risque de 25 % à chaque grossesse. Points importants pour ce type de maladies rares : - pouvoir étudier les parents, - pouvoir étudier un cas index, pour évaluer le plus précisément possible le risque de récidive et pouvoir proposer un diagnostic anténatal
92 Transmission et formes particulières de la maladie de Crigler-Najjar Importance de l étude des parents (Petit et al., 2005) Nouveau-né de parents non consanguins ayant présenté une hyperbilirubinémie non-conjuguée dans les premières heures de vie Promoteur normal Délétion hétérozygote dans l exon 1 Promoteur muté homozygote Pas d anomalie dans l exon 1 Promoteur normal Délétion homozygote dans l exon 1 Suspicion de disomie uniparentale paternelle du chromosome 2
93 Transmission et formes particulières de la maladie de Crigler-Najjar Importance de l étude des parents (Petit et al., 2005) Caryotype normal FISH : recherche d une duplication 2q homogène ou en mosaïque RP11-69j7 / 2q37.1 RP11-118M12 / 2q37.3 TelVysion 2q (Vysis ) Pas d anomalie chromosomique numérique ou de structure
94 Transmission et formes particulières de la maladie de Crigler-Najjar Importance de l étude des parents (Petit et al., 2005) Etude de 9 marqueurs répartis sur l ensemble du chromosome 2
95 Transmission et formes particulières de la maladie de Crigler-Najjar Importance de l étude des parents (Petit et al., 2005) Mise en évidence du premier cas d isodisomie uniparentale paternelle à l origine d une maladie de Crigler-Najjar Absence d anomalie liée à l empreinte parentale Conseil génétique rassurant pour une nouvelle grossesse : risque de récidive estimé très faible, risque d hétérozygotie composite de 50 %
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