Méthodes chr h o r m o at a o t g o r g a r p a h p i h qu q e u s e

Transcription

1 Méthodes chromatographiques

2 DEFINITION La chromatographie, méthode d'analyse physico-chimique, sépare les constituants d'un mélange (les solutés) par entraînement au moyen d'une phase mobile (liquide ou gaz) le long d'une phase stationnaire (solide ou liquide fixé), grâce à la (ré)partition sélective des solutés entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile).

3 Définition (suite) Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase.

4 Classification On peut classer les méthodes chromatographiques d'après la nature des supports utilisés ou celle des phénomènes mis en oeuvre dans la séparation

5 Classification selon le support (phase fixe ou mobile) La phase solide, la silice ou alumine traitées, permettent la séparation des composants des mélanges grâce à leurs propriétés adsorbantes. Ils peuvent être employés: comme remplissage d'une colonne (chromatographie par gravité et chromatographie à haute performance ou HPLC) étalés en couche mince sur une plaque de verre, d'aluminium ou sur une feuille de matière plastique (chromatographie sur couche mince ou CCM) La phase mobile est appelée gaz vecteur ou gaz porteur : Chromatographie en phase gazeuse

6 Classification d'après la nature des phénomènes de séparation On distingue cinq types de phénomènes : chromatographie d'adsorption chromatographie de partage chromatographie ionique chromatographie d'exclusion chromatographie d'affinité

7 Chromatographie d adsorption Elle est illustrée par la séparation chromatographique classique, sur colonne remplie ou sur couche mince, des composés moléculaires. Le principe de séparation est basé sur la différence de polarité des éléments entre les différentes phases

8 Ne pas confondre

9 chromatographie de partage Elle est fondée sur la différence de solubilité des substances à séparer dans deux fluides parfaitement miscibles. Elle est mise en pratique en chromatographie sur papier. Le facteur principal qui intervient est le coefficient de partage entre chaque phase. On peut séparer des solutés dont les coefficients de partage entre les deux phases sont différents

10 chromatographie ionique La phase stationnaire est un échangeur d'ions constitué par une résine porteuse de groupements ionisés négativement ou positivement, exerçant des interactions de type électrostatique avec les solutés ioniques du milieu

11 La chromatographie d'exclusion elle est encore appelée chromatographie d'exclusion-diffusion, tamisage moléculaire, gel-filtration, perméation de gel. La phase stationnaire est un solide poreux : les grosses particules sont exclues de la phase fixe, en revanche les petites particules incluses diffusent dans les pores du gel.

12 La chromatographie d'affinité La phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte, sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité biologique (bioaffinité) pour un soluté de l'échantillon à analyser (affinité enzyme-substrat, ligandrécepteur, antigène-anticorps).

13 Applications en Biochimie clinique: chromatographie sur couche mince Définition : La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes d'adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d'une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semirigide de matière plastique ou d'aluminium. Après que l'échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant.

14 Applications en Biochimie clinique: chromatographie sur couche mince Appareillage la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche. la phase stationnaire : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice ou d'un autre adsorbant est fixée sur une plaque de verre à l'aide d'un liant comme le sulfate de calcium hydraté (plâtre de Paris) l'amidon ou un polymère organique. l'échantillon : environ un microlitre (µl) de solution diluée ( 2 à 5 %) du mélange à analyser, déposé en un point repère situé au-dessus de la surface de l'éluant. l'éluant : un solvant pur ou un mélange : il migre lentement le long de la plaque en entraînant les composants de l'échantillon.

15 Applications de la chromatographie en Biochimie clinique CCM Séparation et révélation des acides aminés par la ninhydrine

16 Chromatographie en phase gazeuse (CPG) Définition La CPG ou CPV (chromatographie en phase vapeur ) est une méthode d'analyse immédiate. Elle permet de séparer les constituants d'un mélange selon leur partage (par solution ou adsorption ) entre deux phases dont l'une est fixe ou stationnaire (solide ou liquide) et l'autre mobile et gazeuse (gaz vecteur).

17 Chromatographie en phase gazeuse (CPG) : appareillage L'appareil de CPV comporte un élément essentiel la colonne. Celle ci est un tube d'acier ou de cuivre de 1/8 pouce de diamètre et de 1à 3 m de long. La phase stationnaire y est placée déposée en une pellicule recouvrant des microbilles d'un support inerte, (silice, Téflon, brique pillée etc..). La phase mobile sera ici de l'hélium: bombe de 20 l sous 200 bars.

18 CPG : schéma

19 CPG: chromatogramme C'est la courbe donnant la concentration des produits sortant de la colonne (effluents) en fonction du temps ou du volume de gaz vecteur débité. Généralement cette courbe est une courbe de type gaussien (pic). Le premier pic est, uniquement avec un détecteur à catharomètre, le pic de l'air, inévitablement injecté avec le mélange inconnu. Il correspond au volume de gaz de la colonne car l'air n'est pas retenu par la phase stationnaire.

20 CPG: chromatogramme Le pic d'un composé quelconque se caractérise par: Le temps de rétention (tr) La largeur du pic à mi-hauteur, l1/2 La hauteur, h L'aire, A. On l'assimile souvent à un triangle S = h. l1/2 Le temps de rétention réduit est égal à la différence d'abscisses entre le composé et l'air, il est directement lié au cœfficient de partage du composé entre les phases mobile et stationnaire.

21 CPG: chromatogramme

22 Chromatographie Liquide Haute Principe Performance (HPLC)

23 HPLC

24 HPLC en BC Etudes des Hb ( fichier démo) - Recherches des Hémoglobines anormales - Dosage de l Hb glyquée