TP de biochimie. TPN 6 : Chromatographie de partage sur papier. Gherib A sma ème Année Biologie Tronc Commun LMD - Université Mentouri 1-

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Bertrand Jacques Paris
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1 TP de biochimie TPN 6 : Chromatographie de partage sur papier Gherib A sma ème Année Biologie Tronc Commun LMD - Université Mentouri 1-

2 Table des matières Objectifs 3 I - TP N 06 CHROMATOGRAPIE DE PARTAGE SUR PAPIER 4 1. Aspects généraux MATERIEL ET REACTIFS : PREPARATION DU CHROMATOGRAMME :... 6 Questions de synthèse 8 Abréviations 9 Bibliographie 10

3 Objectifs -Apprendre à utiliser les outils de laboratoire. -Connaître les notions de base des oses (chiralité, énantiomères et stéréoisomères...). -Identifier un ose inconnu grâce à des réactions chimiques spécifiques. -Calculer l'indice acide d'un corps gras (huile végétale). -Identifier les acides aminés à partir des réactions colorimétriques. -Calculer les constantes de dissociation d'un acide aminé : PK et Phi. -Apprendre la manipulation de la chromatographie de partage liquide-liquide. 3

4 TP N 06 CHROMATOGRAPIE DE PARTAGE SUR PAPIER TP N 06 CHROMATOGRAPIE DE PARTAGE SUR PAPIER I Aspects généraux 4 MATERIEL ET REACTIFS : 5 PREPARATION DU CHROMATOGRAMME : 6 Objectifs -Apprendre la manipulation de la chromatographie de partage liquide-liquide. 1. Aspects généraux La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successive sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase. On définit un coefficient de partition K. On peut classer les méthodes chromatographiques d'après la nature des phases utilisées ou celle des phénomènes mis en œuvre dans la séparation. 4

5 TP N 06 CHROMATOGRAPIE DE PARTAGE SUR PAPIER 1.1. Nature des phases: -Phase fixe: La phase fixe peut être solide ou liquide. Les solides, silice ou alumine traitées, permettent la séparation des composants des mélanges grâce à leurs propriétés adsorbantes. Ils peuvent être employés comme remplissage d'une colonne (chromatographie par gravité et chromatographie à haute performance ou HPLC) ou étalés en couche mince sur une plaque de verre, d'aluminium ou sur une feuille de matière plastique (chromatographie sur couche mince ou CCM). La phase fixe peut aussi être constituée par un liquide imprégnant un support solide ou encore par une chaîne carbonée fixée sur un support (phase greffée). Ainsi en chromatographie sur papier, technique retenue pour ce TP, la phase fixe est formée par l'humidité que les molécules de cellulose du papier adsorbent, alors qu'en chromatographie en phase gazeuse, elle est constituée d'un liquide peu volatil et thermiquement stable imprégnant un granulé poreux. -Phase mobile: La phase mobile est: Soit un gaz (ex: chromatographie en phase gazeuse): la phase mobile est appelée gaz vecteur ou gaz porteur. Soit un liquide (ex: chromatographie sur papier, couche mince ou colonne): la phase mobile est appelée éluant. Types de chromatographie : On distingue plusieurs types de chromatographie parmi lesquelles on distingue : - Chromatographie d'adsorption. - Chromatographie de partage. - Chromatographie ionique. - Chromatographie d'exclusion. Chromatographie de partage : Elle est fondée sur la différence de solubilité des substances à séparer à travers deux phases non miscibles. Elle est mise en pratique en chromatographie sur papier. Un des fluides est un liquide retenu sur un support inerte ( dans ce cas c'est l'humidité, toujours présente dans le papier même s'il apparaît sec) et constitue la phase stationnaire. L'autre, liquide «solvant organique» en déplacement, constitue la phase mobile ou «l'éluant». Le facteur principal qui intervient est le coefficient de partage «> RF*» entre chaque phase. On peut séparer des solutés dont les coefficients de partage entre les deux phases sont différents. Les plus solubles dans la phase mobile se déplacent plus facilement que ceux qui le sont moins. Avant le passage du solvant (appelé développement du chromatogramme), on dépose sur le papier une goutte d'échantillon à analyser. Lorsque le développement est achevé, on sort le papier (appelé chromatogramme), on le sèche et on révèle, c'est-à-dire qu'on fait apparaître par un procédé de taches (dites spots), les diverses molécules qui ont été séparées sont caractérisées par des rapports frontaux qui permettent de les identifier dans un système donné. RF= Distance parcourue par le soluté/distance parcourue par le solvant 2. MATERIEL ET REACTIFS : - Cuve à chromatographie.- Etuve à dessiccation.- Papier whatman N 1.- Règle plate.- Crayon.- Solutions d acides aminés à 10g/l ( >, >, >, >, > Ala* et > Gly* Phé* Asp* Lys* Tyr* ).- Solvant Butanol : acide acétique : eau 1 :1 :1 : V/V- Révélateur à la ninhydrine (R1) et R2=sulfate de nickel (6,25g) + H2OD QSP : 100ml.- Pulvérisateur.- Micro pipette de 10 µl. 5

6 TP N 06 CHROMATOGRAPIE DE PARTAGE SUR PAPIER 3. PREPARATION DU CHROMATOGRAMME : - Préparer une feuille de Cm. - Tracer la ligne de dépôt au crayon à environ 2,5 à 3 Cm du bord de la feuille. - Indiquer 6 points correspondants à l'emplacement des acides aminés à des distances égales à 2 ou 2,5 Cm (voir schéma 1). - Déposer l'échantillon à l'aide de la micro pipette ou d'une pipette pasteur.il faudrait 2 gouttes pour chaque dépôt en séchant après chaque dépôt.- Sécher à l'aide d'un séchoir à air chaud chaque goutte. - Placer la feuille dans la cuve à chromatographie contenant le mélange (butanol : acide acétique :eau)(v/v/v 1 :1 :1) à une hauteur de 1 à 1,5 Cm (Schéma 1). - Recouvrir et suivre le développement du chromatogramme. - Sécher le chromatogramme dans une étuve à 70 C ou aux secs cheveux. - La révélation : -Pulvériser la feuille de Ninhydrine. -La laisser ensuite 10mn à l'étuve à 70 C. - Résultats : - Entourer au crayon les spots révélés (colorés) au crayon. - Indiquer le plus exactement possible leur centre. - Déterminer le Rf du spot de chaque AA témoin. - Déterminer le Rf du spot obtenu avec l'aa inconnu -Identifier le. (Remarque : L'AA inconnu pourrait être en réalité 2 ou 3 AA) Dispositif expérimental de la chromatographie sur papier 6

7 TP N 06 CHROMATOGRAPIE DE PARTAGE SUR PAPIER Référence Chromatogramme 7

8 Questions de synthèse Questions de synthèse -Rédiger un compte rendu. -Déterminer le peptide ou l'aa inconnu à partir du chromatogramme que vous avez préparez. 8

9 Signification des abréviations Abréviations RF : Rapport frontal Ala : Alanine Gly : Glycine Phé : Phényl alanine Asp : Acide aspartique Lys : Lysine Tyr : Tyrosine 9

10 Bibliographie Bibliographie Pr. Meziani Z.(2009).Recueil de travaux pratiques de biochimie.département de Biochimie Lecoq R.(1965). Manuel d'analyses alimentaires et d'expertises usuelles Tome1 Edition DION.DEREN et Cie. AUDIDIE.C.L.,Fagerella.J.ZONSZAIN.F (1984). Manipulations d'analyses biochimiques. Edition Fec. Et DOC. Lavoisier. Paris DUBOIS. M. Gilles K.A HAMILTON. J.K REBERS. P.A ; SMIT.F.(1956) : Colorimetric method of determination of sugars and related substances. Anal.Chem.28 DURAN :(1979) VERRERIE de laboratoire édition SCHOTT. MAINZ ROGER.F : Les industries des corps gras Biochimie-Extraction-Raffinage p ;

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