FORMATION CONTINUE- TECHNICIEN(NE) DE LABORATOIRE

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1 FORMATION CONTINUE- TECHNICIEN(NE) DE LABORATOIRE Mme le Docteur Rosine BAURIAUD MCU-PH Hôpital RANGUEIL - TOULOUSE - 1 -

2 1. Définitions Généralités P L A N Diarrhées infectieuses 2. Diagnostic différentiel Pathologies responsables de diarrhée aiguë Diarrhées : lésionnelles - malabsorption motrices - sécrétoires Infectieuses : parasitaires - fungiques - virales 3. Physiopathologie 4. Flore physiologique intestinale 1. Circonstances cliniques 2. Prélèvements transports 3. Examen direct La coproculture Analyse bactériologique des selles 4. Ensemencement - routine. adulte. enfant - notion de voyage - malade sous traitement antibiotique - TIAC - recherche de portage - coproculture quantitative (malade hémato-oncologique) 5.Milieux 6.Culture identification - Sensibilité aux antibiotiques Traitement Bactéries pathogènes : Entérobactéries Salmonella Shigella Yersinia enterocolitica E. Coli Vibrio cholerae Aeromonas Campylobacter modification de la flore : Clostridium difficile Klebsiella oxytoca Virales Parasitaires Diarrhées infectieuses - 2 -

3 Diarrhées infectieuses 1. Définition Une diarrhée est définie par des émissions quotidiennes trop fréquentes de selles trop abondantes, liquides ou pâteuses (poids supérieur à 300 gr/j). En pratique, on parle de diarrhée lorsqu il y a plus de trois selles molles ou liquides par jour. La diarrhée aiguë dure en général moins de 8 à 10 jours. Elle est précédée d un transit normal et ne récidive pas à court terme. La diarrhée chronique dure en général des mois ou des années. Un syndrome dysentérique est défini par des excrétions glaireuses et sanglantes pouvant ne pas contenir de matières fécales. Il s y associe habituellement des épreintes et une sensation de ténesme. Les symptômes d une toxi-infection alimentaire sont une diarrhée liquidienne, des douleurs abdominales, des vomissements, parfois de la fièvre. L évolution est le plus souvent bénigne et spontanément résolutive en quelques jours. La diarrhée aiguë peut se définir comme une modification brutale de la fréquence et/ou de la consistance des selles évoluant depuis moins de 3 semaines. Généralités Les infections du tractus digestif se manifestent par divers syndromes regroupés sous le terme de diarrhées infectieuses aiguës. Ces infections représentent l une des plus grandes causes de morbidité et de mortalité dans le monde (zone tropicale du tiers-monde). La prévalence des diarrhées aiguës varie en fonction de la saison, de la localisation géographique, du groupe d âge et des conditions d hygiène. Dans le tiers-monde, les diarrhées aiguës sont responsables de 5 à 10 millions de milliers de morts par an et représentent la première cause de mortalité infantile. En milieu occidental ou industrialisé, leur incidence (un épisode par adulte et par an en France) en fait toujours un problème majeur de santé publique. La mortalité est très basse, limitée aux malades fragilisés par leur âge ou des co-morbidités). L origine est trouvée dans 50 % des cas. En effet, en pays développé et sur terrain sain, ce sont des maladies courtes, bénignes, guérissant spontanément, sans qu un diagnostic étiologique ne soit utile. Par contre, il existe des formes sévères, importantes à reconnaître pour proposer un traitement adapté. Diarrhées infectieuses : un des motifs de consultations les plus fréquents en médecine générale. L incidence connaît des fluctuations importantes selon les périodes de l année. Habituellement revêtent un caractère aigu (infection principale cause) mais aussi chronique (chez immunodéprimé). Interrogatoire minutieux : voyage, âge patient, terrain immunodéprimé, mode de vie, existence de cas identiques, délai d incubation, aspect de la diarrhée, les signes associés, la prise de médicaments des 5 jours précédents. Tous les épisodes diarrhéiques ne sont pas infectieux. Toutes les diarrhées infectieuses ne sont pas bactériennes (virus, parasites). Toutes les diarrhées bactériennes ne sont pas dues à une bactérie infectieuse spécifique. En effet dans certains cas, c est un dysmicrobisme (déséquilibre dans la flore normale) qui est à l origine de la diarrhée

4 2. Diagnostic différentiel des diarrhées infectieuses Diarrhée aiguë - colites inflammatoires, maladie de Crohn - rectocolite hémorragique - colites ischémiques - colites d origine tumorale - intoxications par les champignons, toxines végétales diverses (algues, moules) Diarrhée chronique Certaines pathologies responsables de diarrhée aiguë peuvent être à l origine de diarrhée chronique. Les principales causes sont : - diarrhée lésionnelle - cancers, lymphomes - polypose diverticulite - maladies inflammatoires du tube digestif - lésions ischémiques - diarrhée par malabsorption - certaines causes citées ci-dessus - maladie cœliaque - résection intestinale - maladie de Whipple (agent infectieux : Tropheryma whippelii) - amylose - insuffisance pancréatique - insuffisance en sels biliaires - gastrectomie et vagotomie - ischémie intestinale chronique - diarrhée motrices - neuropathies - hyperthyroïdie - diarrhées sécrétoires - tumeur endocrine - prise de laxatifs irritants - adénome villeux hyper sécrétant 3. Physiopathologie Diarrhée bactérienne 1- Invasion muqueuse et/ou production d une cytotoxine. Dans ce cas, la diarrhée aiguë est liée à la pénétration des microorganismes dans les cellules de l épithélium intestinal et/ou à la production d une cytotoxine. L atteinte siège principalement au niveau de l iléon distal et du colon. Cette invasion est souvent responsable d un syndrome dysentérique et de lésions muqueuses macroscopiques (iléite et/ou colite). Les souches qui en sont responsables, après une étape de colonisation (facultative) envahissent l épithélium intestinal. Elles peuvent : - soit se multiplier au sein de l entérocyte et créer des ulcérations de la muqueuse (colique) entraînant un syndrome dysentérique. Entrent dans ce cadre : Shigella, E. coli entéro-invasifs («Shigella like») et probablement Yersinia et - 4 -

5 Campylobacter. L activité entéro-invasive est sous le contrôle d un plasmide codant la synthèse des substances responsables de la lyse tissulaire. L élaboration des toxines, inconstante, peut également intervenir ; - soit simplement traverser des entérocytes et coloniser les ganglions ; c est le cas des Salmonella responsables des fièvres typho-paratyphoïdiques ; ou se multiplier dans la sous-muqueuse (Salmonella responsables des gastro-entérites). Bactéries invasives - Salmonella. invasion. traversée de la muqueuse. pénétration dans la sous muqueuse. multiplication, macrophages dans les formations lymphoïdes (plaques de Peyer). inflammation et exsudation liquidienne. dissémination possible et localisations secondaires - Shigella, E. coli invasif. plasmide de virulence. pénétration. multiplication. mouvement, dissémination horizontale. destruction de la muqueuse : sang, pus et mucus dans les selles. pas de passage au-delà de lamina propia. pas de dissémination ni de localisation extra intestinale. 2- Production d une entérotoxine ou adhésion entérocytaire Une diarrhée hydro électrolytique peut être liée à une entérotoxine qui stimule l adénylcyclase membranaire et provoque une sélection d électrolytes et d eau. Il n existe dans ce cas ni lésion muqueuse histologique, ni bactériémie. Les souches bactériennes adhèrent à la muqueuse, se multiplient sans pénétrer dans les cellules et élaborent des toxines qui provoquent sur les entérocytes des altérations fonctionnelles réversibles et transitoires, sans modifications morphologiques, et dont le résultat est la sortie d eau et d électrolytes dans la lumière du tube digestif. C est le syndrome cholérique, de localisation essentiellement entérique, caractérisé par l abondance et la fréquence des selles, trop liquides, trop aqueuses. C est le cas de Vibrio cholerae, des Escherichia coli entérotoxinogènes (ECET). Production d entérotoxine : Vibrio cholerae E. coli - propriété d adhésion - prolifération jejunum iléon - production d entérotoxine. protéique. de type A B. récepteurs cellulaires (gangliosides). activation de l adénylate cyclase. augmentation de l AMP C intracellulaire. perte eau et électrolytes. émission selles abondantes, aqueuses, incolores eau de riz - 5 -

6 . déshydratation rapide - Vibrio cholerae : gène chromosomique - Escherichia coli : toxine LT, gène plasmidique 3- Diarrhée et antibiotiques La pathogénie des diarrhées associées au traitement antibiotique n est pas parfaitement connue. Certaines souches bactériennes peuvent être responsables de diarrhée par leur simple prolifération (Clostridium difficile, Klebsiella oxytoca). Le mécanisme donc le mieux documenté est la modification de l écosystème bactérien, qualitative ou quantitative. L action directe de l antibiotique, ces mécanismes ont été plus rarement mis en cause et restent discutés : - toxicité de produits pour la muqueuse intestinale (amoxicilline/acide clavulanique/clindamycine) - lésions pariétales du grêle avec atrophie villositaire et chélation des sels biliaires (aminosides et polypeptides) - modification des échanges hydroélectrolytiques (clindamycine) - accélération de la motricité intestinale (macrolides). Facteurs de risque liés à l antibiotique : - spectre large comprenant la flore commensale, anaérobies et entérobactéries - présence d un cycle entérohépatique - faible absorption digestive - voie d administration orale - voie d élimination biliaire - dose et durée de traitement élevées - polyantibiothérapie 4- Toxi-infection alimentaire Pouvoir pathogène Etiologie Ingestion de toxines bactériennes, conséquence de l ingestion d une toxine produite par les bactéries lors de leur séjour dans l aliment avant ingestion, la prolifération in vivo ne jouant aucun rôle. Staphylocoque doré : charcuterie, pâtisseries, laitages, glaces.) Bacillus cereus : produits insuffisamment réfrigérés après leur cuisson

7 4. Analyse de la flore physiologique intestinale Flore et écosystème intestinal 40 % du poids des selles est constitué par des microorganismes. 1 ml du contenu du gros intestin contient 10 fois plus de germes qu un ml de sang ne contient de globules rouges. Les espèces anaérobies strictes concernent plus de 99 % des bactéries fécales cultivables. On qualifie de flore normale ou encore autochtone endogène, résidente, physiologique, saprophyte, les espèces présentes de façon constante dans l écosystème et capable de s y multiplier

8 La flore intestinale La flore intestinale se caractérise par une grande densité et diversité et est implantée essentiellement au niveau colique. Elle contient bactéries par gramme de matière fécale et renferme plus de 400 espèces différentes dont la très grande majorité est anaérobie stricte. La flore intestinale représente un réel écosystème, établissant des liens étroits avec les épithéliums digestifs et le système immunitaire qui leur est associé (gut associated lymphoid tissue, GALT). La flore digestive participe en outre à un certain nombre d activités fonctionnelles et interfère avec la digestion et l absorption de certains nutriments. Entre l âge de 1 et 2 ans, l enfant acquiert une flore intestinale identique à celle de l adulte. La composition de la microflore demeure relativement stable au cours de la vie, mais est très variable d un individu à l autre en fonction notamment des habitudes alimentaires. L équilibre de la flore intestinale participe à réguler le transit intestinal, à empêcher la pénétration d antigènes hostiles et à éviter la pullulation de germes pathogènes. Cet équilibre est perturbé par des troubles organiques (inflammation de la muqueuse intestinale) ou troubles fonctionnels hépatiques et pancréatiques ainsi que par des facteurs exogènes (malnutrition, immuno-suppression et antibiothérapie). La perturbation de l équilibre entraîne une colonisation par des germes atypiques et une augmentation de la perméabilité intestinale. Les rôles de la flore physiologique intestinale sont les suivants : - contribution au développement de la muqueuse et de l immunité intestinale - Résistance à la colonisation par des germes pathogènes (barrière) résultant d effets mécaniques, métaboliques et d actions sur le milieu (p. ex acidification) Véritable barrière vis-à-vis de l implantation et de la prolifération de germes pathogènes. Conditionne l établissement et la maturation du système immunitaire intestinal. - Modulation du métabolisme de la muqueuse intestinale Action sur les produits de sécrétion endogène Action sur les nutriments Modifications qualitatives du contenu digestif (ph) Action sur le métabolisme de certains médicaments Production de vitamines (B (B 1, B 2, B 6 et B 12 ) et de vitamine K. - Modulation de la motricité intestinale Modifications de l anatomie du TD Modifications histologiques Modifications du transit intestinal Énergétique cellulaire Rapports entre la flore autochtone et la muqueuse intestinale. Dans le domaine de la pathologie, l adhérence de certains microorganismes aux tissus de l hôte est une étape d importance primordiale et nécessaire à la colonisation de ces tissus. L adhérence s effectue par l intermédiaire d adhésines, structures agéniques de surface, se présentant sous forme de filaments appelés «fimbriae» susceptibles de se lier à des récepteurs spécifiques sur les membranes cellulaires

9 Pour la flore autochtone, les données sont plus imprécises. Les bactéries semblent simplement incluses dans le mucus et pour quelques unes sans rapport particuliers avec la muqueuse. Rupture d équilibre de la flore et de l écosystème intestinal - facteurs liés au terrain : déficit immunitaire, congénitaux ou âgés, malnutrition, prématurité - facteurs exogènes : changement d alimentation, stress,. - les antibiotiques La vitesse de circulation, le nombre de globules rouges dans le sang, la vitesse de vidange stomacale peuvent être perturbés par l absence de flore. Ecologie La TD est un lieu privilégié pour la sélection et l émergence de bactéries résistantes potentiellement pathogènes au cours de l administration de traitements antibiotiques. La flore intestinale joue un rôle important de réservoir de gènes codant pour la résistance aux antibiotiques. Flore digestive Estomac, duodénum, intestin grêle proximal, peu de bactéries ( bact/gr) lactobacilles et streptocoques. Diversité, abondance s accroissent dans l iléon avec prédominance des espèces anaérobies strictes. Colon : densité la plus forte 10 9 /10 11 bact/gr, 400 à 500 espèces différentes. L analyse de la flore reflète la composition de la flore intraluminale. Des bactéries sont également présentes dans le mucus qui recouvre l épithélium intestinal. Abondante et variée. Bactéries anaérobies (10 10 à /gr de selles) Bacteroïdes (B. fragilis à gram -) Fusobacterium (à gram -) Bifidobacterium (à gram +) Clostridium (à gram +) Bactéries aéro-anaérobies facultatives ( ) Entérobactéries coliformes : E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Proteus Enterococcus : E. faecalis Lactobacillus - 9 -

10 Germes obligatoires et passagers mis en évidence par une analyse de routine de la flore physiologique intestinale et valeurs de tolérance Germes aérobies Germes microaérophiles Germes résidents Germes passagers Valeurs de tolérance (norme) Exprimés en CFU E. coli E. coli atypiques : 10 5 lactose négatif hémolytique Enterococcus spp Autres entérobactéries : 10 5 Klebsiella spp. Proteus spp. Enterobacter spp. Citrobacter spp. Autres germes : 10 4 Pseudomonas spp. Bacillus spp. Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Lactobacillus spp Germes anaérobies Champignons CFU = colony forming units ; Bactéroïdes Prevotella Porphyromonas Bifidobacterium spp. Clostridium spp Levures : Candida sppm. Saccharmomyces spp. Moisissures : Geotrichum spp. Lucor spp. Aspergillus. Remarques : - chez le nourrisson élevé au lait maternel, le nombre de Bacteroïdes est sensiblement diminué - Le nombre de Clostridium spp. est généralement augmenté avec les personnes âgées

11 Signification des espèces microbiennes dans le contexte de l écologie intestinale Escherichia coli E. coli a été longtemps considéré comme la bactérie intestinale la plus importante. Cependant E. coli représente moins de 0,1% de la masse bactérienne du colon, la majorité de la flore étant constituée par les germes anaérobies stricts. Autres entérobactéries Il existe au moins une trentaine d espèces d entérobactéries en provenance de l alimentation. Enterococcus spp Les entérocoques font partie de la flore obligatoire et résidente du colon et de l intestin grêle. Certaines souches sont présentes dans des aliments fermés. Autres bactéries aérobies Pseudomonas spp, Bacillus spp, Staphylococcus spp et Streptococcus spp sont des germes de passage. La colonisation intestinale par ces germes peut être intermittente, mais peut aussi être le signe d une perturbation de la barrière intestinale. - Pseudomonas aeruginosa peut être à l origine de diarrhées chez l enfant. - Bacillus cereus peut produire une entérotoxine qui est à l origine de diarrhées aqueuses. - Certaines souches de Staphylococcus aureus produisent des entérotoxines qui provoquent des gastro-entérites aiguës. Lactobacillus Les lactobacilles font partie de la flore obligatoire résidente de l intestin grêle, du colon, de la cavité buccale et du vagin. Bacteroïdes Prevotella Porphyromonas Parmi ces trois espèces, ce sont essentiellement les Bacteroides spp qui colonisent l intestin, ils constituent la fraction la plus importante de la flore résidente et jouent un rôle important dans la résistance à la colonisation. Bifidobacterium spp Ils constituent une fraction importante de la flore intestinale obligatoire résidente avec une tendance à la diminution chez les personnes âges. Chez le nourrisson alimenté au lait maternel, les bifidobactéries représentent avec 10 9 à CFU/g la population bactérienne dominante vers la fin de la première semaine de vie. Clostridium spp Clostridium spp fait partie de la flore résidente du colon et est un germe de l environnement (sol). Clostridium spp ne semble pas exercer une fonction utile à l écologie du système intestinal. L augmentation en nombre chez l adulte est souvent le signe d une malabsorption, de troubles digestifs ou de malnutrition. Levures et moisissures Les levures et moisissures sont uniquement des germes de passage au niveau des intestins

12 La coproculture : Analyse bactériologique des selles 1/ Circonstances cliniques et épidémiologiques Contextes classiques : Adulte ou enfant de + de 2 ans et contexte par défaut : Salmonella, Shigella, Camphylobacter, Y. enterocolitica (si diarrhéique) Enfant de moins de 2 ans : Salmonella, Shigella, Camphylobacter, Y. enterocolitica (si diarrhéique) + E. coli entéropathogène EPEC Contextes particuliers : Notion de voyage récent en pays tropical : Salmonella, Shigella, Campylobacter, Y. enterocolitica (si diarrhéique), Aeromonas hydrophila, Pleisiomonas shigelloides, Vibrio cholerae, E. coli 0157 et autres producteurs de vérotoxine (EHEC), E. coli entérotoxigènes (ETEC) Malade sous traitement antibiotique, suspicion de colite pseudo-membraneuse : Clostridium difficile, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Toxi-infection alimentaire collective (TIAC) : Salmonella, Shigella, Camphylobacter, Y. enterocolitica (si diarrhéique), Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, C. perfringens, (Cl. botulinum). Syndrome hémolytique et urémique (SHU) : E. coli 0157 et les autres producteurs de vérotoxine (EHEC). Syndrome cholériforme : Salmonella, Shigella, Campylobacter, Y. enterocolitica (si diarrhéique), Vibrio cholerae, Aeromonas hydrophila, Plseisiomonas shigelloïdes. Recherche portage BMR : BLSE, SAMR, entérocoque vanco R. Portage chez personnel de restauration 2/ Prélèvements Types - échantillon de selles : - soit selles liquides, molles, glaireuses ou hémorragiques - soit selles solides : indications précises dans ce cas - écouvillonnage : pour les enfants, les nourrissons, jamais pour recherche de C. difficile - biopsie rectale ou colique sous endoscopie, jamais pour recherche de C. difficile Fréquence - 3 prélèvements à 1 jour d intervalle, surtout si portage à éliminer. Ne pas souiller par les urines. Transport : - pour C. difficile, acheminement rapide au laboratoire, si attente mettre à 4 C moins de 24 heures - si attente > 24 h, il faut congeler les selles rapidement pour conserver la toxine B - pour la culture, la bactérie est revivifiable à partir de selles conservées plusieurs semaines à 4 Les selles sont recueillies dès leur émission dans un récipient propre. Un échantillon (mucopurulent ou sanglant) si possible du volume d une noix est prélevé à l aide d une spatule ou d un flacon-cuillère, puis transféré dans un pot à vis hermétique. Un écouvillonnage rectal peut être utile, notamment chez le nourrisson et le petit enfant

13 Acheminement : Le prélèvement doit être immédiatement acheminé au labo ou conservé au maximum 12 heures à 4 pour éviter la dessiccation et la prolifération des bactéries et levures commensales. Au-delà de ce délai on doit utiliser un milieu de transport (glycérine tamponnée). 3/ Examen direct Examen macroscopique Selles solides, semi solides, pâteuses, liquides, muco-purulentes, glaireuses, fécales, afécales, Examen microscopique A l état frais, ou après coloration Il est rarement utilisé. - Après coloration, l examen du frottis permet d apprécier le pourcentage des deux types de bactéries. Une flore équilibrée est majoritairement composée de bacilles à Gram négatif mais avec toujours présence de bacilles à Gram positif. - Permet de déceler hématies, cellules desquamées, polynucléaires. Toutefois dans certaines diarrhées à bactéries invasives la présence de leucocytes n est pas toujours constatée. - Parfois présence de bactéries mobiles : Vibrion du choléra Campylobacter 4/ Ensemencement Adulte Sans renseignements cliniques (ou pour recherche de portage) : BCP Rambach 37 Sélénite Milieu pour Campylobacter : atmosphère spéciale Si diarrhée, renseignements cliniques, selles liquides, en plus ajouter : Milieu Clostridium Shoedler + 4 disques céfoxitine Mueller Hinton (oxydase positive, Aeromonas) Enfant - méconium : gélose au sang acide nalidixique gélose chocolat BHI - < 1 mois : BCP Rambach Sélénite Campylobacter Acide nalidixique BHI Mueller Hinton (oxydase + Aeromonas) - + disque céfalotine (Yersinia) - > 1 mois BCP Rambach Campylobacter Sélénite Clostridium Mueller Hinton + disque Recherche de Vibrio cholerae A l ensemencement classique ajouter un TCBS, une gélose alcaline, une eau peptonée alcaline

14 Coproculture quantitative (services d hématologie oncologie) 0,1 gr de selles ou 0,1 ml dans 10 ml d eau physiologique faire dilutions Ensemencement 1. dilution 2 (1 colonie = 10 3 ) sur Bile-Esculine-Azide (BEA), BEA + Vanco Drigalski Chapman Sabouraud Cetrimide Clostridium 2. dilution-4 ( 1colonie = 10 5 ) sur BEA 3. dilution-6 ( 1 colonie = 10 7 ) sur gélose Drigalski Faire antibiogramme sur : Entérobactérie Bacille pyocyanique Staphylocoque doré 5/ Milieux Gélose Rambach (isolement et identification rapide des Salmonella) La composition du milieu de culture différentiel proposé par Rambach est la suivante : - propylène glycol (10 g) - peptone (5 g) - extrait de levure (2 g) - désoxycholate de sodium (1 g) - rouge neutre (0,03 g) - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-d-galactopyranoside (0,1 g) - gélose (15 g) - eau distillée (1 l) Seules les Salmonella spp métabolisent le propylène glycol en formant des acides qui, combinés à l indicateur de ph donnent aux colonies une couleur rouge vif caractéristique et spécifique. Mises à part Salmonella Typhi, Salmonella Para-typhi A et certains sérovars rares qui ne métabolisent pas le substrat, la gélose Rambach doit permettre de différencier sans ambiguité les Salmonella spp des autres bactéries à Gram négatif y compris les Proteus spp. Sur ce nouveau milieu, les coliformes se développent sous la forme de colonies bleu ou bleu-vert, témoins de la production d une ß-galactosidase. Les autres entérobactéries donnent des colonies incolores. Les colonies de Pseudomonas aeruginosa sont roses. Toutes les colonies lisses, régulières, d environ 2 à 3 mm de diamètre, à centre rouge vif et à bord incolore voir rose pâle après 18 à 24 h d incubation à 38 C sur gélose Rambach ont été identifiées comme Salmonella. Milieu lactose-glucose-h 2 S (ou milieu de Hajna-Kligler) (commercialisé sous forme déshydratée ou prête à l emploi) Ce milieu complexe permet de confirmer la fermentation du glucose (caractère d identification de famille, avec ou sans production de gaz) et d orienter l identité du genre par l étude de l attaque du lactose et de la production d H 2 S. Ce milieu permet encore d effectuer le test ONPG et de rechercher la LDC. Il est présenté en position inclinée avec un culot important de 3 cm environ. Dans le culot (en anaéobiose relative), le glucose est toujours attaqué par voie fermentative et, bien qu il soit en proportion faible, son attaque entraîne une acidification importante. Selon la voie de fermentation empruntée, il y a ou non

15 production de gaz (H 2 ou CO 2 ). Plus ou moins abondants, ces derniers peuvent entraîner seulement la formation de quelques bulles ou, au contraire, créer une poche qui décolle complètement le milieu du fond du tube. Que le lactose soit ou non attaqué, l acidification produite suffit toujours à faire virer au jaune l indicateur de ph. Sur la pente (en aérobiose), le glucose est attaqué surtout par voie oxydative. L acidification produite sera donc faible, d autant plus, rappelons le que la quantité de glucose présente dans le milieu est faible. Si la bactérie ne peut que métaboliser le glucose (cas des microbes lactose-négatifs), la dégradation des acides aminés, très active en aérobiose et entraînant la formation de produits alcalins, va neutraliser la pente qui, après 24 heures d incubation, apparaîtra rouge. Au contraire, les bactéries lactose-positives, oxydant et fermentant les quantités importantes de lactose présentes dans le milieu, acidifieront suffisamment pour que l alcalinité due au métabolisme protéique n interfère pas, en 24 h, la pente apparaîtra donc jaune (teinte du rouge de phénol à ph acide). Par ailleurs, la réduction du thiosulfate en anaérobiose par certaines entérobactéries se traduira par la formation de sulfure de fer noir en présence du nitrate ferrique. B.E.A. (gélose Bile-Esculine-Azide) Elle est utilisée pour la différenciation des streptocoques du groupe D de Lancefield, lorsqu ils sont associés à d autres bactéries dans les produits pathologiques. Les streptocoques des autres groupes, les staphylocoques et la plupart des bacilles Gram négatif ne cultivent pas sur ce milieu. Les colonies de streptocoques de groupe D de Lancefield sont petites, translucides et entourées d un halo noir (esculine positive). Seules les Listeria donnent des colonies semblables qui peuvent prêter à confusion. Il est donc indispensable d identifier les bactéries suspectes. Sur ce milieu, les streptocoques des autres groupes sérologiques sont en général inhibés. Les staphylocoques ne sont que partiellement inhibés mais leurs colonies sont souvent plus grandes, opaques et sans halo noir. Certaines levures et de rares entérobactéries peuvent aussi cultiver, leurs colonies produisent parfois un léger brunissement du milieu qui ne peut être confondu avec le halo franchement noir produit par les streptocoques D. Milieux pour identification de Campylobacter Btuzler : bacitracine novobiocine céfazidine colistine cycloheximide Skirrow : vancomycine polymixine triméthoprime Blaser : vancomycine polymixine triméthoprime céphalotine amphotéricine

16 6. Culture Identification Sensibilité aux antibiotiques - traitement Bactérie pathogènes Entérobactéries La plupart des bactéries appartenant à la famille des entérobactéries (1937) sont : - des bacilles à Gram négatif ne formant pas de spore - à ciliature péritriche (sauf Klebsiella, Shigella et Yersinia pestis qui sont immobiles) - se développant en aéro anaérobiose - cultivant sur milieux ordinaires - utilisant le D. glucose et autres sucres par fermentation souvent avec production de gaz - elles sont catalase (+) sauf Shigella dysenteriae sérotype 1 et oxydase (-) - elles réduisent les nitrates en nitrites - contiennent un Ag commun, Ag de Kunin ou ECA (enterobacterial common antigen) et possèdent un GC % compris entre 39 et 59 %. Dans la plupart des cas, elles se développent sous forme de colonies rondes lisses à bords réguliers d un diamètre de 2 à 3 mm dès 18 heures d incubation à 37 C. Certaines colonies sont muqueuses (présence d une capsule ou non). L identification est basée sur l étude de caractères biochimiques complétés ou non par une étude sérologique. Caractères antigéniques Les entérobactéries possèdent différents antigènes : - Un antigène commun dénommé ECA (pour Enterobacterial Common Antigen) ou antigène de Kunin. Cet antigène n existe que chez les entérobactéries et, de ce fait, a un intérêt taxonomique. Sa présence chez les Yersinia a permis d inclure ce genre dans la famille des entérobactéries. - Les antigènes O ou somatiques correspondent aux polyosides fixés sur les lipopolysaccharides (LPS). Ils sont thermostables et résistent à l alcool. Les bactéries portant des antigènes O sont agglutinées par les anticorps correspondants ; les agglutinats sont fins, lents à se constituer et difficilement dissociables par agitation (agglutination «corps à corps»). Comme les autres bactéries Gram -, la paroi des entérobactéries est recouverte d une membrane externe dont le feuillet externe est constitué du LPS. Certaines mutations affectent le core et/ou l Ag O et l on distingue : - mutants R (Rough) = colonies rugueuses - colonies S (Smooth) = colonies lisses (bactéries non mutées, possédant l Ag O). La structure de l Ag O est très variable d une espèce à l autre et au sein d une même espèce, d où le sérogroupage (E. coli, Salmonella). - L antigène R correspond au polysaccharide du core central. La disparition de l antigène O le démasque et rend les souches «rough» (colonies rugueuses) autoagglutinables dans l eau physiologique, plus sensibles aux substances bactéricides du sérum, plus facilement phagocytées et donc moins pathogènes. - Les antigènes H ou flagellaires n existent que chez les souches mobiles. Constitués de protéines spécifiques dénommées flagelline, ils sont thermolabiles et inactivés par l alcool. Ils provoquent une agglutination floconneuse (accolement des

17 bactéries par leurs flagelles), rapidement constituée mais facilement dissociable par agitation (rupture des flagelles). - Les antigènes de surface comprenant : a) les antigènes K, capsulaires, de nature polysaccharidique. Chez les Escherichia coli, les Shigella ou chez certaines Salmonella et Citrobacter (alors appelés Vi), ils masquent l agglutination par les anticorps anti O qui peut être restituée après chauffage de la souche car ils sont détruits par ébullition. b) Les antigènes d adhérence ou adhésines de nature protéique, portés par des pili communs (encore appelés fimbriae). Salmonelles Responsables de 40 à 80 % des TIAC et de 10 à 15 % des diarrhées du voyageur. Incubation de 8 à 36 heures, vomissements, douleurs abdominales, diarrhée aqueuse et fièvre qui dure 2 à 5 jours. Peut aussi se présenter sous forme de gastroentérites sporadiques ou épidémiques ou d une diarrhée glairo-sanglante avec une colite ulcérée. Les Salmonella mineures sont avant tout des parasites du tube digestif de l homme et des animaux. Les sérotypes qui, contrairement aux précédents, n ont pas de spécificité d hôte, sont dits ubiquitaires. Après la maladie, certains sujets restent porteurs sains et éliminent pendant plusieurs mois des Salmonella dans leurs selles. Les Salmonella sont retrouvées dans le milieu extérieur. Des Salmonella sont aussi fréquemment retrouvées dans les farines de poisson ou poudres d os utilisées pour l alimentation des animaux. La contamination de l homme se fait par voie buccale. a) S. Typhimurium est rencontrée dans tous les pays. Elle est la plus souvent identifiée au Centre National des Salmonella de l Institut Pasteur. Elle est isolée chez l homme, chez les animaux et dans l environnement. b) S. Typhimurium occupe la première place dans l étiologie des toxi-infections alimentaires. Pratiquement toutes les denrées peuvent héberger quelques Salmonella ; mais les denrées d origine animale jouent le rôle principal. c) Depuis 1987, la fréquence d isolement de S. enteritidis augmente fortement pour être en 1989 le deuxième sérovar le plus fréquemment isolé chez l homme. Cette flambée d infection à S. enteritidis est préoccupante et correspond dans la majorité des cas à la consommation d œufs de poule. Les salmonelloses purement digestives Les toxi-infections alimentaires à Salmonella se manifestent par des diarrhées, de la fièvre et des vomissements. Les premiers signes surviennent 8 à 10 heures après l ingestion de l aliment contaminé. L évolution de ces gastro-entérites est en règle générale spontanément favorable en quelques jours. Les entérites à Salmonella s observent principalement chez le jeune enfant. Des épidémies peuvent survenir dans des collectivités de nourrissons. La fréquence des entérites à Salmonella au cours du S.I.D.A. est à noter. Les formes extra digestives Elles sont plus rares : infections urinaires, cholécystites, méningites, ostéomyélites, spondylodiscites, infections pulmonaires. Ces formes surviennent plus volontiers chez des malades immunodéprimés. Les déficits enzymatiques des globules rouges et la drépanocytose sont des circonstances favorisantes

18 Centre national des Salmonella et Shigella Unité des entérobactéries, Institut Pasteur. Note relative à la nouvelle classification des Salmonella (1987). Deux espèces génétiques ont été individualisées dans le genre Salmonella : Salmonella enterica (la plus fréquente) qui est subdivisée en 6 sous-espèces (subsp.) : S. enterica subsp. entérica, S. enterica subsp. Salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae et S. enterica subsp. indica. Salmonella bongori (très rares). L identification des espèces et sous-espèces se fait sur la base de caractères biochimiques. À l intérieur de ces espèces et sous-espèces, les souches peuvent être différenciées par la sérotypie (antigène O, H et Vi). Salmonella enterica subsp. enterica renferme la majeure partie des sérotypes de Salmonella isolés chez l homme et les animaux à sang chaud. Exemples : La nomenclature pour le sérotype Typhimurium est : Salmonella enterica subsp. enterica sérotype Typhimurium ou plus simplement : Salmonella sérotype Typhimurium. La nomenclature pour le sérotype Typhi est : Salmonella enterica subsp. enterica sérotype Typhi ou plus simplement : Salmonella sérotype Typhi. Identification des Salmonelles des gastro-entérites Caractères communs aux entérobactéries : en API 20E : lactose (-) ; ONPG (-) ; H2S (+) ; ODC (+) ; urée (-) ; TDA (-) ; indol (-) ; VP (-) ; citrate (+) ; gaz (+) Classification sérologique Elle est basée sur la détermination, par agglutination sur lame, des antigènes O, H et Vi. Il existe plus de sérovars, mais avec un nombre limité de sérums agglutinants, tout laboratoire peut typer la majorité des souches de Salmonella qu il isole. Le typage de sérovars rares nécessite l intervention d un laboratoire de référence. Antigènes O La spécificité de chacun des 67 antigènes O répertoriés est déterminée par sa composition, c est-à-dire par la structure des polysaccharides de la paroi bactérienne. - Les formes R. Ce sont des mutants, non pathogènes, qui ont perdu par délétion une grande partie de la chaîne polysaccharidique responsable de la spécificité O. Ces souches ne sont plus sérotypables et sont auto-agglutinables dans de l eau physiologique. - Les formes T (de transition). Ces souches sont rares. Elles donnent des colonies ayant l aspect S, mais elles ont perdu leur spécificité O, comme les formes R. - Les bactériophages dits convertisseurs. Ils peuvent par lysogénie produire des modifications de la structure antigénique O des Salmonella. Les facteurs antigéniques O qui sont liés à une conversion phagique peuvent être présents ou absents. Ils sont soulignés dans le tableau de Kauffmann-White

19 Antigènes H Les flagelles sont constitués d une molécule protéique, la flagelline, dont la composition en acides aminés détermine le type antigénique H. Cette composition est codée par un gène de structure H 1 pour la phase 1 et un gène H 2 pour la phase 2. Certains sérotypes sont monophasiques. ILs ne peuvent synthétiser de la flagelline que d une seule spécificité. La plupart des sérotypes sont diphasiques. Ils peuvent synthétiser des antigènes H soit de la phase 1, soit de la phase 2. Les antigènes de la phase 1 sont désignés par des lettres : a, b, c z. Comme l alphabet n y suffisait pas, les plus récemment reconnus sont désignés par un z suivi d un nombre. Les antigènes de la phase 2 sont désignés par des chiffres. Inversion de phase. Lorsque dans une culture, la majorité des bactéries est par exemple en phase 1, la quantité d antigènes de la phase 2 est trop faible pour être détectée. L inversion de phase consiste à ensemencer la souche dont la phase 1 est connue dans une gélose molle en présence de sérum correspondant à cette phase 1. Seules les bactéries qui ne sont pas immobilisées par ce sérum, donc qui sont de l autre phase, peuvent migrer dans la gélose molle et être recueillies à distance du point d ensemencement. Cette population entièrement constituée de bactérie en phase 2 est utilisée pour la détermination de la deuxième phase. Cette technique est connue sous le nom de méthode de Sven- Gard. Antigènes Vi a) Ce polyoside capsulaire n est trouvé que de façon inconstante chez trois sérotypes : S. typhi, S. Paratyphi C, S. Dublin. b) Les souches Vi + qui produisent une quantité importante d antigène Vi sont O- inagglutinables. Elles deviennent habituellement O-agglutinables après un chauffage à 100 C qui fait passer l antigène Vi dans le surnageant. Le tableau de Kauffmann-White Ce tableau indique pour chaque sérovar les antigènes O, Vi et H dont la détermination est utile pour le typage sérologique. À chaque sérovar correspond une formule antigénique. Par exemple : S. Virchow : 6,7 : r : 1,2. Dans ce tableau, les sérovars qui ont des antigènes O communs caractéristiques sont rassemblés pour former un groupe O désigné par une lettre A, B, C, D etc. Exemple : les sérovars du groupe B ont tous l antigène O4 et ceux du groupe D, l antigène O9. À l intérieur de chaque groupe O, les sérovars apparaissent d après l ordre alphabétique de la phase I de leur antigène H. Sensibilité aux antibiotiques Traitement Un antibiogramme est effectué sur toute souche de Salmonella isolée autant pour caractériser cette souche que pour orienter le traitement antibiotique qui n est pas systématique pour toutes les salmonelloses digestives. Entérites et toxi-infections alimentaires : Seules les formes sévères chez le nourrisson ou chez le vieillard sont traitées par les antibiotiques. Dans les autres cas où le pronostic est favorable, un traitement symptomatique suffit

20 Porteurs sains Les personnes qui, au décours de la maladie, continuent d éliminer des Salmonella dans leurs selles ne doivent pas être traitées par les antibiotiques. Ceux-ci sélectionnent des souches résistantes et sont sans action sur la durée du portage. Seules des mesures d hygiène sont à préconiser. Les Shigelles : hier et aujourd hui Les Shigelles sont des entérobactéries strictement adaptées à l Homme. Ce sont les agents étiologiques de la dysenterie bacillaire ou shigellose, responsables de 10 à 20 % des cas de maladies intestinales sévères dans le monde. Dans les régions tempérées, la dysenterie bacillaire se limite en général à une diarrhée modérée suivie d un syndrome dysentérique bénin. Dans les pays en voie de développement des régions chaudes à bas niveau d hygiène, l infection souvent endémique se manifeste en général par une dysenterie aiguë qui peut être fatale, surtout si elle est causée par Shigella dysenteriae 1 ou bacille du Shiga. Les enfants de 1 à 5 ans représentant la cible principale de la shigellose. Responsables de grandes épidémies d armée en campagne ou de camps (réfugiés, prisonniers). 4 à 30 % d isolement de gastro-entérites sporadiques, de rares gastro-entérites épidémiques survenues après ingestion d eau ou d aliments souillés ou par contamination inter humaine. Le tableau clinique est typiquement un syndrome dysentérique franc et fébrile, mais il peut s agir d une diarrhée sans fièvre. Quelques dates dans l histoire de la dysenterie bacillaire La dysenterie bacillaire a pu jouer un rôle dans notre histoire, aussi bien médicale que militaire, maritime ou coloniale, comme le montrent les quelques exemples suivants, rapportés dans l ordre chronologique Van Swieten, premier médecin de la Reine de Hongrie, avait décrit en français en 1761 un livre, imprimé à Amsterdam, intitulé «Description des maladies des Armées avec la méthode de les traiter». Dans le chapitre consacré à la dysenterie, il en décrit avec précision les signes cliniques, il note que les selles dysentériques contiennent souvent du sang. Quant au traitement, en plus de l inévitable saignée en faveur à cette époque, il prescrit de réhydrater les dysentériques avec de l eau tiède ou de l eau de millet, de les alimenter avec du riz et de calmer leurs douleurs avec des pilules d opium Une grave épidémie de dysenterie frappa cette année-là les provinces de l ouest de la France. Le nombre des morts fût estimé à (pour 27 millions d habitants) A la bataille de Valmy, le 10 septembre 1792, les troupes prussiennes furent vaincues, non seulement par les soldats de Dumouriez et de Kellermann, mais aussi par la dysenterie Le navigateur Dumont d Urville, qui découvrit la Terre Adélie, accomplie dans les mers australes son dernier voyage autour du monde, qui fut un succès scientifique, mais au prix de pertes humaines assez lourdes à cause de la dysenterie Dans ses Mémoires, Pasteur Vallery-Radot rappelle que Calmette, désigné par Pasteur pour être le premier directeur de l Institut Pasteur de Saïgon, n y séjourna que peu de temps, car il fut rapidement rapatrié sanitaire à

21 cause d une dysenterie, contractée en Cochinchine, alors qu il venait de commencer l étude des venins de serpent Julien Dumas, qui fut directeur du Grand Cours de Microbiologie de l Institut Pasteur, fut affecté en 1914 au laboratoire central de bactériologie des Armées. Il reconnut bien vite que, dans la plupart des cas, la «diarrhée des tranchées» s identifiait à la dysenterie bacillaire. Actualité des Shigella Sources 99 % des souches de Shigella présentent un tropisme digestif et sont isolées de selles humaines : selles afécaloïdes, glaireuses, muco-sanglantes ; dans la phase aiguë de la shigellose, on observe au microscope, outre de nombreux leucocytes, une culture presque pure de bacilles à Gram négatif. Lorsque des aliments ou des échantillons d eau sont contaminés par des shigelles, l homme est toujours à l origine de la contamination. Les réservoirs de shigelles d origine non humaines sont exceptionnels. Les épidémies sont dues, dans les pays en voie de développement, à S. dysenteriae type 1 (Sd1) ou bacille de Shiga, particulièrement menaçant, à S. flexneri et à S. sonnei. Les shigelloses sont endémo-épidémiques en Asie et dans le sous-continent indien : Bengladesh, Inde, Pakistan. On estime à 91 millions et à respectivement le nombre annuel des épisodes à Shigella et de décès dus à cette maladie en Asie, dus le plus souvent à S. flexneri ou S. sonnei. Le taux d incidence médian de diarrhée sanglante en Afrique est estimé à 10,2/ habitants. La cible principale est l enfant de moins de 5 ans, rarement atteint avant 6 mois s il est nourri au lait maternel, le vieillard, la femme enceinte et le sujet immunodéprimé. Physiopathologie Les shigelles sont des bactéries entéro-invasives, capables de pénétrer dans les cellules épithéliales de la muqueuse du côlon et de s y multiplier avec formation d abcès et d ulcération. Shiga-toxine Connue depuis 1903 chez S. dysenteriae 1, elle est localisée dans l espace périplasmique de la bactérie et libérée lors de la lyse de la bactérie. C est une toxine protéique de 70 kda, codée par des gènes chromosomiques. Vérotoxine Différentes espèces bactériennes produisent une toxine caractérisée par son pouvoir cytotoxique pour les cellules Véro. Cette toxine très voisine de la Shiga-toxine a été trouvée : - chez des souches de E. coli - chez d autres espèces bactériennes Pouvoir entéro-invasif Le pouvoir entéro-invasif est en relation avec la présence de plasmides communs aux différentes espèces de Shigella et aux E. coli entéro-invasifs. La maladie humaine est la conséquence de l invasion de la muqueuse du côlon. Ceci entraîne une forte réaction inflammatoire provoquant abcès et ulcération du colon et l apparition de sang et de mucus dans les selles. L infection est limitée à la muqueuse sans traverser la lamina propria

22 Pouvoir pathogène chez l Homme Il existe des formes intermédiaires entre le syndrome dysentérique aigu et des manifestations diarrhéiques assez banales. Les shigelloses surviennent surtout à la période estivo-automnale (septembreoctobre). La durée de l incubation varie entre 12 heures et 3 jours, les troubles intestinaux persistent entre 3 et 5 jours : fièvre en général inférieure à 39 C, crampes abdominales, nombreuses selles afécaloïdes, glaireuses, mucosanglantes, purulentes. L isolement est en régression sous nos climats. En France, le plus grand nombre de souches est reçu en septembre-octobre. Cela s explique par la température estivale et les retours de vacances en pays exotiques. S. sonnei est la plus souvent isolée. S. flexneri vient ensuite. S. dysenteriae et S. boydii sont rarement isolées en France. Dans les pays en voie de développement, la shigellose endémique est due avant tout à S. flexneri. Génétique du pouvoir pathogène Facteurs de pathogénicité Toutes les souches potentiellement pathogènes de Shigella et d E. coli entéroinvasif (ECI) hébergent un plasmide de virulence, différent selon les espèces, mais génomiquement apparenté. Ce plasmide et 3 gènes chromosomiques sont indispensables à l expression complète de la virulence. Identification Caractères bactériologiques communs à toutes les Shigella Outre les caractères généraux des Enterobacteriaceae, les souches appartenant au genre Shigella ont toutes les caractères communs suivants : immobiles (bouillon en phase exponentielle pas de culture sur milieu au citrate de Simmons absence de LDC et de tryptophane-désaminase fermentation du glucose sans gaz (exceptions avec certains biotypes de S. flexneri 6 et S. boydii 13 et 14 jamais de production d H 2 S Caractères généraux des Shigella qui sont tous des caractères négatifs : lactose, H 2 S, LDC, VP, uréase phénylalanine désaminase, gélatinase, citrate Simmons, acétate de Trabulsi. Les colonies suspectes [lactose (-) et H 2 S (-)] sont l objet d une caractérisation plus complète. Il importe de faire le diagnostic différentiel entre les Shigella et les «Alkalescens-dispar» qui sont des E. coli immobiles et ne produisant pas de gaz. Sérotypie ou typage sérologique d une souche Ce n est qu une fois le diagnostic de genre Shigella établi avec certitude que le typage antigénique peut être entrepris par agglutination sur lame. Caractères de chaque espèce Les quatre espèces du genre Shigella se distinguent entre elle par des caractères biochimiques et des caractères antigéniques, basés sur l étude des antigènes O polysaccharidiques

23 - S. dysenteriae = sous-groupe A Cette espèce est caractérisée par l absence de fermentation du manitol. Il existe 10 sérotypes. S. dysenteriae type 1 ou bacille de Shiga possède ne bêtagalactosidase très active, est indole (-) et, fait rare chez les Enterobacteriaceae, ne possède pas de catalase. - S. flexneri = sous-groupe B Cette espèce comporte 6 sérotypes et 2 variants. - S. boydii = sous-groupe C Cette espèce comporte 18 sérotypes. - S. sonnei = sous-groupe D Il n existe qu un seul sérotype. S. flexneri S. dysenteriae S. boydii S. sonnei Mannitol +/ ODC Indole D D D - ONPG - -/+ -/+ d d : variable suivant les sérotypes ou les biotypes pour S. donnei +/- positif avec la majorité des sérotypes -/+ négatif pour la majorité des sérotypes * S. flexneri : indole + pour les sérotyupes 3, 4 et 5 indole pour les sérotypes 1, 2 et 6. *S. dysenteriae sérotype 1 est : catalase (-) et possède une ß-galactosidase très active (ONPG + en moins d une heure). Diagnostic différentiel Il se pose essentiellement avec : les Escherichia coli, biotypes Alcalescens-dispar (AD) : qui sont immobiles et atazogènes. Pousse sur acétate Trabulsi de E. coli. L hybridation quantitative de l ADN montre que les espèces du genre Shigella (sauf Shigella S. boydii sérotype 13) et E. coli font partie du même groupe génomique. Sensibilité aux antibiotiques - Traitement Les Shigella sont irrégulièrement sensibles aux antibiotiques. Cependant, rappelons que c est au cours d une épidémie de shigellose que les plasmides de résistance multiple transférable ont été découverts au Japon. Aussi, aujourd hui, le traitement doit être guidé par les résultats d un antibiogramme. a) Intérêt du traitement antibiotique des infections à Shigella : diminuer le portage et la contagion, la durée des symptômes, le risque de complications. b) Une évolution du traitement : depuis plusieurs années, des souches de Shigella sonnei résistantes aux aminopénicillines et au cotrimoxazole (traitement recommandé jusqu à présent) ont émergé et sont devenues prédominantes. c) Chez l enfant : l azithromycine devient un traitement de choix. La ceftriaxone, administrée par voie parentérale, peut difficilement être considérée comme un traitement de première intention. Les quinolones ne sont à envisager qu en dernière intention ; seule la ciprofloxacine peut être recommandée. d) Chez l adulte : la ciprofloxacine et l ofloxacine peuvent être recommandées en première intention pour une durée de 3 jours

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