1 INTRODUCTION 4 2 MANIPULATION DE L'ADN ENZYMES DE RESTRICTION LIGASE ELECTROPHORÈSE SUR GEL TRANSFORMATION 10

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1 BIOTECHNOLOGIES

2 1 INTRODUCTION 4 2 MANIPULATION DE L'ADN ENZYMES DE RESTRICTION LIGASE ELECTROPHORÈSE SUR GEL TRANSFORMATION 10 3 CLONAGE MOLÉCULAIRE SYSTÈMES HÔTE /VECTEUR PLASMIDES PHAGES BANQUES DE GÈNES = BANQUE GÉNOMIQUE BANQUES GÉNOMIQUES BANQUES D'ADNC RÉSUMÉ DES DIFFÉRENTES ÉTAPES GÉNIE GÉNÉTIQUE/CLONAGE ETC ÉTAPE 1 : SCISSION DE L'ADN ÉTAPE 2 : PRODUCTION DE L'ADN RECOMBINANT ÉTAPE 3 : CLONAGE ÉTAPE 4 : CRIBLAGE 22 4 ANALYSE DE L ADN CARTES DE RESTRICTION SOUTHERN BLOTTING IDENTIFICATION DE DIFFÉRENCES DANS L'ADN : ANALYSE PAR RFLP SÉQUENÇAGE DE L ADN SÉQUENÇAGE ENZYMATIQUE DE SANGER (1977) SÉQUENÇAGE AUTOMATIQUE NOUVELLES TECHNOLOGIES DE SÉQUENÇAGE PCR (RÉACTION EN CHAÎNE DE LA POLYMÉRASE, POLYMERASE CHAIN REACTION) TECHNIQUE DE LA PCR APPLICATIONS DE LA PCR PUCES À ADN 41 5 TECHNOLOGIES CELLULAIRES CULTURES DE CELLULES CULTURES DE TISSUS VÉGÉTAUX CULTURE DE TISSUS ANIMAUX CELLULES SOUCHES TYPES DE CELLULES SOUCHES CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES REPROGRAMMATION NUCLÉAIRE ET CLONAGE INVERSION DE LA DÉTERMINATION PREMIÈRES RECHERCHES CHEZ LES BATRACIENS PREMIÈRES RECHERCHES SUR LES MAMMIFÈRES RÉUSSITE D'UNE TRANSPLANTATION NUCLÉAIRE CHEZ LES MAMMIFÈRES PROBLÈMES INHÉRENTS AU CLONAGE REPRODUCTEUR FAIBLE TAUX DE RÉUSSITE ET MALADIES LIÉES À L'ÂGE ABSENCE D'EMPREINTE DES FACTEURS DÉFINIS SONT UTILISÉS POUR REPROGRAMMER LE NOYAU CSPI (= CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES INDUITES) 63 LCP OS 16/17 2

3 6 QUELQUES APPLICATIONS APPLICATIONS MÉDICALES PRODUCTION DE PROTÉINES HUMAINES PAR DES BACTÉRIES PRODUCTION DE VACCINS THÉRAPIE GÉNIQUE AUTRE PROCÉDÉ METTANT EN JEU DES GÈNES : L'ARN INTERFÉRENCE CRISPR CAS APPLICATIONS EN AGRICULTURE TRANSFORMATION DES PLANTES RÉSISTANCE AUX HERBICIDES RÉSISTANCE AUX INSECTES NUISIBLES RIZ DORÉ PRODUCTION DE MÉDICAMENTS DANS LES PLANTES PROBLÈMES POSÉS PAR LES PLANTES OGM MODIFICATION GÉNÉTIQUE DES ANIMAUX DOMESTIQUES 82 LCP OS 16/17 3

4 1 INTRODUCTION Au cours de ces dernières décennies, la mise au point de techniques nouvelles et performantes pour l'étude et la manipulation de l'adn a révolutionné la biologie. Les connaissances ont plus progressé pendant les 25 dernières années que pendant toute l'histoire de la biologie. La biotechnologie affecte aussi plus d'aspects de la vie de tous les jours que tout autre domaine de la biologie. De la nourriture se trouvant sur notre table à l'avenir de la médecine, la biotechnologie concerne notre vie. Biotechnologie : toute technique utilisant des êtres vivants (micro-organismes, animaux, végétaux), généralement après modification de leurs caractéristiques génétiques, pour la fabrication industrielle de composés biologiques ou chimiques (médicaments, matières premières industrielles) ou pour l'amélioration de la production agricole (plantes et animaux transgéniques ou O.G.M. [organismes génétiquement modifiés]). Au pluriel, industries employant ces techniques, notamment dans les domaines agricole et agroalimentaire, dans la chimie et dans l'industrie pharmaceutique. On distingue trois générations successives de techniques biologiques. La première, empirique, relève de l'utilisation de micro-organismes existant dans l'environnement naturel. Ainsi, bactéries, levures et champignons étaient utilisés pour la fabrication de boissons, d'aliments ou de textiles. La fermentation est un procédé employé depuis des millénaires pour la production de vin, de fromage ou de pain. La deuxième ère des biotechnologies a débuté avec la Première Guerre mondiale, la fabrication de munitions ayant considérablement accru les besoins en acétone. Pour la première fois, les scientifiques se sont sérieusement préoccupés d'améliorer les techniques de fermentations, en particulier certaines fermentations par des levures. À la suite de l'essor des industries pharmaceutiques, les procédés de fermentation ont rapidement bénéficié d'un regain d'intérêt. La production d'antibiotiques fondamentaux, comme la pénicilline, est alors devenue une des premières préoccupations de l'époque. Un nombre croissant de substances d'intérêt médical étaient ainsi produites en fermenteurs à partir de cultures de champignons et de bactéries en particulier. Les améliorations portaient sur la sélection de souches productrices, l'amélioration des milieux de culture et des rendements de fermentation. La troisième génération de biotechnologies a pris son essor dès 1970 et repose essentiellement sur le développement du génie génétique (techniques en rapport avec la biologie moléculaire). À ce moment, on comprenait parfaitement les mécanismes par lesquels un gène effectue la synthèse d'une enzyme ou de n'importe quelle protéine. Si l'on pouvait introduire, par exemple, le gène de l'hormone de croissance humaine dans une bactérie comme le colibacille et l'y faire s'exprimer, alors on obtiendrait facilement des grammes - ou plus - d'un matériel rare, qui, autrement, devait être isolé à partir d'hypophyses humaines (parfois d'ailleurs contaminées par des prions responsables de maladies neurologiques inguérissables). Cette possibilité technique a été offerte dès Depuis cette époque, un nombre croissant de gènes ont été introduits dans toutes sortes de cellules hôtes, transformées en usines à produire la protéine souhaitée. Ces hôtes peuvent être des bactéries, comme le colibacille, le BCG etc.; des champignons, comme les levures, les Aspergillus, etc.; ou des cellules d'organismes supérieurs, animales et végétales.

5 Outre la recombinaison d'adn, les biotechnologistes ont à leur disposition d'autres techniques de manipulation des gènes, notamment celle de la fusion cellulaire. Tel est le cas des anticorps monoclonaux, protéines synthétisées par un même clone de lymphocytes B (cellules circulantes du système immunitaire) et responsables de la reconnaissance et de l'exclusion d'un corps étranger. Des cellules de rate prélevées sur une souris préalablement immunisée sont mises à " fusionner " avec des cellules cancéreuses ; les membranes s'unissent et donnent ainsi naissance à des cellules hybrides, qui sont capables et de produire l'anticorps spécifique et de se reproduire indéfiniment. Le clone de " cellules chimères " est alors apte à une synthèse à grande échelle. La biotechnologie est l'application des principes de la biologie moléculaire à de nombreux aspect de la vie. La possibilité d'isoler des séquences d'adn spécifiques découle de l'étude et de l utilisation de petites molécules d'adn bactérien, comme les plasmides. Dans ce chapitre, nous allons explorer ces technologies et voir comment elles s'appliquent a des problèmes spécifiques d'importance pratique. LCP OS 16/17 5

6 2 MANIPULATION DE L'ADN Une des mutations les plus profondes de la biologie à la fin du XX e siècle a été la possibilité d'isoler directement et de manipuler le matériel génétique. Aujourd'hui, au vingt-et-unième siècle, nous nous intéressons déjà à des génomes entiers. Comment donc sommes-nous passés du clonage des gènes individuels à la détermination de la séquence du génome humain? Nous allons d'abord répondre à cette question en décrivant la technologie nécessaire au clonage des gènes et le mode d'emploi de cette technologie. Le clonage désigne principalement deux processus. C'est d'une part la multiplication naturelle ou artificielle à l'identique d'un être vivant, c'est-à-dire avec conservation exacte du même génome pour tous les descendants (les clones). C'est donc un synonyme de certaines formes de multiplication asexuée tel que le bouturage. C'est aussi la multiplication provoquée d'un fragment d'adn par l'intermédiaire d'un micro-organisme. Ainsi, en biologie, le mot clonage désigne plusieurs choses : d'une part, le fait de reproduire des organismes vivants pour obtenir des êtres génétiquement identiques ; ceci peut s'appliquer à de simples cellules (clonage cellulaire, par prélèvement d'une seule cellule, qui est mise en culture de manière individuelle) ou bien à des animaux donc y compris les êtres humains et des végétaux (clonage reproductif, bouturage). L'ensemble de ces cellules, ou individus, forme un seul et même clone (tant que le patrimoine génétique est identique) ; d'autre part, une technique de biologie moléculaire qui consiste à isoler un fragment d'adn et à le multiplier à l'identique en l'«insérant» dans une molécule d'adn «porteuse» appelée vecteur permettant son amplification. Cette technique de biologie moléculaire peut-être utilisée pour un clonage partiel, ne portant que sur un fragment de matériel génétique (ADN), mais aussi pour le clonage d'un gène entier permettant la production de la protéine recombinante correspondante. L'«insertion» est souvent réalisée à l'aide d'un vecteur, les plus communément utilisés étant les virus ou les plasmides (petites molécules d'adn cycliques). Au sens scientifique, le clonage est l'obtention d'un être vivant génétiquement identique à l'original qui a fourni son génome. 2.1 Enzymes de restriction La mise au point de la technologie de clonage et de manipulation des séquences d'adn a débuté en 1975 par la construction des premières molécules d'adn recombinant. À partir de ces premières tentatives s'est développée une technologie qui a bouleversé toute la biologie. Pour comprendre cette technologie, nous devons d'abord envisager les outils permettant d'agir directement sur l'adn. À partir de là, nous passerons à une expérience simple de génie génétique, puis nous verrons comment ces techniques s'appliquent à la médecine et à l'agriculture. La manipulation de l'adn a surtout besoin d'un jeu d'enzymes. La boîte à outils du biologiste moléculaire est pleine de ces enzymes. Elle est devenue extrêmement sophistiquée au cours des ans grâce à l'isolement d'un nombre croissant d'enzymes capables d'agir sur l'adn. Il faut noter que toutes ces enzymes existent déjà dans la nature et toutes nos manipulations ne font, jusqu'à un certain point, que reproduire ce que les cellules font naturellement. Les enzymes qui ont catalysé la révolution de la biologie moléculaire sont les endonucléases de restriction, qui coupent l'adn à des endroits spécifiques. Les nucléases sont les enzymes qui dégradent l'adn, et l'on en connaissait beaucoup avant l'isolement de la première enzyme de restriction. Mais les LCP OS 16/17 6

7 endonucléases de restriction sont différentes parce qu'elles sont capables de fragmenter l'adn à des endroits spécifiques. Ce type d'activité, depuis longtemps recherché par les biologistes moléculaires, est finalement apparue à la suite d'une recherche fondamentale destinée à expliquer pourquoi les bactériophages ne peuvent infecter que certaines cellules. On a constaté que le fondement moléculaire de cette «restriction d'hôte» était une enzyme capable de couper l'adn au niveau de séquences spécifiques. Les cellules hôtes peuvent éviter cette scission en modifiant leur propre ADN par méthylation à ces mêmes endroits. Depuis la première découverte de ces endonucléases de restriction, on en a isolé des centaines d'autres qui reconnaissent et coupent des sites de restriction différents. La faculté de couper l'adn à des sites spécifiques est importante pour deux raisons : elle permet d'abord de réaliser un type de carte physique qui était jusqu'alors impossible et, en second lieu, elle permet la création de molécules recombinantes. On peut construire des cartes physiques basées sur la position des sites de coupure par les enzymes de restriction. Ces cartes de restriction sont essentielles pour identifier et manipuler les molécules d'adn. La possibilité de construire des molécules recombinantes est encore plus importante, parce que beaucoup d'étapes, dans le clonage et la manipulation de l'adn, exigent la réunion de molécules d'origines différentes (figure 2.1). Comment les enzymes de restriction peuvent-elles créer des molécules recombinantes? La réponse se trouve dans la nature des enzymes elles-mêmes. Il existe deux types d'enzymes de restriction, les types I et II. Les enzymes de type I font des coupures simples dans les deux brins d'adn et ne sont pas souvent utilisées pour le clonage et la manipulation de gènes. Ce sont les enzymes de type II qui permettent d'obtenir des molécules recombinantes. Ces enzymes reconnaissent une séquence d'adn spécifique, longue de 4 à 12 bases, et coupent l'adn au niveau d'une base particulière de cette séquence. Les sites du type II sont caractérisés par une symétrie visible dans la séquence elle-même : la séquence se lit de la même manière de 5' à 3' dans un sens et dans l'autre sens sur l'autre brin. Avec ce type de séquence, la coupure de l'adn au niveau d'une même base sur les deux brins peut produire des coupures décalées et des «bouts collants» Cette courte séquence non appariée sera la même pour tout ADN coupé par cette enzyme. Ces bouts collants permettent donc d'unir facilement des ADN provenant de sources différentes. LCP OS 16/17 7

8 FIGURE 2.1 : Beaucoup d endonucléases de restriction produisent des fragments d ADN avec des «bouts collants». L endonucléase de restriction EcoRI coupe toujours la séquence GAATTC entre G et A. La même séquence se retrouvant sur les deux brins, tous deux sont coupés. Cependant, les deux séquences produites sont orientées différemment dans les deux brins. En conséquence, les queues monocaténaires sont complémentaires, elles sont «collantes». 2.2 Ligase Les deux extrémités d'une molécule d'adn coupée par une enzyme de restriction de type II possèdent des séquences complémentaires; elles peuvent donc s'apparier et former un LCP OS 16/17 8

9 duplex. Mais, pour obtenir une molécule d'adn stable à partir de deux fragments, nous avons besoin d'une enzyme pour unir les molécules. L'ADN ligase catalyse la formation d une liaison phosphodiester entre le phosphate et les groupements hydroxyle voisins des nucléotides de l'adn. Dans la boîte à outils du biologiste, l'action de la ligase est nécessaire pour créer des molécules recombinantes stables à partir des fragments produits par les enzymes de restriction. 2.3 Electrophorèse sur gel Les fragments produits par les enzymes de restriction ne seraient pas très utiles si nous ne pouvions pas les séparer pour les analyser. La technique de séparation la plus commune est l électrophorèse sur gel (figure 2.2). Cette technique tire profit de la charge négative des molécules d ADN en appliquant un champ électrique pour séparer ces molécules en fonction de leur taille. Composé d agarose ou de polyacrylamide, et finement étalé sur un support, le gel constitue une matrice tridimensionnelle qui sépare les molécules en fonction de leur taille. Ce gel est plongé dans une solution tampon contenant des ions capables de porter le courant si il est soumis à un champ électrique. Les charges électriques négatives élevées des groupements phosphate de la colonne vertébrale de l ADN entraînent sa migration vers le pôle positif. Le gel fonctionne comme un filtre et sépare les molécules d ADN selon leur taille : elles migrent d autant plus lentement dans le gel qu elles sont plus longues. Avec le temps, les petites molécules migrent plus loin que les longues. On peut mettre l ADN en évidence dans le gel par un colorant fluorescent qui s y unit. L électrophorèse est un des outils les plus importants de la boîte à outils de la biologie moléculaire moderne, qui va de l étude des empreintes d ADN à son séquençage. LCP OS 16/17 9

10 FIGURE 2.2 : Électrophorèse sur gel. a. On utilise trois endonucléases de restriction pour découper l'adn en fragments spécifiques qui dépendent de la séquence de reconnaissance de chaque enzyme. b. On charge les fragments sur un gel (agarose ou polyacrylamide) et l'on applique un courant électrique. Les fragments d'adn migrent dans le gel, les plus grands se déplaçant plus lentement. c. Les fragments sont ainsi répartis en fonction de leur taille, les petits migrant plus loin que les grands. d. On peut mettre les fragments en évidence en les colorant par le bromure d'éthidium. Quand le gel est exposé à la lumière UV, l'adn uni au colorant est fluorescent et apparaît sous la forme de bandes roses dans le gel. Dans cette photographie, on a extrait du gel une bande d'adn pour une analyse plus précise : on peut la voir briller dans le tube tenu par le technicien. 2.4 Transformation La construction de molécules recombinantes est la première étape de l ingénierie génétique. Il faut aussi pouvoir réintroduire ces molécules dans les cellules. Ce processus s appelle transformation. La transformation naturelle n existe pas dans la bactérie E. coli utilisée couramment dans les laboratoires de biologie moléculaire, mais on a mis au point des techniques de transformation artificielles afin d y introduire l ADN étranger. Des changements de température ou de charge électrique perméabilisent temporairement la membrane d E. coli à l égard de l ADN étranger. On peut ainsi introduire des molécules recombinantes dans une cellule qui synthétisera de nombreuses copies des molécules construites. En général, l introduction de l ADN étranger dans une cellule est considérée comme une transformation. Ce mécanisme est important chez E. coli pour le clonage moléculaire et la propagation de l ADN cloné. Les chercheurs doivent aussi pouvoir réintroduire l ADN dans les cellules dont il provient. Si une cellule transformée est en outre capable de donner un organisme entier, ce sera un organisme transgénique. LCP OS 16/17 10

11 Les enzymes de restriction font partie des stratégies des cellules bactériennes pour combattre l infection virale. Les endonucléases de type II coupent l ADN à des endroits spécifiques. On peut se servir de l ADN ligase pour réunir les fragments après l application des enzymes de restriction. L électrophorèse sur gel utilise une charge électrique pour séparer les fragments d ADN en fonction de leur taille. On peut introduire de l ADN étranger dans E. coli par transformation artificielle et sa propagation peut ensuite cloner l ADN. LCP OS 16/17 11

12 3 CLONAGE MOLÉCULAIRE Le terme clone désigne une copie génétiquement identique. La propagation des plantes par bouture est une technique ancienne de clonage appliquée en agriculture et en horticulture. On parlera du clonage d organismes entiers plus loin dans ce dossier. Pour le moment, nous explorons le concept de clonage moléculaire. Le clonage moléculaire (ou clonage de gène) implique l isolement d une séquence spécifique d ADN, codant généralement une protéine particulière Systèmes hôte /vecteur Bien que nous puissions synthétiser de courtes séquences d ADN in vitro, il est important de pouvoir multiplier des molécules d ADN recombinant dans une cellule afin de cloner de longues séquences inconnues. Avec sa boîte à outils renfermant des enzymes, le biologiste utilise donc les cellules comme usines pour obtenir de grandes quantités d'adn recombinant. Pour multiplier l'adn dans une cellule hôte, il faut un vecteur (quelque chose pour transporter la molécule d'adn recombinant) capable de pénétrer dans l'hôte et s'y répliquer. Ces systèmes vecteur / hôte sont essentiels en biologie moléculaire. L'hôte le plus souple et le plus commun pour les clonages de routine est la bactérie E. coli. Ce n'est évidemment pas le seul hôte. Actuellement, on clone couramment l'adn eucaryote en utilisant comme systèmes hôtes des cellules de mammifères en culture, des levures et des cellules d'insectes. Chaque type de système hôte / vecteur permet des utilisations particulières de l'adn cloné. Les deux vecteurs les plus fréquents sont les plasmides et les phages. Les plasmides sont de petits ADN extrachromosomiques dont la cellule peut se passer. Les phages sont des virus qui infectent les cellules bactériennes. L'essentiel, pour un vecteur, est qu'il ne soit pas indispensable à la cellule, mais qu'il puisse être directement sélectionné par insertion d'un marqueur, comme la résistance à un antibiotique Plasmides Les vecteurs plasmidiques (petits chromosomes circulaires) sont habituellement utilisés pour cloner des morceaux d'adn relativement courts, jusqu'à 10 kilobases (kb) environ. La kilobase (kb) est une unité de mesure en biologie moléculaire représentant une longueur de paires de bases d'adn bicaténaire ou de bases d'arn. Ce vecteur doit avoir : une origine de réplication permettant sa réplication indépendante du chromosome chez E. coli un marqueur de sélection, généralement un gène de résistance à un antibiotique. Ce marqueur permet de reconnaître facilement la présence du

13 plasmide par sélection ; les cellules possédant le marqueur survivront après avoir été étalées sur un milieu nutritif contenant l'antibiotique, alors que les cellules sans plasmide ne survivront pas (elles sont tuées par l'antibiotique). un ou plusieurs sites de restriction particuliers où il est possible de placer l ADN étranger. Avec l'aide des techniques décrites à la figure 2.1, un fragment d'adn est inséré dans une région appelée site de clonage multiple (SCM). Cette région renferme plusieurs sites de restriction particuliers : lorsque le plasmide est coupé par une enzyme correspondante, il donne un plasmide linéaire. L ADN d'intérêt peut alors être soudé à ce site, après quoi l'adn du plasmide est introduit dans les cellules par transformation. Il faut ensuite confirmer la présence de l'adn inséré. Cette région du vecteur(= SCM) est souvent manipulée par addition d'un autre gène qui est inactivé quand l'adn étranger viendra s'y mettre. On parle d'inactivaton par insertion, parce qu'il est interrompu par l'adn inséré. Les vecteurs les plus récents utilisent le gène de la β-galactosidase, enzyme qui coupe un galactoside (sucre) comme le lactose. Une couleur bleue apparaît quand l'enzyme scinde un substrat artificiel (=X gal). Dans ces plasmides, l'insertion de l'adn étranger interrompt le gène de la β-galactosidase et empêche la synthèse d'une enzyme fonctionnelle. Quand les cellules sont étalées après transformation sur un milieu contenant à la fois l'antibiotique (= sélection des cellules qui ont fait la transformation, qui ont inséré le bon plasmide) et X gal, elles restent blanches si elles contiennent l'adn inséré (= ADN inséré a inactivé gène), alors que les cellules qui en sont dépourvues sont bleues (= ADN pas inséré où l'on voulait). FIGURE 3.1 : Clonage moléculaire avec vecteur. Les plasmides sont coupés au sein du gène de la β-galactosidase (LacZ) et l'on ajoute l'adn étranger et la Iigase. L'ADN étranger inséré dans lacz interrompt la séquence codante et inactive le gène. L'étalement des cellules sur un milieu contenant l'antibiotique ampicilline sélectionne les cellules renfermant le bon plasmide. Le milieu contient aussi X-gal : si lacz est intact (au-dessus), l'enzyme exprimée coupe X-gal et donne des colonies bleues. Si lacz est inactivé (en bas), X-gal n'est pas coupé et les colonies restent blanches. La taille des molécules susceptibles d être clonées dans des vecteurs plasmidiques a limité l analyse des génomes à grande échelle. Pour trouver une solution, les généticiens ont construit des chromosomes artificiels de levures (YAC, taille de LCP OS 16/17 13

14 l insert compris entre 0,2 et 2,0 Mb) et de bactéries (BAC, taille de l insert jusqu à 300 kb). On a aussi progressé dans la création de chromosomes artificiels de mammifères Phages Les phages utilisés comme vecteurs sont plus grands que les plasmides et peuvent accepter des inserts atteignant 40 kb. La plupart des phages vecteurs dérivent du virus bien connu lambda. En dépit de leur utilité pour le clonage de longs fragments, les vecteurs lambda ont deux exigences qui n'existent pas avec les plasmides : ils ont d'abord besoin de cellules vivantes pour leur réplication et il est donc nécessaire d'infecter des cellules pour obtenir des phages lambda. En second lieu, leur génome est linéaire et, au lieu d'ouvrir un anneau, il faut enlever la partie médiane du génome et la remplacer par l'adn à insérer. LCP OS 16/17 14

15 Cela signifie qu'après la ligation de l'adn inséré aux deux «bras» du phage, l'adn doit être emballé in vitro dans une tête de phage, puis utilisé pour infecter E. coli. LCP OS 16/17 15

16 3.2 Banques de gènes = banque génomique Collection de fragments d ADN codant et non codant issus du génome complet d un organisme et clonés dans des vecteurs tels que des phages, des plasmides ou des chromosomes artificiels. Pour introduire un gène particulier ou une séquence particulière d'adn dans un vecteur, il faut d'abord disposer d'une source d'adn contenant la séquence. Cette source est habituellement une collection de fragments représentant tout l'adn d'un organisme. Il s'agit d'une banque (ou bibliothèque) d'adn. Une banque d'adn est une collection d'adn d'origine spécifique sous une forme susceptible d'être multipliée chez un hôte. Dans le cas d'un plasmide, ce serait une collection de toutes les cellules hébergeant des plasmides porteurs d'inserts d'adn différents représentant tout le génome. Dans le cas d'un phage, ce serait une collection de phages transportant chacun un insert différent et représentant l'ensemble du génome. On peut retrouver une séquence d'intérêt dans cette collection aléatoire Banques génomiques Le type de banque d'adn le plus simple est une banque (bibliothèque) génomique, où l'ensemble du génome est représenté dans un vecteur. Ce génome entier a été découpé au hasard par une enzyme de restriction agissant à haute fréquence. Ces fragments sont ensuite insérés dans un vecteur et introduits dans l'hôte. Les banques génomiques sont généralement constituées dans des chromosomes bactériens artificiels (BAC) ou dans des phages lambda à cause de la grande taille des inserts. On peut créer différents types de banques en fonction des sources d ADN utilisées. Chaque clone ne contient qu un seul ADN, et leur ensemble constitue la banque. Il faut se rendre compte que, contrairement à une bibliothèque pleine de livres, organisés et catalogués, une banque d ADN est une collection aléatoire de fragments d ADN qui se chevauchent. LCP OS 16/17 16

17 3.2.2 Banques d'adnc Outre les banques génomiques, les chercheurs souhaitent souvent limiter une expérience à tous les gènes exprimés. En raison de la structure des gènes eucaryotes, l ARNm peut être beaucoup plus court que le gène lui-même à cause de la présence des introns. Après la transcription par l ARN polymérase II, le transcrit primaire est épissé en ARNm. C est pourquoi les banques génomiques sont importantes pour comprendre la structure du gène, mais peu utiles quand on souhaite l expression du gène dans une bactérie, dont les gènes sont sans introns et qui ne possède pas de mécanisme d épissage. Une banque ne contenant que les séquences exprimées comporte une quantité d ADN beaucoup moindre que le génome entier. L ARNm isolé est à l origine d une banque d ADNc représentant les gènes donnés à un stade donné du développement. On peut obtenir cette banque de séquences exprimées grâce à une autre enzyme : la transcriptase inverse. On a isolé cette enzyme d'un type de virus, les rétrovirus. Le cycle de développement d'un rétrovirus implique la construction d une copie d'adn à partir de l'arn de son génome. On peut tirer profit de l'activité de l'enzyme du rétrovirus pour fabriquer copies d'adn à partir de l'arnm. Ces copies de l'arnm sont appelées de l ADN complémentaires (ADNc) (figure 3.3). On obtient une banque d'adnc en isolant d'abord l'arnm des gènes qui s'expriment, puis en synthétisant l'adnc avec l'aide de la transcriptase inverse. L'ADNc est ensuite utilisé pour créer une banque, généralement dans le phage lambda. Ces banques d'adnc sont extrêmement utiles et sont souvent constituées des gènes qui s'expriment dans des tissus ou des cellules spécifiques. Alors que toutes les banques génomiques d un individu sont LCP OS 16/17 17

18 identiques, les banques d ADNc des mêmes cellules à des stades différents du développement ou dans des tissus différents sont toutes distinctes (qui fait quoi quand). FIGURE 3.3 : Production d'adnc. On isole un transcrit mature d'arn du cytoplasme d'une cellule. On utilise une enzyme, la transcriptase inverse pour fabriquer un brin d'adn complémentaire de l'arnm mature. Cet ADN sert de modèle pour l'adn polymérase, enzyme qui assemble en face de lui un brin complémentaire d'adn et donne l'adnc, ADN bicaténaire représentant l'arnm sans introns. LCP OS 16/17 18

19 Le clonage moléculaire est l isolement et l amplification d une séquence d ADN. La séquence d intérêt peut être introduite dans un vecteur. Les vecteurs les plus communs sont les plasmides et les phages. Le vecteur introduit la séquence dans une cellule qui se multiplie et copie son propre ADN en même que celui du vecteur. Les banques d'adn sont des mélanges complexes d'adn, par exemple de l'ensemble d'un génôme, stockés dans un système vecteur-hôte. LCP OS 16/17 19

20 3.3 Résumé des différentes étapes génie génétique/clonage etc. Rappel : Pourquoi le clonage? Permet de conserver une séquence d'adn donnée. Permet de la multiplier pour en accroître la quantité. Permet de la modifier pour y introduire des mutations, déletions. Permet de la réintroduire dans des cellules. scission de l'adn, production d'adn recombinant, clonage et criblage Étape 1 : scission de l'adn On utilise une endonucléase de restriction pour couper l'adn d origine. La séquence reconnue par l'endonucléase pouvant se retrouver plusieurs fois au sein de l'adn de la source, la scission donnera un grand nombre de fragments différents. On obtiendra un autre lot de fragments en utilisant des endonucléases qui reconnaissent des séquences différentes. Il est possible de séparer les fragments des uns des autres en fonction de leur taille par une électrophorèse sur gel, technique illustrée à la figure Étape 2 : production de l'adn recombinant Les fragments d'adn sont insérés dans des plasmides ou des vecteurs viraux qui ont été coupés par la même endonucléase de restriction que l'adn d'origine Étape 3 : clonage Les plasmides ou les virus sont des vecteurs utilisés pour introduire les fragments d'adn dans des cellules, généralement, mais pas toujours, des bactéries (figure 3.4). En se reproduisant, les cellules forment un clone dont toutes les cellules contiennent le vecteur porteur du fragment. Tous les clones sont conservés séparément et ils constituent ensemble une banque de l'adn d'origine, comme on l'a décrit précédemment. LCP OS 16/17 20

21 FIGURE 3.4 : Étapes d'une expérience de génie génétique. À l'étape 1, l'adn contenant le gène d'intérêt (dans ce cas, provenant d'une cellule animale) et l ADN d'un plasmide sont coupés par la même endonucléase de R restriction. Les gènes amp et lacz se trouvent dans le plasmide et servent à cribler un clone (étape 4). À l'étape 2, les deux types d'adn sont mélangés et s'apparient par leurs bouts collants. À l'étape 3, l'adn recombinant est introduit dans une cellule bactérienne qui se reproduit et donne des clones. À l'étape 4, les clones bactériens seront criblés en fonction du gène d'intérêt. LCP OS 16/17 21

22 3.3.4 Étape 4 : criblage Les clones contenant un fragment d'adn d'intérêt spécifique, souvent un fragment porteur d'un gène particulier, sont identifiés dans le répertoire de tous les clones (banque clonale). Voyons cette étape plus en détail, parce que c'est généralement la plus délicate de toute expérience de génie génétique. A. Criblage préliminaire des clones Les chercheurs essayent d abord d'éliminer de la banque tous les clones qui ne contiennent pas le vecteur, ainsi que les clones dont le vecteur ne contient pas l ADN d origine. On peut éliminer les premiers en utilisant un vecteur qui possède un gène conférant la résistance à un antibiotique spécifique, comme la tétracycline, la pénicilline ou l'ampicilline. À la figure 3.5a, le gène amp R est incorporé au plasmide et confère la résistance à l'ampicilline. Si les clones sont exposés à un milieu contenant cet antibiotique, seuls ceux qui possèdent le vecteur seront résistants à l'antibiotique et capables de se développer. C est un exemple de sélection génétique de cellules contenant des vecteurs. Il est toujours souhaitable de programmer des expériences susceptibles de fournir au moins un cycle de sélection. Il est possible d'éliminer les clones contenant un plasmide dépourvu d'insert si le vecteur contient, outre des gènes de résistance aux antibiotiques, le gène lacz, nécessaire à la production de la β-galactosidase, enzyme capable de métaboliser le sucre X-gal. Le métabolisme de X-gal donne un produit de réaction bleu, en sorte que toutes les cellules dont les vecteurs qui contiennent une forme fonctionnelle de ce gène deviennent bleues en présence de X-gal (figure 3.5b). Cependant, si nous utilisons une endonucléase de restriction dont la séquence de reconnaissance se trouve au sein même du gène lacz, celui-ci sera interrompu pendant la production des recombinants et la cellule sera incapable de métaboliser X-gal. Les cellules qui portent des vecteurs contenant un fragment de l'adn d origine devraient donc rester incolore en présence de X-gal. C est un exemple de criblage génétique. Toutes les cellules survivent avec ou sans insert (soit elles sont blanches soit bleues) : ce n'est donc pas une sélection. Les criblages basés sur la présence ou l'absence d'un phénotype particulier (la couleur bleue de X-gal dans ce cas) sont fréquents. Toute cellule capable de se développer sur un milieu contenant l'antibiotique, mais ne devenant pas bleue sur le milieu avec X-gal doit avoir incorporé un vecteur contenant un fragment de l'adn d'origine. Dans le criblage des clones, l'étape suivante est l'identification des cellules possédant un fragment particulier de cet ADN. LCP OS 16/17 22

23 FIGURE 3.5 : Étape 4.1 : Identification des clones recombinants. Les bactéries sont transformées par des plasmides recombinants porteurs du gène de résistance à l ampicilline (amp R ). Une sélection est ainsi possible sur un milieu contenant de l'ampicilline. Le plasmide possède également le gène lacz qui code la β-galactosidase, une enzyme intervenant dans le métabolisme d'un sucre, le lactose. Le substrat artificiel X-gal peut être décomposé par l'enzyme et donne une coloration bleue. a. Sélection d'amp R : seules les bactéries transformées et possédant un plasmide seront capables de croître sur l'ampicilline. b. Criblage pour l activité de β-galactosidase : le plasmide a été conçu de manière à ce que l'adn inséré interrompe le gène lacz pour inactiver la β-galactosidase. Après étalement sur un milieu contenant X-gal, les bactéries hébergeant les plasmides dépourvus d'insert seront bleues, alors que celles qui possèdent des inserts ne seront pas colorées (elles seront blanches). LCP OS 16/17 23

24 B. Identification du gène d'intérêt (= hybridation) Une banque clonale peut renfermer de quelques dizaines à de nombreux milliers de fragments individuels de l'adn d'origine; isoler un clone particulier de la collection aléatoire que représente une banque ADN est comme trouver une aiguille dans une botte de foin. Pour cela, il faut connaître un le gène d'intérêt. Par exemple, parmi les premiers gènes isolés, beaucoup avaient des expressions importantes dans un type particulier de cellule, comme les gènes de globine codant l'hémoglobine. Beaucoup de ces fragments seront identiques et, pour réunir une banque complète de l'ensemble du génome d'origine, plusieurs centaines de milliers de clones seront nécessaires. Une banque complète de drosophile, par exemple, compte plus de clones différents. Une banque humaine complète formée de fragments longs de 20 kilobases demanderait près d'un million de clones. La recherche d'un clone correspondant à un gène particulier dans une banque aussi vaste exige de l'ingéniosité, mais de nombreuses techniques différentes se sont avérées efficaces. Le technique la plus générale pour rechercher un gène particulier dans les banques de clones est l'hybridation (figure 3.6). Dans cette technique, les gènes clonés forment des paires de bases avec les séquences complémentaires d'un autre acide nucléique. L'acide nucléique complémentaire est une sonde destinée à vérifier la présence du gène d'intérêt. Il faut qu'une partie au moins de la séquence nucléotidique du gène d'intérêt soit connue pour pouvoir construire la sonde. Pour cette méthode de criblage, les colonies bactériennes contenant un gène inséré sont cultivées sur agar. Certaines cellules sont transférées sur un filtre que l'on applique sur les colonies pour obtenir une réplique de la plaque. Le filtre est ensuite traité par une solution qui dénature l'adn bactérien et contient une sonde marquée par radioactivité. La sonde s'hybride aux séquences monocaténaires complémentaires de l'adn bactérien. Quand le filtre est placé sur un film photographique, les plages radioactives vont impressionner le film (autoradiographie). Seules les colonies contenant le gène d'intérêt s'hybrident avec la sonde et émettent de la radioactivité dans le film. L'image enregistrée par le film est ensuite comparée à la plaque originelle et il est possible d'identifier les colonies contenant le gène. LCP OS 16/17 24

25 FIGURE 3.6 : Étape 4.2 : identification du gène d'intérêt par hybridation. 1. Dans cette culture bactérienne, chaque colonie représente des millions de clones dérivés d'une seule cellule. Pour vérifier si un certain gène se trouve dans un clone particulier, il est nécessaire d'identifier les colonies dont les cellules contiennent un ADN qui s'hybride avec une sonde contenant des séquences d'adn complémentaires du gène. 2. Après l'application d'un papier filtre sur la plaque d'origine, des cellules des différentes colonies adhèrent au filtre. 3. Le filtre est ensuite rincé par une solution qui dénature l'adn et contient la sonde marquée par radioactivité. 4. Seules les colonies contenant l'adn qui s'hybride à la sonde, et contient donc le gène d'intérêt, marqueront le film d'autoradiographie. 5. Le film est ensuite comparé à la plaque d'origine pour identifier la colonie contenant le gène. Sélection pour voir si plasmide a été intégré Criblage pour voir si le gène intégré = gène intérêt Le génie génétique implique généralement quatre étapes : scission de l'adn source, fabrication de recombinants, clonage des recombinants et recherche du gène désiré par criblage des copies clonées. On peut effectuer le criblage en rendant les clones désirés résistants à des antibiotiques et faisant en sorte qu'ils soient identifiables grâce à d'autres propriétés. LCP OS 16/17 25

26 4 ANALYSE DE L ADN Le clonage moléculaire permet d obtenir un ADN particulier destiné à d autres manipulations et analyses. L ADN peut être manipulé de façons extrêmement nombreuses. Nous nous contenterons de mettre l accent sur quelques méthodes importantes d analyses et d applications des clones moléculaires. 4.1 Cartes de restriction Les premières cartes physiques étaient des cartes de restriction indiquant la localisation et l ordre des sites coupés par les enzymes de restrictions disponibles. A l origine, on obtenait ces cartes en coupant l ADN par différentes enzymes de restriction, en séparant les fragments par électrophorèse sur gel et en analysant les spectres obtenus. Cette méthode est encore appliquée, mais beaucoup de cartes de restriction sont aujourd hui produites par une recherche informatique de séquences qui sont connues comme des sites scindés par les enzymes de restriction. 4.2 Southern blotting Quand on a cloné un gène, on peut l'utiliser comme sonde pour identifier le même gène ou un gène semblable dans un autre échantillon (figure 4.1). Dans cette technique, appelée Southern blot, l'adn de l'échantillon est coupé par une endonucléase de restriction et les fragments sont séparés par électrophorèse sur gel. L'hélice bicaténaire des différents fragments est ensuite dénaturée en brins simples par alcalinisation du gel et celui-ci est «épongé» à l'aide d'une feuille de nitrocellulose, des brins d'adn se fixant ainsi à la feuille. Une sonde formée de l'adn monocaténaire purifié correspondant à un gène spécifique (ou de l'arnm transcrit par ce gène) est ensuite étalée sur la feuille. Tout fragment possédant une séquence nucléotidique complémentaire de celle de la sonde s'hybridera (par appariement des bases) avec cette sonde. Si la sonde a été marquée au 32 P, elle sera radioactive et la feuille montrera une bande de radioactivité à l'endroit où la sonde s'est hybridée au fragment complémentaire.

27 FIGURE 4.1 : La méthode Southern blot. Edwin M. Southern a mis au point cette méthode en 1975 pour mettre en évidence les fragments d'adn d'intérêt dans un mélange complexe contenant de nombreux autres fragments de même taille. Dans les étapes 1-3, l'adn est séparé sur un gel, puis transféré («blotted») sur un support solide, par exemple du papier de nitrocellulose ou une membrane de nylon. On peut retrouver les séquences d'intérêt avec une sonde marquée par radioactivité. Cette sonde (généralement longue de plusieurs centaines de nucléotides) d'adn monocaténaire (ou un ARNm complémentaire du gène d'intérêt) est incubée avec le filtre portant les fragments d'adn. Tous les fragments d'adn contenant des séquences nucléotidiques complémentaires de la sonde formeront des hybrides avec la sonde. Un petit morceau de la sonde et de la séquence complémentaire seulement sont représentés dans la partie 4. La taille des fragments diffère et les plus petits vont plus loin dans le gel. Les fragments d'intérêt sont ensuite identifiés par un film photographique (partie 5). Pour l'identification, on peut remplacer le film par des écrans phosphorescents, appareils LCP OS 16/17 27

28 contrôlés par ordinateur possédant des senseurs électroniques pour la lumière ou les émissions radioactives Identification de différences dans l'adn : analyse par RFLP Souvent, le chercheur ne recherche pas un gène particulier, mais il souhaite plutôt identifier un individu particulier en utilisant un gène spécifique comme marqueur. Pour cela, un moyen efficace consiste à analyser les polymorphismes de longueur des fragments de restriction (RFLP, pour restriction fragment length polymorphisms) (figure 4.2). Les mutations ponctuelles, les répétitions de séquences et les transposons survenant au sein des sites de reconnaissance des enzymes de restriction ou entre ces sites modifieront la longueur des fragments d'adn (fragments de restriction) produits par les endonucléases. Il est rare que la répartition des sites de restriction et les distances entre ces sites soient exactement les mêmes dans l'adn provenant d'individus différents : on dit que la population est polymorphe au point de vue de la répartition des fragments de restriction. En découpant un échantillon d'adn par une endonucléase de restriction particulière, en séparant les fragments en fonction de leur longueur par électrophorèse sur gel et avec l'aide ensuite d'une sonde radioactive pour identifier les fragments sur le gel, on peut trouver une répartition de bandes souvent unique pour chaque région de l'adn analysé. Ce sont les empreintes génétiques déjà signalées pour leur utilisation dans les analyses en médecine légale à l'occasion de recherches criminelles. Les RFLP sont également utiles comme marqueurs pour identifier des groupes particuliers de personnes à risque pour certaines maladies génétiques. Comparée aux techniques basées sur la PCR, cette technique exige une grande quantité d'adn, mais elle est très fiable. L'utilisation de la PCR a rendu plus facile les comparaisons avec des échantillons plus réduits. FIGURE 4.2 : Analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP). a. Trois échantillons d'adn diffèrent par leurs sites de restriction en raison de la substitution d une seule paire de bases dans un cas et de la duplication d'une séquence dans l'autre cas. b. Quand les échantillons sont coupés par une endonucléase de restriction, on obtient des fragments de nombres et de tailles différents. c. L'électrophorèse sur gel sépare les fragments et donne différentes répartitions des bandes. LCP OS 16/17 28

29 Comme on l'a déjà signalé, il est rare que deux individus donnent des RFLP identiques; leurs empreintes génétiques peuvent donc servir lors d'investigations criminelles. LCP OS 16/17 29

30 La figure 4.3 montre les empreintes présentées par un procureur en 1987 lors d'un procès pour viol. Ce sont des autoradiographies, des bandes sur un film pour rayons X qui ressemblent aux traits du code barre universel. Chaque bande représente la position d'un fragment de restriction produit par des techniques semblables à celles qui sont décrites aux figures 2.2 et 4.2. La piste comportant de nombreuses bandes correspond à un témoin standard. On a utilisé deux sondes pour identifier les fragments de restriction. Un frottis vaginal a été réalisé chez la victime quelques heures après son agression ; on a ainsi récolté du sperme dont l'adn a été analysé après traitement par les endonucléases de restriction. Comparons les spectres de restriction du sperme à celui du suspect, Andrews. On peut constater que les deux spectres du suspect correspondent à celui du violeur (et ne ressemblent pas du tout à ceux de la victime). Il est clair que le sperme trouvé chez la victime du viol et l'échantillon de sang du suspect proviennent de la même personne. Le suspect était Tommie Lee Andrews et le jury prononça un verdict de culpabilité le 6 novembre Andrews fut la première personne, aux États-Unis, à être convaincue d'un crime sur la base d'une preuve génétique. Depuis le verdict d'andrews, les empreintes génétiques ont servi de preuve dans plus de 2000 procès (figure 4.4). Alors que certaines sondes mettent en évidence des profils communs à de nombreux individus, d'autres sont très rares. En utilisant plusieurs sondes, il est possible d'établir clairement une identité ou de la rejeter. LCP OS 16/17 30

31 Les empreintes génétiques révolutionnent aujourd'hui la médecine légale exactement comme les empreintes digitales l'avaient fait au début des années Un cheveu, une minuscule tache de sang ou une goutte de sperme peuvent être des sources d'adn suffisantes pour condamner ou innocenter un suspect. Comme l'a dit la personne qui a analysé l'adn d'andrews : «C'est comme laisser votre nom, votre adresse et votre numéro de sécurité sociale sur le lieu du crime. C'est aussi précis.» Bien sûr, les analyses en laboratoire des échantillons d'adn doivent être réalisées correctement, des techniques biaisées pourraient conduire à une condamnation injustifiée. Des règles sont mises au point au niveau national chaque fois que des exemples de techniques de laboratoire discutables sont diffusés dans le public. FIGURE 4.3 : Deux profils d'adn qui ont conduit à la condamnation pour viol de Tommie Lee Andrews en Les deux sondes d'adn représentées ont servi à caractériser l'adn isolé de la victime, du sperme trouvé sur la victime et du suspect. Les canaux noirs sont des contrôles multibandes. Dans ces deux profils, il existe une correspondance évidente nette entre l'adn du suspect et celui du sperme du violeur. LCP OS 16/17 31

32 4.3 Séquençage de l ADN L'analyse la plus précise est la détermination de la séquence même des bases de la molécule d'adn. La mise au point des techniques de séquençage est allée de pair avec les progrès de la biologie moléculaire. La base du séquençage de l'adn est la production d'un lot de fragments qui se chevauchent, débutant et finissant tous par une base spécifique. Après la séparation de ces fragments par une électrophorèse sur gel à haute résolution, on obtient une «échelle» de fragments (figure 4.5) qui se terminent tous par une base spécifique. En partant du fragment le plus court, on peut lire la séquence en remontant l'échelle. FIGURE 4.5 : Échelle de fragments utilisés dans le séquençage de l ADN. La photo montre l autoradiographie des fragments obtenus par les réactions de séquençage de l ADN. Ces fragments sont obtenus soit par des réactions organiques coupant l ADN au niveau de bases spécifiques, soit par des réactions enzymatiques qui se terminent par des bases spécifiques. Le gel peut séparer des fragments différant d une seule base. Le problème est le suivant : comment obtenir des lots de fragments se terminant par des bases spécifiques? Au début du séquençage, on a utilisé deux méthodes, une chimique et une enzymatique. La méthode chimique implique des réactions organiques spécifiques qui provoquent des cassures dans les chaînes d'adn au niveau de bases spécifiques. La méthode enzymatique se servait d'une ADN polymérase pour synthétiser des chaînes et impliquait aussi dans la réaction des nucléotides modifiés pouvant être incorporés, mais pas prolongés, des terminateurs de chaîne. La méthode enzymatique s'est montrée plus souple et plus facile à adapter à des applications différentes. LCP OS 16/17 32

33 4.3.1 Séquençage enzymatique de Sanger (1977) La méthode de séquençage enzymatique a été mise au point par Frederick Sanger, qui fut aussi le premier à déchiffrer la séquence complète d'une protéine. Cette méthode utilise des didésoxynucléotides comme terminateurs de chaîne dans les réactions de synthèse de l'adn. Dans un didésoxynucléotide OH est remplacé par H en positions 2' et 3'. Tous les nucléotides de l'adn sont dépourvus de -OH au carbone 2' du sucre, mais les didésoxynucléotides ne possèdent pas de -OH 3' auquel l'enzyme peut ajouter d'autres nucléotides. La chaîne ne va donc pas plus loin. Pour obtenir un lot de fragments se terminant par une base spécifique, le chercheur doit effectuer quatre réactions distinctes, chacune avec un didésoxynucléotide. Tous les fragments obtenus dans la réaction A incorporent la didésoxyadénine et doivent se terminer par A, et il en va de même pour les trois autres réactions avec des terminateurs différents. Après la séparation de ces fragments par électrophorèse sur gel à haute définition, les quatre réactions passent dans des pistes différentes, afin d'obtenir un spectre de fragments chevauchants en partant du plus petit à des fragments plus longs d'une seule base (figure 4.7a). LCP OS 16/17 33

34 Notez que, s'agissant d'une réaction en chaîne de la polymérase, une amorce est nécessaire pour enclencher la synthèse. Les vecteurs utilisés pour le séquençage de l'adn possèdent des régions connues proches du site d'insertion de l'adn. On synthétise ensuite de courts ADN complémentaires de ces régions pouvant servir d'amorces. Le but est double : servir d'amorces et s'assurer que les quelques premières bases séquencées sont connues parce qu'elles le sont dans le vecteur luimême. Le chercheur peut ainsi savoir où débute la séquence d'intérêt. Quand on a obtenu la séquence, il est possible de créer de nouvelles amorces près de l'extrémité de la séquence connue et de synthétiser l'adn qui servira d'amorce pour allonger la région séquencée dans la série suivante de réactions Séquençage automatique La technique de séquençage enzymatique est très efficace, mais elle est aussi fastidieuse et prend beaucoup de temps. Elle suppose une série de manipulations enzymatiques, du temps pour l'électrophorèse et pour l'exposition du gel au film. En fin de course, un chercheur qualifié peut lire valablement quelque 300 bases de la séquence. Avec la mise au point de techniques automatisées, le séquençage est devenu beaucoup plus pratique et demande moins de main d'œuvre. Les appareils de séquençage automatique remplacent le marquage radioactif par des colorants fluorescents et séparent les produits des réactions de séquençage grâce à des gels en minces tubes capillaires au lieu des grands gels en plaques. Les tubes passent devant un laser qui excite les colorants et les rend fluorescents. Avec un colorant différent pour chaque base, un photodétecteur peut identifier chaque base par sa couleur. Les résultats sont assemblés par un ordinateur qui donne une image formée des différents pics colorés; ces pics sont transformés en une séquence brute (figure 4.7b). Cette séquence découle directement de l'électrophorèse, ce qui économise le temps nécessaire à l'exposition du gel au film et à la lecture manuelle des séquences. L'utilisation de colorants différents réduit aussi les manipulations et accélère l'obtention des séquences. Avec l'augmentation du nombre d'échantillons par cycle et de la longueur des séquences pouvant être lues, ainsi qu'avec l'accélération des manipulations, la quantité de données obtenues est limitée surtout par le nombre d'appareils pouvant fonctionner simultanément. LCP OS 16/17 34

35 FIGURE 4.7 : Séquençage manuel et enzymatique automatique de l'adn. La séquence à étudier est représentée au-dessus sous la forme d'un brin modèle et d une amorce destinés à l'adn polymérase. a. Dans la méthode manuelle, quatre réactions sont effectuées, une pour chaque nucléotide. Par exemple, le tube A contient datp, dgtp, dctp, dttp et ddatp. On obtient ainsi des fragments se terminant par A à cause du terminateur didésoxy. Les fragments produits dans les différentes réactions sont représentés, avec les résultats de l'électrophorèse sur gel. b. Dans le séquençage automatique, chaque ddntp est marqué par un colorant fluorescent différent, ce qui permet d'effectuer la réaction dans un même tube. Les fragments provenant des réactions sont représentés. Si l'électrophorèse est réalisée dans un tube capillaire, un laser situé au fond du tube excite les colorants et chacun d eux émet une couleur différente détectée par un photodétecteur Nouvelles technologies de séquençage Pendant plus de 30 ans, la base chimique du séquençage de l'adn n'a pas évolué. L'automatisation a accéléré le séquençage et permis le traitement de longs génomes eucaryotes. Ces quelques dernières années, cependant, des méthodes de séquençage fondamentalement neuves ont fortement accéléré l'obtention des séquences. Nous allons voir une de ces nouvelles méthodes, capable de donner une séquence de 20 milliards de paires de bases en un seul cycle (figure 4.8). L'ADN est découpé en petits morceaux de quelques centaines de paires de bases par un vaporisateur, appareil transformant le liquide en très fines gouttelettes. Les deux extrémités sont liées à des adaptateurs complémentaires d'amorces spécifiques. Ces fragments sont injectés dans une cuve à flux continu (cell flow), semblable à une lame de microscopie avec sept rainures contenant un substrat solide avec les amorces complémentaires des extrémités liées aux fragments d'adn. Des millions de fragments d'adn sont placés dans ces rainures, puis amplifiés pour former des paquets de fragments. L'amplification fonctionne comme la réplication de l'adn, sauf que l'on ajoute une polymérase qui reconnaît l'amorce et entame la copie. Les fragments sont de nouveau dénaturés en molécules monocaténaires. On peut ainsi les séquencer. Comme pour le séquençage de Sanger, les désoxyribonucléotides triphosphates (dntp) portent une marque fluorescente, mais on peut l'enlever. On utilise quatre couleurs pour distinguer les différentes bases. La marque fluorescente est attachée de façon réversible en position 2' au désoxyribose et elle bloque le OH 3' de telle sorte qu'une seule LCP OS 16/17 35

36 liaison phosphodiester se forme, mais on peut éliminer le groupement de blocage après chaque cycle d'extension de l'adn et les brins d'adn continuent à s'allonger. Des caméras très puissantes avec dispositif à transfert de charge (CCD), d'abord utilisées par les astronomes, enregistrent le spectre de fluorescence dans le flux de cellules après chaque cycle d'élongation. Cette technologie repose sur le fait que le matériel solide maintient les fragments d'adn en place pendant leur synthèse et les images CCD peuvent ainsi être recueillies et donner la séquence de chaque paquet de fragments. La masse de données obtenues à chaque cycle d'addition de paires de bases est énorme ; les facteurs limitants sont l'espace de stockage digital et la puissance des ordinateurs capables d'interpréter ces données. Figure 4.8 : Nouvelle méthode de séquençage. L'ADN est découpé en petits fragments qui seront séquencés. a. Des adaptateurs sont ajoutés au bout de l'adn. b. L'ADN est dénaturé et les adaptateurs s'unissent aux amorces dans la cuve à flux continu. c-f. Les fragments individuels sont amplifiés avec l'aide des dntp et de la polymérase. g. On ajoute des dntp marqués par un colorant séparable qui bloque la formation de nouvelles liaisons phosphodiester, et l'on ajoute la première base marquée par fluorescence. h. Une caméra CCD enregistre la répartition des fluorescences avant l'élimination du colorant fluorescent, et la base suivante est ajoutée aux différentes séquences d'adn. LCP OS 16/17 36

37 4.4 PCR (réaction en chaîne de la polymérase, polymerase chain reaction) La révolution suivante en biologie moléculaire a été la mise au point de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR, pour polymerase chain reaction). Kary Mullis a mis au point la PCR en 1983, alors qu'il était chimiste à la Cetus Corporation ; en 1993, sa découverte lui a valu le prix Nobel de chimie. Le principe de la réaction en chaîne de la polymérase est simple : on utilise deux amorces complémentaires des deux brins d'une séquence d'adn, orientées l'une vers l'autre. Quand l'adn polymérase fonctionne sur ces amorces et sur la séquence d'intérêt, les amorces synthétisent des brins complémentaires, chacun contenant l'autre amorce. Quand on répète ce mécanisme, on obtient une grande quantité de séquences correspondant à l'adn situé entre les deux amorces (figure 4.9) Technique de la PCR Ce concept est devenu une technique efficace grâce à deux améliorations : D'abord, il faut dénaturer l'adn après chaque cycle de synthèse, ce qui est facile en élevant la température ; cependant, on détruit ainsi la plus grande partie de la polymérase. La solution a été l'isolement d'une ADN polymérase d'une bactérie thermophile, Thermus aquaticus. Cette enzyme, la Taq polymérase, permet de chauffer de façon répétée le mélange de réactifs sans détruire l'enzyme. La seconde innovation a été la mise au point d'appareils pourvus de systèmes de chauffage pouvant alterner rapidement des températures très différentes et contrôlées très précisément. Chaque cycle de PCR comprend donc trois étapes : dénaturation (haute température, environ secondes à 95 o C) renaturation des amorces (basse température, environ secondes à o C) synthèse (température intermédiaire, environ 1 minute à 72 o C) Après ces étapes, les deux exemplaires sont devenus quatre. Il n'est pas nécessaire d'ajouter plus de polymérase, parce que le chauffage n'altère pas l'enzyme. Chaque cycle, qui demande seulement 1-2 minutes, multiplie par deux le nombre de LCP OS 16/17 37

38 molécules d'adn. Après 20 cycles, un seul fragment produit plus d'un million (2 20 ) de copies! La PCR permet ainsi l'amplification d'un seul fragment d'adn provenant d'une faible quantité d'un mélange complexe. Ce résultat est semblable à celui du clonage moléculaire mais, dans le cas de la PCR, l'adn ne peut être réintroduit directement dans une cellule. On peut analyser le produit de la PCR par électrophorèse, le cloner dans un vecteur pour d'autres manipulations ou le séquencer directement. Il y a des limites à la taille du fragment pouvant être synthétisé de cette façon, mais la technique a été adaptée à une masse d'applications. FIGURE 4.9 : La réaction en chaîne de la polymérase. La réaction en chaîne de la polymérase (PCR) permet d'amplifier une séquence particulière dans un mélange complexe pour l'analyser. La technique implique l'emploi de courtes amorces pour la synthèse de l'adn, amorces bordant la région à amplifier, ainsi que (1) des cycles successifs de dénaturation, (2) l'appariement (renaturation) des amorces et (3) la synthèse de l'adn. L'enzyme utilisée pour la synthèse est une polymérase thermostable capable de résister aux températures élevées nécessaires à la dénaturation des amorces d'adn. La réaction est effectuée dans une machine dont le cycle thermique peut être programmé pour modifier la température rapidement et avec précision. La température d'appariement dépend de la longueur des amorces et de leur composition en bases. On a simplifié les détails du LCP OS 16/17 38

39 système de synthèse pour illustrer le processus l'amplification. Les brins qui viennent d'être synthétisés sont bleu clair et les amorces sont en vert Applications de la PCR Aujourd'hui entièrement automatisée, la PCR a révolutionné de nombreux domaines de la science et de la médecine parce qu'elle permet l'étude de minuscules échantillons d'adn. Dans les recherches criminelles, on peut aujourd'hui préparer des empreintes génétiques à partir des cellules d'une toute petite tache de sang séché ou des tissus de la racine d'un cheveu. En médecine, les médecins peuvent déceler des déficiences génétiques dans des embryons très jeunes en récoltant quelques cellules et en amplifiant leur ADN. En raison de sa sensibilité, de sa rapidité et de sa facilité d'utilisation, les techniciens utilisent maintenant couramment ses applications. On peut aussi utiliser la PCR en paléogénétique pour analyser l'adn mitochondrial de l'espèce humaine primitive, Homo neanderthalensis. Cette application ouvre une première perspective sur une espèce disparue apparentée. L'amplification d'adn ancien a été controversée parce qu'il est difficile d'éviter une contamination par de l'adn moderne. Elle reste cependant un domaine actif de recherche génétique. LCP OS 16/17 39

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41 4.5 Puces à ADN LCP OS 16/17 41

42 5 TECHNOLOGIES CELLULAIRES Dans ce chapitre seront abordés les techniques de cultures cellulaires, de clonage ainsi que différents aspects concernant les très prometteuses cellules souches. 5.1 Cultures de cellules Cultures de tissus végétaux C'est une culture in vitro de cellules non spécialisées (non différenciées) ou spécialisées. On parle de culture de tissus lorsque les cellules restent liées entre elles après les multiples divisions. La culture in vitro (figure 5.1) permet d'obtenir une quantité importante d'individus tous génétiquement identiques à l'aide, en théorie, d'une seule cellule de végétal. A partir de n'importe quelle cellule (cellules de racine, de feuilles, cellule de bourgeon, etc.) on peut obtenir un végétal complet et identique à la plante-mère. FIGURE 5.1 : Culture de cellules et de tissus végétaux in vitro. Des cellules isolées ou des tissus sont prélevés dans une feuille ou un autre organe et maintenus en vie sur un substrat nutritif. On stérilise la surface du tissu prélevé, et l'on dépose ce fragment de tissu vivant sur un milieu nutritif solidifié avec de l'agaragar. Les tissus dépourvus de chloroplastes sont hétérotrophes; par conséquent le substrat doit contenir, en plus des sels minéraux indispensables, une certaine quantité de sucre sous forme de saccharose ou de glucose. Souvent il faut ajouter des hormones végétales, des phytohormones comme les auxines et les cytokinines,

43 qui favorisent la croissance et la division cellulaire. La masse cellulaire forme à la surface un cal, constitué d'un amas de cellules indifférenciées. Si l'on attend trop longtemps, ce cal présentera des processus de différenciation, qui débuteront avec la formation d'un méristème. Mais on peut prélever sur le cal des cellules encore non différenciées pour les cultiver séparément. La dissociation des cellules calleuses est réalisée par suspension dans un milieu liquide. On récupère les cellules isolées par filtration à travers une gaze. Des cals formés à partir d'une seule cellule peuvent être cultivés à l'obscurité ou à la lumière. En faisant varier les concentrations et les combinaisons des phytohormones, on peut induire la formation d'organes. Quand les plantules présentent des radicelles et de petites feuilles, elles sont prêtes à être transplantées. Elles consistent en copies conformes de la plante originale; elles forment un clone. Cette technique de clonage est remarquable pour ses rendements, c'est-à-dire pour produire des plantes homogènes en grand nombre. Un simple bourgeon de rosier permet de produire jusqu'à nouveaux rosiers génétiquement identiques. Les végétaux possèdent des cellules qui peuvent donc redonner un individu complet, et ce peu importe le type de cellules prélevées sur un végétal ce qui signifie que toutes les cellules d'un végétal sont capables d'exprimer toutes les informations du code génétique contenu dans l'adn de la cellule. C'est ce qu'on appelle la totipotence de la cellule. C'est un phénomène qui n'est en aucun cas valable chez les animaux; en effet lorsque la cellule-œuf se développe, seules les toutes premières cellules sont totipotentes mais bien vite ce potentiel de la cellule diminue pour engendrer les cellules spécialisées au bout de quelques stades et pourtant toutes les cellules possèdent tout l'ensemble du code génétique. Le clonage est une stratégie de multiplication d'abord naturelle. La reproduction du fraisier, des pommes de terre, des jonquilles (par bulbes), n'est rien d'autre que du clonage. LCP OS 16/17 43

44 On peut aussi travailler avec des protoplastes, c'est-à-dire des cellules végétales dépourvues de leur paroi. On obtient ces protoplastes par adjonction de pectinase, enzyme qui dissout la lamelle mitoyenne, et de cellulase, enzyme qui dégrade la paroi cellulosique. La concentration osmotique du milieu doit être isotonique avec le cytoplasme des protoplastes afin d'éviter l'éclatement des cellules. Les protoplastes, de forme sphérique, peuvent ensuite être utilisés expérimentalement comme s'il s'agissait de cellules animales. On peut tester une infection virale, on peut leur intégrer de l'adn étranger par génie génétique, et l'on peut aussi réaliser des fusions LCP OS 16/17 44

45 de protoplastes. Par la fusion de protoplastes on obtient des plantes hybrides, comparables aux chimères animales. De telles hybridations somatiques ont été réalisées entre espèces différentes (l intérieur d un genre) et incompatibles sur le plan de la reproduction, par exemple Petunia, Daucus et Solanum. Le but de telles expériences est de créer des plantes à très grande productivité, combinant plusieurs qualités : résistances supplémentaires, et à l'avenir fixation d'azote atmosphérique. La première démonstration de fusion entre des protoplastes différents remonte aux travaux de Melchers et al., en Il recherchait des tomates cultivables à basse température et réalisa, à cette fin, des hybrides entre la tomate et la pomme de terre par fusion de protoplastes : la pomate. Cette nouvelle espèce est malheureusement un exemple théorique, car elle est stérile. La pomme de terre cultivée, Solanum tuberosum, est une espèce chez laquelle l'introduction de caractères par fusion de protoplastes est facilement réalisable. Ainsi, on a pu introduire des gènes de résistance à certains virus, au mildiou et à la pourriture bactérienne due à Erwinia, à partir des espèces sauvages d'amérique du Sud, notamment Solanum brevidens. De nouvelles lignées mâles stériles de colza résistantes à l'atrazine ont pu également être obtenues par cette technique. On a pu obtenir par hybridation somatique certaines sortes de tabac. Au cours de la reproduction sexuée, les informations génétiques contenues dans le cytoplasme sont transmises par la mère. En revanche, la fusion de protoplastes conduit à une hybridation des noyaux, mais aussi à celle des cytoplasmes. Ceci est très intéressant pour le transfert et l'amélioration de caractères à hérédité cytoplasmique, comme la stérilité mâle. On parle d'hybridation somatique (car issue de cellules non reproductrices de la plante, soma = corps). Les protoplastes sont des cellules chargées négativement et la fusion spontanée n'est que très rarement observée. La fusion est obtenue sous l'action de divers agents chimiques (on peut neutraliser la charge électrique des protoplastes par des cations Ca 2+ et un ph élevé, ensuite, on utilise le polyéthylène glycol (PEG) qui provoque une forte agrégation des cellules et déstabilise la membrane plasmique. Après retour aux conditions initiales, les protoplastes fusionnent ou d'un choc électrique (cette technique, l'électrofusion, plus récente, utilise des champs électriques intenses et de courte durée, qui en déstabilisant les membranes entraînent la fusion des protoplastes. Ce système semble être plus efficace) Culture de tissus animaux Il est possible de réaliser des cultures de cellules et de tissus prélevés sur des animaux ou des hommes. On isole les cellules par des moyens mécaniques ou chimiques, puis on les place dans un milieu nutritif contenant du sérum animal. Le sérum contient certains polypeptides jouant le rôle de facteurs de croissance. Ils permettent l'adhérence des cellules sur un support solide. En effet, la plupart des LCP OS 16/17 45

46 cellules animales en culture ne peuvent croître et se diviser que si elles sont placées sur une surface solide, telle que le verre ou le plastique du fond des boîtes de culture. La culture de cellules provenant directement d'un tissu ou d'un organe est appelée culture primaire. Quand la culture atteint une certaine densité, on peut en prélever une partie et l'incuber, on obtient ainsi une culture secondaire. De cette façon, on peut multiplier le nombre de cultures. La plupart du temps, les cellules conservent les propriétés qu'elles présentaient sur l'organisme. Ainsi, des cellules embryonnaires de muscle squelettique fusionnent en grandes fibres musculaires capables de se contracter; les cellules épithéliales s'assemblent en surfaces cellulaires comme dans un organisme intact; les cellules nerveuses forment même des fibres excitables. Souvent, après avoir servi dans plusieurs cultures secondaires successives, les cellules présentent des signes de vieillissement similaires à ceux rencontrés dans l'organisme. Elles meurent après un certain nombre de divisions cellulaires qui leur est spécifique. Elles reflètent probablement la limite de durée de vie de l'organisme. Pourtant dans certaines cultures, on trouve des cellules qui survivent durant des années et se reproduisent même à l'infini : elles forment des lignées cellulaires permanentes, à disposition des chercheurs. On peut les conserver dans de l'azote liquide à -196 C, sans avoir besoin de les cultiver. Il existe aujourd'hui des banques de cellules qui envoient du matériel dans le monde entier, afin que les chercheurs travaillent sur les mêmes lignées. LCP OS 16/17 46

47 La fusion cellulaire (entre une cellule cancéreuse et un lymphocyte) a par exemple permis, entre autre, la production d anticorps monoclonaux (figure 5.3). Cette hybridation (qui donne naissance à des hybridomes) est très courante dans la recherche et permet d obtenir des lignées rendues comme «immortelles» grâce à la fusion avec des cellules cancéreuses. FIGURE 5.3 : Production d anticorps monoclonaux Les anticorps monoclonaux sont des anticorps issus d un seul clone, donc très spécifique. Désormais, on n obtient plus des populations d anticorps différents (en prenant le sérum d un animal immunisé par exemple) dirigés contre une multitude d éléments caractéristiques de la protéine (de l antigène). On peut, par cette LCP OS 16/17 47

48 technique isoler des anticorps dirigés contre un seul épitope et pas un autre ; comme si, au lieu de reconnaître l ensemble d un visage, un système de détection reconnaissait le coin d un œil, une ride de la joue ou la forme d une oreille. Les applications des anticorps monoclonaux sont nombreuses. Dans le domaine du diagnostic, ils permettent, par exemple, de détecter la présence de virus (hépatite B, herpès ou SIDA) des bactéries ou de cellules tumorales. Couplés à des toxines puissantes, ils permettent de détruire sélectivement des cellules malades. On peut les cultiver pour occuper la place d un agent infectieux, sur son récepteur cellulaire, et lui fermer ainsi la porte d entrée des cellules. Séparation et isolation de protéine sur des colonnes de chromatographie. On estime qu un tiers des entreprises de biotechnologie dans le monde commercialise des produits à base d anticorps monoclonaux. LCP OS 16/17 48

49 Cellules souches Au cours du développement, et même dans l'animal adulte, il est important de mettre en réserve des cellules capables de se diviser, mais qui ne sont pas déterminées dans un sens précis. Ces cellules capables de poursuivre leurs divisions, mais aussi de donner naissance à des cellules différenciées, sont les cellules souches. On peut définir ces cellules en fonction de leur niveau de détermination Types de cellules souches D'un côté, nous avons une cellule totipotente, si elle peut donner naissance à n'importe quel tissu de l'organisme. Chez les mammifères, les seules cellules capables de donner l'embryon et les membranes qui l'entourent sont le zygote et les premiers blastomères dérivés des quelques premières divisions cellulaires. Les LCP OS 16/17 49

50 cellules capables de donner toutes les cellules de l'organisme sont pluripotentes. Une cellule souche capable de donner naissance à un nombre limité de types cellulaires, comme celles qui sont à l'origine des différents types de cellules sanguines, sont multipotentes. Enfin, les cellules souches unipotentes ne donnent qu'un seul type cellulaire, comme celles qui sont à l'origine des spermatozoïdes chez les mâles (figure 5.4 et tableau 5.1). FIGURE 5.4 : Les différents types de cellules souches LCP OS 16/17 50

51 LCP OS 16/17 51

52 TABLEAU 5.1 Une multitude de cellules souches Les cellules souches ont de nombreuses origines. Pour cette raison, elles ont des propriétés biologiques différentes et, par conséquent, des potentiels thérapeutiques divers. Elles sont plus ou moins faciles à obtenir et certaines soulèvent des difficultés éthiques. TYPE DE SOURCE PROPRIETES POTENTIEL THERAPEUTIQUE CELLULES Cellules souches pluripotentes Embryons CELLULES Capables de donner naissance Essais cliniques en cours : surnuméraires issus SOUCHES à tous les types de cellules Traumatisme de la moelle d une fécondation in EMBRYONNAIRES Capables de proliférer de façon épinière, maladies rétiniennes vitro illimitée CELLULES SOUCHES FŒTALES CELLULES DE SANG DE CORDON CELLULES SOUCHES ADULTES CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES INDUITES Fœtus issus d une interruption volontaire de grossesse Sang de cordons ombilicaux prélevés à la naissance Cellules extraites de tissus adultes, par exemple la moelle osseuse, la peau, le tissu adipeux, les intestins Cellules issues de la reprogrammation de cellules adultes différenciées Cellules multipotentes déjà partiellement différenciées Ne donnent que certains types de cellules Les cellules multipotentes du sang de cordon sont surtout des cellules souches hématopoïétiques et des cellules souches mésenchymateuses Cellules multipotentes déjà partiellement différenciées Cellules souches pluripotentes Capables de proliférer de façon illimitée Cellules souches neurales : essais cliniques en cours dans certaines maladies neurologiques Utilisées couramment pour traiter des maladies du sang Essais cliniques avec les cellules souches mésenchymateuses Cellules souches mésenchymateuses : essais cliniques en cours pour tester l effet immunomédulateur et antiinflammatoire Cellules souches hématopoïétiques : indications hématologiques, immunologiques Cellules souches épidermiques : brûlures graves Pas d utilisations thérapeutiques à ce jour Cellules souches embryonnaires Les cellules souches embryonnaires (cellules SE) représentent une forme de cellules souches obtenues en laboratoire. Ces cellules proviennent d'embryons de mammifères qui ont formé une sphère de cellules (blastocyste) par segmentation. Le blastocyste consiste en une sphère externe de cellules, le trophectoderme, qui deviendra le placenta, et d'une masse interne de cellules qui formeront l'embryon. On peut isoler des cellules souches de cette masse cellulaire interne et les mettre en culture (figure 5.5). Chez les souris, on a bien étudié ces cellules et montré qu'elles sont capables de donner tous les types de cellules des tissus de l'adulte. Elles ne peuvent cependant pas donner naissance aux tissus extraembryonnaires qui se forment au cours du développement : elles ne sont donc pas totipotentes, mais pluripotentes. Après qu'on les eut trouvées chez les souris, la découverte des cellules SE humaines n'était qu'une question de temps. En 1998, les premières cellules souches humaines (cellules SEh) furent isolées et mises en culture. Il y a des différences entre les cellules souches de l'homme et des souris, mais elles sont essentiellement semblables. Ces cellules souches embryonnaires ouvrent de grandes perspectives pour la médecine régénérative en raison de leur capacité à produire tous les types de LCP OS 16/17 52

53 cellules que nous allons décrire. Ces cellules ont aussi été à l'origine de nombreuses controverses et d'un débat éthique en raison de leur origine embryonnaire. 1. Différenciation en culture Outre leur utilisation possible en thérapeutique, les cellules SE permettent d'étudier le processus de différenciation en culture. La manipulation de ces cellules par modification des milieux de culture permet de faire un tri parmi les facteurs intervenant dans la différenciation au niveau même où les cellules entament ce processus. Les premières tentatives de différenciation en culture étaient handicapées par les conditions de culture. Dans les premières expériences, le milieu contenait du sérum de fœtus de veau (fréquent dans les cultures de tissus), mal défini et différent d'un cas à l'autre. On a ensuite trouvé des conditions de culture plus précises et amélioré la reproductibilité dans le contrôle de la différenciation in vitro. Grâce aux milieux de culture mieux définis, on a reproduit en culture les premières étapes du développement de la souris dans des cellules SE. À partir de cellules SE de souris, on peut donc obtenir d'abord l'ectoderme, l'endoderme et le mésoderme, puis ces trois types de cellules donneront les différentes assises germinales correspondant à leur détermination. Ce travail en est encore à ses prémisses, mais il est extrêmement passionnant et il promet d'élucider les bases moléculaires des étapes de la détermination des différents types cellulaires. Chez les humains, on a obtenu différents types cellulaires en culture au départ de cellules SE. Par exemple, on a montré que ces cellules donnent naissance aux différents types de cellules sanguines en culture. On travaille à la production de cellules souches hématopoïétiques in vitro, pour remplacer ces cellules chez des patients souffrant de maladies affectant les cellules sanguines. Les cellules SE humaines ont aussi été utilisées pour produire en culture des cardiomyocytes. Ces cellules pourraient servir à remplacer les tissus du cœur après des crises cardiaques. FIGURE 5.5 : Isolement de cellules souches embryonnaires. a. Les premières divisions cellulaires aboutissent au stade blastocyste, consistant en une assise externe et une masse cellulaire interne, qui évoluera en embryon. On peut isoler les cellules souches embryonnaires (cellules SC) à ce stade en détruisant l'embryon et en mettant les cellules en culture. Les cellules souches prélevées de blastocystes de six jours peuvent être cultivées et rester indéfiniment indifférenciées. b. Cellules souches embryonnaires humaines. Cette masse est une colonie de cellules souches embryonnaires LCP OS 16/17 53

54 humaines indifférenciées étudiées dans le laboratoire du biologiste du développement James Thomson à l'université du Wisconsin, à Madison. La différenciation cellulaire est précédée de la détermination, qui engage la cellule non encore différenciée dans un type de développement. L hérédité différentielle de facteurs cytoplasmiques peut entraîner la détermination et la différenciation, de même que les interactions entre cellules voisines (induction). Dans l'induction, les modifications sont dues à des molécules de transmission qui enclenchent des voies de transduction. Les cellules souches sont capables de se diviser indéfiniment et peuvent être à l'origine de cellules différenciées. Les cellules souches embryonnaires sont des cellules pluripotentes capables de donner naissance à toutes les structures adultes. LCP OS 16/17 54

55 5.3 Reprogrammation nucléaire et clonage L'étude du processus de la détermination et de la différenciation conduit tout naturellement à des questions sur la possibilité d'inverser ce processus. C'est intéressant pour l'expérimentation quand l'on veut comprendre le processus de base, mais aussi si l'on envisage de créer des types cellulaires spécifiques pour remplacer les cellules perdues par maladie ou par blessure chez certains patients. On s'est ainsi engagé dans un chemin fascinant avec tournants et détours, avec une accélération récente. Nous allons retracer brièvement l'histoire de ce sujet, puis envisager les résultats les plus récents Inversion de la détermination Des expériences entreprises dans les années 1950 ont montré que des cellules isolées de tissus totalement différenciés d'une plante adulte pouvaient se développer en plantes complètes. Les cellules de l'embryon de mammifère au début de la segmentation sont également totipotentes. Quand les embryons de mammifères se divisent naturellement en deux parties, on obtient des jumeaux identiques. Si des blastomères sont séparés, chacun peut produire un individu parfaitement normal. En fait, on a utilisé ce moyen pour produire quatre ou huit descendants identiques pour la sélection commerciale de lignées particulièrement intéressantes de bovidés Premières recherches chez les batraciens En biologie du développement, la première question était de savoir si la différenciation des cellules impliquait des modifications irréversibles. Les expériences réalisées dans les années 1950 par Briggs et King, puis par John Gurdon dans les années 1970 ont montré la possibilité de transférer des noyaux entre cellules. Avec de très fines pipettes, ces chercheurs aspiraient le noyau d'un ovule de grenouille ou de crapaud et le remplaçaient par un noyau aspiré d'une cellule somatique d'un autre individu. Les conclusions de ces expériences sont quelque peu contradictoires. D'un côté, les cellules ne semblent pas subir de modifications totalement irréversibles, comme la perte de gènes. D'autre part, le noyau transplanté a d'autant plus de peine à diriger le développement que la cellule est plus différenciée. On en est arrivé à l'idée de la reprogrammation nucléaire : le noyau d'une cellule différenciée subit des modifications épigénétiques qui doivent être inversées pour lui permettre de diriger le développement. Les modifications épigénétiques ne modifient pas l'adn de la cellule, mais elles persistent au cours des divisions cellulaires. Les premiers travaux sur les amphibiens ont montré la possibilité de reprogrammer les noyaux des cellules intestinales des têtards pour produire des grenouilles adultes viables. On peut considérer ces animaux comme des clones, mais cela prouve aussi la possibilité de reprogrammer complètement les noyaux des têtards. Les cellules différenciées adultes ne pouvaient cependant donner que des têtards, mais pas des adultes fertiles viables. Ces travaux montrent donc que les noyaux adultes ont un potentiel de développement remarquable, mais qu'ils ne peuvent être reprogrammés au point de devenir totipotents. LCP OS 16/17 55

56 5.3.3 Premières recherches sur les mammifères Le clonage des mammifères a représenté une aventure bien plus complexe que celui des amphibiens. Plusieurs expériences furent réussies : on parvint par exemple à produire des jumeaux par scission d embryons (figure 5.6). En se basant sur les travaux réalisés chez les amphibiens, on a fait beaucoup d'essais de transfert de noyaux chez les mammifères, et d'abord chez les souris et les bovins. Non seulement on n'a pas obtenu des clones d'animaux, mais ces travaux ont abouti à la découverte des empreintes, avec la production d'embryons à caractères uniquement maternels ou paternels. Ces embryons ne se sont jamais développés et ils montraient des déficiences différentes suivant qu'ils avaient reçu le génome maternel ou paternel. FIGURE 5.6 : Trois techniques de clonage des mammifères. a. Par scission d embryon. b. par transfert de blastomères (cellules indifférenciées). c. Par transfert de noyau de cellule différenciée (technique ayant donné naissance à Dolly). LCP OS 16/17 56

57 5.3.4 Réussite d'une transplantation nucléaire chez les mammifères Cette situation a perduré jusqu'au clonage d'un mouton au départ d'un noyau provenant d'une cellule de jeune embryon, en La clé du succès était le choix d'une cellule au tout début du développement. Ce résultat passionnant fut rapidement reproduit par d'autres dans une série d'autres organismes, comme les porcs et les singes. Seules les jeunes cellules embryonnaires semblaient cependant fonctionner. Les généticiens de l'institut Roslin, en Écosse, ont pensé que l'ovule et le noyau transféré devraient peut-être se trouver au même stade du cycle cellulaire pour permettre le développement. Pour tester cette idée, ils effectuèrent l'expérience suivante (figure 5.7) : 1. Ils prélevèrent des cellules mammaires différenciées du pis d'un mouton de six ans. Les cellules furent mises en culture, puis on diminua notablement la concentration des nutriments du sérum pendant cinq jours, provoquant une pause au début du cycle cellulaire. 2. Dans une préparation parallèle, on enleva le noyau d'ovules provenant d'une brebis. 3. En janvier 1996, on combina les cellules mammaires et les ovules par transfert de noyaux de cellules somatiques. On introduisit les noyaux mammaires dans les ovules. 4. Vingt-neuf des 277 cellules fusionnées se développèrent en embryons qui furent implantés dans la matrice de mères porteuses. 5. Un peu plus de cinq mois plus tard, le 5 juillet 1996, une brebis donna naissance à un agneau nommé Dolly, premier clone obtenu à partir d'une cellule animale complètement différenciée. Dolly devint une brebis adulte, fut capable de se reproduire da façon traditionnelle et donna six descendants. Dolly montrait donc sans discussion possible la possibilité d'inverser la détermination chez les animaux, qu'avec de bonnes techniques, le noyau d'une cellule totalement différenciée peut être reprogrammée et devenir totipotente. 5.4 Problèmes inhérents au clonage reproducteur On parle de clonage reproducteur pour désigner les processus qui vient d'être décrits : en transférant un noyau, les scientifiques créent un animal génétiquement identique à un autre. Depuis la naissance de Dolly en 1997, ils ont réussi à cloner un ou plusieurs chats, lapins, rats, souris, vaches, chèvres, porcs et mulets. On a toujours utilisé l'une ou l'autre cellule adulte. LCP OS 16/17 57

58 5.4.1 Faible taux de réussite et maladies liées à l'âge Dans tous les clonages reproducteurs, l'efficacité est plutôt faible : 3-5 % seulement des noyaux transférés aux ovules ont abouti à des naissances vivantes. En outre, beaucoup de clones meurent peu après leur naissance de maladies du foie ou d'infections. Beaucoup sont devenus anormalement grands : on parle du syndrome des descendants de grande taille. En 2003, trois des quatre porcelets clonés sont devenus adultes, mais tous les trois sont morts subitement de troubles cardiaques avant l'âge de 6 mois. Dolly elle-même fut euthanasiée à l'âge relativement jeune de six ans. Bien qu'elle ait été supprimée à cause d'un cancer des poumons d'origine virale, on avait diagnostiqué une arthrite à un stade avancée un an plus tôt. Une difficulté de l'ingénierie génétique et du clonage pour l'amélioration des animaux domestiques est donc la production d'un nombre suffisant d'animaux en bonne santé Absence d'empreinte Ces problèmes proviennent du phénomène de l'empreinte génomique. Les gènes impliqués s'expriment différemment selon l'origine parentale, suivant qu'ils ont été enclenchés dans l'ovule ou dans le spermatozoïde, et cette «disposition» persiste pendant le développement de l'adulte. Le développement normal des mammifères dépend d'une empreinte génomique précise. La reprogrammation chimique de l'adn dans le tissu reproducteur adulte prend des mois pour les spermatozoïdes et des années pour les ovules. Pendant le clonage, au contraire, la reprogrammation de l'adn donneur doit se faire en quelques heures. L'organisation de la chromatine d'une cellule somatique est également très différente de celle d'un œuf qui vient d'être fécondé. Pour la survie de l'embryon cloné, un remodelage important du noyau transféré est aussi nécessaire. Le clonage échoue vraisemblablement parce quelques heures ne suffisent pas pour un remodelage et une reprogrammation corrects. LCP OS 16/17 58

59 FIGURE 5.7 : Preuve que la détermination est réversible chez les animaux. Les scientifiques ont réuni un noyau de cellule mammaire et un ovule énucléé pour cloner avec succès un mouton, appelé Dolly, qui s'est développé en adulte normal et a donné une descendance normale. Cette expérience, premier clonage réussi d'un animal adulte, montre qu'une cellule adulte différenciée peut être à l'origine d'un développement complet. LCP OS 16/17 59

60 5.5 Des facteurs définis sont utilisés pour reprogrammer le noyau Suite à la découverte des cellules SE et au succès du clonage reproducteur des mammifères, beaucoup de recherches ont été entreprises pour trouver le moyen de reprogrammer les cellules adultes en cellules pluripotentes sans passer par les embryons (figure 5.8). Un moyen était la fusion d'une cellule SE et d'une cellule différenciée. Ces essais de fusion ont montré la possibilité de reprogrammer le noyau de la cellule différenciée par un contact avec le cytoplasme de la cellule SE. Les cellules obtenues étaient évidemment tétraploïdes (4 exemplaires du génome), ce qui limite leur utilité expérimentale et pratique. Une autre voie de recherche a montré que les premières cellules germinales mises en culture pendant une période prolongée peuvent devenir capables de fonctionner comme les cellules SE. On a aussi signalé que certaines cellules souches adultes devenaient pluripotentes après une culture prolongée, mais ceci est encore discuté. FIGURE 5.8 : Comment reprogrammer les noyaux de cellules adultes. Il existe plusieurs moyens de reprogrammer en cellules pluripotentes des cellules prélevées sur des organismes adultes. On peut transplanter les noyaux de cellules somatiques dans des ovocytes comme pour le clonage. On peut fusionner les cellules somatiques à des cellules SE obtenues par divers autres moyens. Les cellules germinales et certaines cellules souches adultes paraissent reprogrammées après une culture prolongée. Des recherches récentes ont montré la possibilité de reprogrammer des cellules somatiques en culture par l'introduction de facteurs spécifiques. Toutes ces voies de recherche ont montré la possibilité de reprogrammer des noyaux somatiques. L'étape suivante était évidemment de reprogrammer les noyaux avec des facteurs connus. On pensait que c'était possible, mais on ne l'avait pas encore réalisé avant 2006, quand on a introduit les gènes de quatre facteurs de transcription différents, Oct4, Sox2, c-myc et Klf4 dans des cellules de fibroblastes en culture. On avait choisi ces cellules pour l'expression d'un gène qui est une cible de Oct4 et Sox2, et ces cellules semblent pluripotentes. On les a désignées comme cellules souches pluripotentes induites. Ce protocole a été amélioré par sélection pour un autre gène cible, Nanog. Les cellules induites exprimant ce gène ressemblent aux LCP OS 16/17 60

61 cellules SE pour ce qui concerne les possibilités de développement, ainsi que le mode d'expression génique. On utilise aujourd'hui cette technologie pour construire des cellules SE de patients atteints d'une maladie héréditaire, l'atrophie musculaire spinale. En culture, ces cellules SE se différencieront en neurones moteurs avec le phénotype souhaité pour la maladie. La possibilité d'obtenir des cellules souches correspondant à une maladie constituera un progrès immense pour les chercheurs qui étudient ces maladies. Cela permettra la création de systèmes in vitro pour l'étude directe des cellules affectées par des maladies génétiques et la sélection de thérapeutiques possibles. Les cellules pluripotentes peuvent avoir des applications thérapeutiques. Un moyen de résoudre le problème du rejet des greffes, par exemple lors de greffes de peau en cas de brûlures graves, est la production de lignées de cellules souches embryonnaires spécifiques du patient. Au début de 2001, une équipe de recherche de l'université Rockefeller a imaginé un moyen d'y arriver. Des cellules de peau sont d'abord prélevées; ensuite, en appliquant la technique de transfert de noyau à l'origine de Dolly, on obtient un embryon. Le noyau d'une cellule de peau est prélevé et inséré dans un œuf préalablement énucléé. L'œuf avec son noyau de cellule de peau donne un blastocyste. L'embryon artificiel est ensuite détruit et ses cellules sont utilisées comme cellules souches embryonnaires et transférées au tissu malade (figure 5.9). Figure 5.9 : Comment utiliser des embryons humains pour le clonage thérapeutique. Dans le clonage thérapeutique, après un clonage reproducteur initial, l'embryon est détruit et ses cellules souches sont extraites. Elles sont cultivées et utilisées pour remplacer le tissu malade de l'individu dont provient l'adn. Ce n'est utile que si la maladie en question n'est pas génétique, puisque les cellules souches sont génétiquement identiques au patient. Par cette méthode de clonage thérapeutique, les chercheurs ont réussi à transformer des cellules de la queue d'une souris en cellules de cerveau productrices de LCP OS 16/17 61

62 dopamine, celles qui sont perdues en cas de maladie de Parkinson. Le clonage thérapeutique est une réponse appropriée au problème clé qu'il faut résoudre avant de pouvoir utiliser les cellules souches pour réparer des tissus atteints par une crise cardiaque, les dégâts aux nerfs, le diabète ou la maladie de Parkinson - le problème de compatibilité immunitaire. Étant clonées à partir des tissus de l'individu lui-même lors du clonage thérapeutique, ces cellules souches réussissent le test d'identité du système immunitaire et l'organisme les accepte immédiatement. Ces premiers essais de clonage thérapeutique peuvent devenir surannés avant même d'être affinés, grâce aux recherches sur les cellules souches pluripotentes induites déjà décrites. La possibilité d'obtenir des cellules pluripotentes à partir de cellules adultes de peau évite les problèmes éthiques liés à l'élimination d'embryons et la nécessité de trouver des ovocytes pour le clonage thérapeutique. Ces types de cellules ne sont cependant pas eux-mêmes sans poser des problèmes. Deux des gènes introduits pour reprogrammer les noyaux sont oncogènes et, même si ces expériences ont été répétées sans c-myc, l'efficacité est fortement réduite. Elles nécessitent aussi l'introduction d'un nouvel ADN, susceptible d'induire des mutations par intégration au génome. LCP OS 16/17 62

63 Le clonage est pratiqué depuis longtemps chez les plantes. Chez les animaux, les cellules des jeunes embryons sont également totipotentes, mais les tentatives de clonage à partir de noyaux adultes ont donné des résultats mitigés. Pour devenir totipotent, le noyau d'une cellule différenciée doit être reprogrammé. Cela semble nécessaire au moins en partie à cause de l'empreinte génomique. On peut reprogrammer les noyaux par fusion avec une cellule souche embryonnaire, qui donne une cellule tétraploïde, ou en introduisant quatre facteurs de transcription importants. On a montré que la reprogrammation est possible par un clonage reproducteur appliquant le transfert d'un noyau de cellule somatique. Le but du clonage thérapeutique est la production d'un tissu de remplacement à partir de cellules du patient luimême. 5.6 CSPi (= cellules souches pluripotentes induites) Par opposition aux cellules souches embryonnaires (CSE), les cellules souches pluripotentes induites (ou CSPi) ont pour origine une cellule adulte somatique, redevenue pluripotente grâce à l'action de facteurs de croissance et de facteurs de transcription. Ces CSPi ont d'abord été obtenues à partir de cellules de souris (2006), et par la suite à partir de cellules humaines (2007).Ces cellules sont très étudiées pour leur rôle potentiel dans le traitement de maladies génétiques, de cancers, ou dans le remplacement d'organes. Les cellules souches pluripotentes induites ont été créées pour la première fois chez la souris en 2006 par une équipe de chercheurs japonais dirigés par Shinya Yamanaka, qui a reçu pour cette performance le prix Nobel de médecine Après extraction de fibroblastes (cellules de la peau) de rongeurs, ils ont activé à l'aide d'un rétrovirus quatre gènes clés, nommés Oct-3/4, Sox2, c-myc et Klf4. Trois à quatre semaines plus tard, ces cellules devenaient pluripotentes. La performance a été reproduite chez l'homme en novembre Depuis, d'autres techniques de production ont été développées, que ce soit avec des agents imitant les facteurs de transcription, de nouveaux vecteurs viraux, de l'arn ou encore de l'induction de gènes.la médecine régénérative a besoin de cellules souches pour restaurer ou reconstruire des organes ou tissus. Les deux principaux candidats sont les cellules souches embryonnaires et les cellules souches pluripotentes induites. Les CSE sont les premières à avoir été découvertes. Elles proviennent de l'embryon et nécessitent sa destruction pour être extraites. De ce fait, elles présentent des problèmes éthiques. LCP OS 16/17 63

64 Les cellules souches pluripotentes induites, elles, ne nécessitent qu'un prélèvement de petits morceaux de peau. De plus, elles comportent l'adn du patient et peuvent facilement être réinjectées. Cependant, par les modifications génétiques induites, ces CSPi sont plus susceptibles de former des tumeurs. Ainsi, à l'utilisation, elles sont pour l'instant plus risquées que les CSE. LCP OS 16/17 64

65 6 QUELQUES APPLICATIONS Les débuts de l'ingénierie génétique ont été à l'origine d'une explosion de sociétés start-up, dont beaucoup ont disparu. En même temps, toutes les grandes compagnies pharmaceutiques ont entamé des recherches dans ce domaine ou ont activement cherché à acheter des sociétés plus petites possédant une technologie d'avant-garde. Les applications de cette technologie sont bien trop nombreuses pour les citer ici, mais nous en mettrons quelques-unes en évidence. 6.1 Applications médicales Production de protéines humaines par des bactéries La première, et peut-être la plus claire application commerciale de l'ingénierie génétique fut l'introduction, dans des bactéries, de gènes codant des protéines cliniquement importantes. Comme on peut cultiver des cellules bactériennes en masse à faible coût, les bactéries incorporant des gènes recombinants peuvent synthétiser de grandes quantités des protéines codées par ces gènes, pour autant que le gène inséré soit planifié en vue de son expression dans une cellule bactérienne. On a appliqué cette technique pour produire plusieurs formes de l insuline humaine et une protéine du système immunitaire, l'interféron, ainsi que d'autres protéines commercialement importantes, comme l'hormone de croissance humaine (figure 6.1) et l'érythropoïétine, qui stimule la production des érythrocytes. Parmi les protéines importantes en pharmacie actuellement produites de cette façon, citons les peptides atriaux, petites protéines qui peuvent être à la base d'un nouveau traitement de l'hypertension et des déficiences rénales. Le facteur natriurétique auriculaire (FNA ou ANF de l'anglais : Atrial Natriuretic Factor), encore appelé peptide natriurétique atrial (ou ANP de l'anglais : Atrial Natriuretic Peptide ), auriculine ou cardionatrine, est une hormone polypeptidique essentiellement synthétisée par l'atrium droit du cœur. Il participe à l'homéostasie du sodium, du potassium et de l'eau en agissant sur l'excrétion rénale, et possède une action vasodilatatrice. Cette hormone est normalement produite sous l'effet de l'étirement mécanique de la paroi de l'atrium droit du cœur en cas d'hypertension et favorise ainsi par son action la baisse de la pression artérielle. C'est aussi le cas de l'activateur du plasminogène des tissus, petite protéine humaine synthétisée en quantité minime qui provoque la dissolution des caillots sanguins et qui, utilisée dans les trois heures qui suivent une attaque ischémique (empêchant l'arrivée du sang au cerveau) permettant l'éviter un handicap grave. Cette technique pose un problème, c'est la difficulté de séparer la protéine recherchée des autres molécules synthétisées par la bactérie. La purification des protéines à partir de ces mélanges complexes est coûteuse en temps et en argent, mais elle reste encore plus facile que l'isolement des protéines à partir de tissus animaux à partir desquels on les obtenait. Autrefois, par exemple, on extrayait l'insuline de pancréas de chiens, parce que l'insuline du chien ressemble à celle de l'homme.

66 FIGURE 6.1 : Souris génétiquement modifiée avec l'hormone de croissance humaine. Ces deux souris proviennent d'une lignée endogame et ne diffèrent que par la présence d'un gène supplémentaire dans la grande : c'est le gène qui code l'hormone de croissance humaine. On a introduit ce gène dans le génome de la souris et il fait désormais partie du patrimoine génétique de cette souris Production de vaccins Un autre domaine susceptible de devenir important est l'utilisation de l'ingénierie génétique dans la production de vaccins contre les maladies contagieuses. Deux types de vaccins sont à l'étude : 1. les vaccins à sous-unités et 2. les vaccins d'adn. Les vaccins à sous-unités On peut produire des vaccins à sous-unités contre des virus, par exemple ceux qui sont responsables de l'herpès et de l'hépatite. Les gènes codant une partie de l'enveloppe de protéine et polysaccharide de l'herpès virus simplex ou du virus de l'hépatite B sont épissés dans un fragment du génome du virus de la vaccine (figure 6.2). Le virus de la vaccine, utilisé il y a près de 200 ans par le médecin britannique Edward Jenner pour les premiers essais de vaccination contre la variole, est aujourd'hui utilisé comme vecteur pour introduire le gène de l'enveloppe du virus de l'herpès ou de l'hépatite dans des cellules de mammifères en culture. Ces cellules produisent de nombreuses copies du virus recombinant qui possède l'enveloppe externe d'un virus de l'herpès ou de l'hépatite. Quand ce virus recombinant est injecté dans une souris ou un lapin, le système immunitaire de l'animal infecté produit LCP OS 16/17 66

67 des anticorps dirigés contre l'enveloppe du virus recombinant. L'animal est ainsi immunisé contre le virus de l'herpès ou de l'hépatite. Les vaccins produits de cette façon sont inoffensifs parce que le virus de la vaccine est bénin, et seul un petit morceau de l'adn du virus responsable de la maladie est introduit via le virus recombinant. Le grand avantage de cette méthode est son indépendance par rapport à la nature de la maladie virale. Dans l'avenir, les mêmes virus recombinants pourront être utilisés chez les humains pour leur conférer la résistance à des maladies virales très diverses. FIGURE 6.2 : Stratégie pour la construction d'un vaccin à sous-unités contre l'herpès simplex. On peut appliquer les techniques de l'adn recombinant pour construire des vaccins pour une seule protéine d'un virus ou d'une bactérie. Dans cet exemple, il s'agit d'une protéine de l'enveloppe de l'herpès virus simplex. Les vaccins d'adn En 1995 ont débuté les premiers essais cliniques destinés à tester une nouvelle catégorie de vaccins d'adn qui n'est pas basée sur des anticorps, mais sur la seconde arme de la défense immunitaire de l'organisme, la réponse immunitaire cellulaire, dans laquelle des cellules sanguines, les lymphocytes T tueurs s'attaquent aux cellules infectées. Les premiers vaccins d'adn ont associé un gène du virus de la grippe codant une nucléoprotéine interne à un plasmide, qui fut ensuite injecté à des souris. Les souris ont développé une forte réponse immunitaire cellulaire à la grippe. Bien que nouvelle et controversée, cette méthode offre de grandes possibilités. LCP OS 16/17 67

68 LCP OS 16/17 68

69 6.1.3 Thérapie génique En 1990, des chercheurs ont tenté pour la première fois de combattre des déficiences génétiques par un transfert de gènes humains. Quand une maladie héréditaire est provoquée par un seul gène déficient, un moyen évident de guérir la maladie serait l'addition d'un exemplaire fonctionnel du gène. Cette méthode a été utilisée dans une tentative de lutte contre la mucoviscidose; elle pourrait aussi s'appliquer au traitement de la dystrophie musculaire et de diverses autres maladies (tableau 6.1). Les essais cliniques de traitement d'une maladie génétique de l'œil, la dégénérescence maculaire, par interférence de l'arn sont prometteurs. Les individus atteints d'un certain type de dégénérescence maculaire perdent la vue à cause de la prolifération incontrôlée des vaisseaux sanguins sous la rétine. Pour le patient, c'est un peu comme regarder par le pare-brise d'une voiture dont les essuieglaces sont en panne au milieu d'une tempête. La thérapie par interférence de l'arn implique l'injection de l'arn bicaténaire codant un gène nécessaire à la prolifération des vaisseaux sanguins. Le mécanisme d'interférence à l'effet contraire à celui que LCP OS 16/17 69

70 l'on attendrait : il supprime la synthèse de la protéine nécessaire au développement des vaisseaux sanguins et empêche les progrès de la maladie. Une maladie illustre en même temps le potentiel et les problèmes de la thérapie génique, c'est l'immunodéficience combinée sévère (SCID). Il existe de nombreuses formes de cette maladie, par exemple une forme liée au chromosome X (X-SCID) et une forme déficiente en une enzyme, l'adénosine désaminase (ADA-SCID). Les tests récents sur ces deux formes ont été très prometteurs, avec une restauration de la fonction immunitaire chez les patients. Mais des problèmes sont apparus pour la X-SCID, quand un patient a développé une forme rare de leucémie. Par la suite, deux autres patients ont développé la même leucémie, qui paraît due à la thérapie génique elle-même. Dans tous les cas, le vecteur utilisé pour introduire le gène X-SCID s'est intégré au génome à proximité du proto-oncogène LM02. L'activation de ce gène peut entraîner des leucémies chez l'enfant. L'insertion d'un gène pendant la thérapie a toujours été un événement aléatoire, et l'on pouvait craindre que l'insertion inactive un gène essentiel ou active un gène inapproprié. On ne l'avait jamais observé avant les tests sur la X-SCID, en dépit du grand nombre de gènes introduits dans les cellules sanguines en particulier. Pour que la leucémie apparaisse dans 15 % des patients traités, le background génétique associé à la maladie doit avoir une influence. Cette possibilité est confortée par le fait que les patients atteints de la ADA SCID et traités n'ont pas encore été affectés. Pour l'aspect positif, 15 enfants traités avec succès sont encore en vie, dont 14 après plus de quatre ans, et leur système immunitaire est fonctionnel. Du côté négatif, trois autres enfants traités sont atteints de leucémie. Si nous comprenions la cause de l'intégration préférentielle dans le cas de la X- SCID, il serait possible d'éviter ce résultat malheureux. En attendant, les chercheurs ont arrêté les essais et sont à la recherche de nouveaux vecteurs pour réduire la possibilité de cette intégration préférentielle. LCP OS 16/17 70

71 6.1.4 Autre procédé mettant en jeu des gènes : l'arn interférence Les essais cliniques de traitement d'une maladie génétique de l'œil, la dégénérescence maculaire, par interférence de l'arn sont prometteurs. Les individus atteints d'un certain type de dégénérescence maculaire perdent la vue à cause de la prolifération incontrôlée des vaisseaux sanguins sous la rétine. Pour le patient, c'est un peu comme regarder par le pare-brise d'une voiture dont les essuieglaces sont en panne au milieu d'une tempête. La thérapie par interférence de l'arn implique l'injection de l'arn bicaténaire codant un gène nécessaire à la prolifération des vaisseaux sanguins. Le mécanisme d'interférence a l'effet contraire de celui que l'on attendrait : il supprime la synthèse de la protéine nécessaire au développement des vaisseaux sanguins et empêche les progrès de la maladie. LCP OS 16/17 71

72 Crispr cas9 CRISPR-Cas9 Derrière cet acronyme barbare se cache une innovation révolutionnaire : remplacer un gène par un autre ou le modifier. La méthode paraît presque trop simple, et pourtant elle est le fruit de près de trente ans de recherche. CRISPR-Cas9 (prononcez «crispère») fonctionne comme des ciseaux génétiques : il cible une zone spécifique de l ADN, la coupe et y insère la séquence que l on souhaite. CRISPR-Cas9 est un complexe formé de deux éléments : d un côté, un brin d ARN, de séquence homologue à celle de l ADN que l on veut exciser, et de l autre, une LCP OS 16/17 72

73 endonucléase, le Cas9. Dans la cellule, le brin d ARN va reconnaître la séquence homologue sur l ADN et s y placer. L enzyme Cas9 se charge alors de couper la chaîne ADN complémentaire à ce brin ARN. Le trou laissé par le passage du CRISPR-Cas9 pourra alors être comblé par n importe quel nouveau fragment d ADN. Si CRISPR-Cas9 met le monde scientifique en émoi, c est qu il étend les possibilités de retouche génétique à l infini : supprimer un gène malade, le remplacer par une séquence saine ou encore étudier la fonction précise d un brin d ADN, à la molécule près Aucun secteur de la biologie n y échappe, et de nouvelles applications sont publiées quotidiennement. a688e0683ccfe5178db483d8b84 La technologie de l'adn recombinant a permis d'isoler des gènes eucaryotes, y compris humains, de les insérer dans des vecteurs et de les recombiner dans des génomes bactériens, où les produits de ces gènes peuvent être synthétisés en masse. La thérapie génique est une application de l'ingénierie génétique permettant de remplacer les gènes déficients. L insertion aléatoire des gènes entraîne cependant parfois des effets non désirés. LCP OS 16/17 73

74 6.2 Applications en agriculture Aucun domaine de l'ingénierie génétique ne concerne peut-être aussi directement chacun de nous que ses applications actuelles à l'agriculture. On modifie les plantes cultivées pour qu'elles résistent aux maladies, qu'elles tolèrent les herbicides et pour changer leur valeur nutritionnelle et divers autres produits. On a également utilisé les plantes pour produire des médicaments et des animaux domestiques génétiquement modifiés pour la production de molécules biologiquement actives Transformation des plantes Chez les plantes, la principale difficulté expérimentale a été le choix d'un vecteur adéquat pour l'introduction de l'adn recombinant. Les cellules végétales ne possèdent pas les nombreux plasmides existant chez les bactéries et le choix des vecteurs potentiels est limité. Le plasmide Ti Jusqu'ici, les meilleurs résultats ont été obtenus avec le plasmide Ti (inducteur de tumeurs) de la bactérie des plantes Agrobacterium tumefaciens, qui infecte des plantes à larges feuilles comme la tomate, le tabac et le soja. Une portion du plasmide Ti s'intègre à l'adn de la plante et les chercheurs ont réussi à fixer d'autres gènes à cette portion du plasmide (figure 6.3). Les caractéristiques de plusieurs plantes ont été modifiées par cette technique, qui devrait permettre l'amélioration des plantes cultivées et forestières. Parmi les caractères que les scientifiques aimeraient modifier, citons la résistance aux maladies, au froid et à d'autres formes de stress, l'équilibre nutritionnel, la teneur en protéine et la résistance aux herbicides. Malheureusement, Agrobacterium n'infecte généralement pas les céréales, comme le maïs, le riz et le blé, mais d'autres méthodes peuvent être utilisées pour y introduire de nouveaux gènes. FIGURE 6.3 : Le plasmide Ti. Ce plasmide d'agrobacterium tumefaciens est utilisé pour les manipulations génétiques chez les plantes. LCP OS 16/17 74

75 Autres méthodes pour l'insertion des gènes D'autres méthodes ont été utilisées pour les céréales, qui ne sont normalement pas infectées par Agrobacterium. Une méthode en vogue, le «pistolet à ADN», est un bombardement à l'aide de minuscules particules d'or ou de tungstène enrobées d'adn. Cette technique a l'avantage de s'appliquer à toutes les espèces, mais elle manque de précision parce qu'il est beaucoup plus difficile de contrôler le nombre d'exemplaires du gène introduit. Récemment, le système Agrobacterium a été modifié pour son application aux céréales, de sorte que le pistolet à ADN ne sera peut-être plus guère utilisé dans l'avenir. On a aussi manipulé une autre bactérie pour qu'elle fonctionne comme Agrobacterium, ce qui ouvrirait une autre possibilité pour la transformation des céréales. Il est clair que la transformation génétique des plantes cultivées de toutes sortes est maintenant une technologie adulte capable d'accélérer l'obtention de variétés transgéniques diverses. LCP OS 16/17 75

76 6.2.2 Résistance aux herbicides Des plantes à larges feuilles ont été transformées pour les rendre résistantes au glyphosate, herbicide biodégradable puissant, surtout efficace contre les plantes en croissance active (figure 6.4). Le glyphosate agit par inhibition d'une enzyme, la 5- énolpyruvyl-shikimate-3-phosphate (EPSP) synthétase, dont les plantes ont besoin pour la synthèse des acides aminés aromatiques. L'homme ne synthétise pas d'acides aminés aromatiques, il les trouve dans son alimentation, de sorte qu'il n'est pas affecté par le glyphosate. Pour rendre les plantes résistantes au glyphosate, les scientifiques ont introduit des copies supplémentaires du gène de l'epsp synthétase dans les plantes en se servant d'un plasmide Ti. Ces plantes modifiées produisent 20 fois la quantité normale d'epsp synthétase, ce qui leur permet de synthétiser les protéines et de croître malgré l'inhibition de l'enzyme par le glyphosate. Dans les expériences ultérieures, une LCP OS 16/17 76

77 forme bactérienne du gène de l'epsp synthétase différant par un seul nucléotide de celle des plantes a été introduite dans les plantes via les plasmides Ti ; dans ces plantes, l'enzyme bactérienne n'est pas inhibée par le glyphosate (voir figure 6.4). Ces progrès sont très intéressants pour les cultivateurs parce qu'une plante résistante au glyphosate ne doit jamais être sarclée : il suffit de traiter le champ par l'herbicide. Grâce au large spectre d'action du glyphosate, les agriculteurs ne doivent plus utiliser une série d'herbicides différents, la plupart ne détruisant que quelques espèces d'adventices. En outre, le glyphosate se dégrade facilement dans l'environnement, contrairement à beaucoup d'autres herbicides communément utilisés en agriculture. On recherche activement un plasmide pour introduire le gène de l'epsp synthétase dans les céréales et les rendre également résistantes au glyphosate. Jusqu'à présent, quatre plantes importantes ont été modifiées pour la résistance au glyphosate : le maïs, le coton, le soja et le colza. Le soja résistant au glyphosate est devenu particulièrement populaire : il représente 60 % de toutes les surfaces cultivées en OGM (organismes génétiquement modifiés) dans neuf pays. Aux États Unis, 90 %du soja actuellement cultivé sont modifiés. La culture des OGM a été adoptée en Amérique, et en premier lieu aux Etats-Unis. Aujourd'hui, ces cultures s'étendent surtout en Asie, alors que l'europe a été la plus prudente à s'engager dans leur application. FIGURE 6.4 : Manipulation génétique de la résistance à un herbicide. LCP OS 16/17 77

78 6.2.3 Résistance aux insectes nuisibles Beaucoup de plantes commercialement importantes sont attaquées par des insectes et la défense traditionnelle contre les attaques est l'application d'insecticides. Plus de 40 % des insecticides chimiques utilisés actuellement sont destinés aux charançons, aux vers de la capsule et autres insectes qui s'attaquent aux cotonniers. Les chercheurs ont maintenant obtenu des plantes résistantes aux insectes nuisibles, évitant ainsi la nécessité d'appliquer de nombreux insecticides externes. Cette approche consiste à insérer dans les plantes cultivées des gènes codant des protéines nuisibles pour les insectes qui se nourrissent sur les plantes, mais inoffensives pour les autres organismes. La protéine le plus utilisée est une toxine produite par une bactérie du sol, Bacillus thuringiensis (la toxine Bt). Quand les insectes ingèrent cette toxine, des enzymes endogènes la transforment en une toxine spécifique pour cet insecte, provoquant sa paralysie et sa mort. Ces enzymes n'existant pas chez les autres animaux, la protéine est sans danger pour eux. LCP OS 16/17 78

79 Les quatre plantes modifiées pour la résistance aux herbicides ont aussi été transformées pour la résistance aux insectes par la toxine Bt. Globalement, le maïs Bt est, en importance, la seconde plante génétiquement modifiée : il représente 14 % des cultures d'ogm dans neuf pays. La répartition de ces cultures dans le monde est la même que pour les plantes résistantes à l'herbicide Riz doré Parmi les plantes génétiquement modifiées, une des réussites est le développement du riz doré. Ce riz a été modifié pour produire le β-carotène (provitamine A). L'organisation Mondiale de la Santé estime que la carence en vitamine A affecte, dans le monde, de 140 à 250 millions d'enfants avant l'âge scolaire. Cette carence est particulièrement sévère dans les pays en développement où la principale nourriture de base est le riz. La provitamine A présente dans l'alimentation peut être transformée en vitamine A par les enzymes de l'organisme, réduisant ainsi la carence. Le riz doré doit son nom à sa couleur particulière due à la présence du β-carotène dans l'albumen. Le riz ne synthétise normalement pas de β-carotène dans son albumen, mais un précurseur, le géranyl géranyl diphosphate, qui peut être transformé en β-carotène par trois enzymes, la phytoène synthétase, la phytoène LCP OS 16/17 79

80 désaturase et la lycopène β-cyclase. Les trois gènes correspondants ont été modifiés pour leur expression dans l'albumen et introduits dans le riz afin de compléter la voie de biosynthèse du β-carotène (figure 6.5). C'est un exemple intéressant d'ingénierie génétique pour deux raisons. En premier lieu, c'est l'introduction d'une nouvelle voie biosynthétique dans un tissu de plante transgénique. En second lieu, c'était impossible par sélection traditionnelle parce qu'on ne connaît aucune variété de riz produisant ces enzymes dans l'albumen. Les chercheurs ont utilisé deux gènes de jonquille et un de bactérie. L'introduction d'une voie biochimique sans perturbation du métabolisme normal peut échouer pour de multiples raisons. La production de quantités importantes de β-carotène dans la première forme de riz doré sans conséquences pour sa vitalité est impressionnante. On a aussi obtenu une seconde version produisant plus de β-carotène en remplaçant le gène originel de la phytoène synthétase de jonquille par celui du maïs. Au départ, le riz doré a été obtenu dans une institution publique en Suisse et il a été mis gratuitement à disposition sans engagements commerciaux. Depuis son origine, le riz doré a été amélioré par des groupes publics et privés, et ces formes améliorées sont également disponibles sans entraves commerciales. l'albumen. FIGURE 6.5 : Construction du riz doré. Le riz ne produit normalement pas les enzymes nécessaires à la synthèse du β- carotène dans l'albumen. On a ajouté trois gènes au génome du riz pour permettre l'expression de la voie du β-carotène dans l'albumen. On voit l'origine de ces gènes et la voie de synthèse du β-carotène. Le résultat est le riz doré, qui contient des taux plus élevés en β-carotène dans Production de médicaments dans les plantes L'utilisation médicinale des plantes remonte aux origines de l'histoire. Aux époques modernes, l'industrie pharmaceutique a commencé par isoler les molécules biologiquement actives des plantes. Cette approche a évolué à partir de 1897, quand la société Bayer a commercialisé l'acide acétylsalicylique, mieux connu sous le nom d'aspirine. Cette molécule était une forme synthétique de l'acide salicylique isolé de l'écorce du saule blanc. Depuis lors, la production des médicaments a été dominée par la synthèse organique plutôt que par l'isolement de produits végétaux. Les agents thérapeutiques utilisés dans la chimiothérapie du cancer, comme le taxol, la vinblastine et la vincristine font exception à cette tendance : tous sont des produits végétaux. Pour refermer la boucle de l'histoire, l'industrie cherche aujourd'hui à utiliser des plantes transgéniques pour produire des composés utiles. LCP OS 16/17 80