ETUDE COLLABORATIVE DE COMPARAISON DE L ACIDITE VOLATILE ET DE L ACIDE ACETIQUE DANS LES VINS

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1 ETUDE COLLABORATIVE DE COMPARAISON DE L ACIDITE VOLATILE ET DE L ACIDE ACETIQUE DANS LES VINS Réalisée sous l égide de l union des Œnologues de France Coordinateur : Laboratoires Dubernet 9, quai d Alsace Narbonne Par définition, l acidité volatile est constituée par les acides appartenant à la série acétique qui se trouvent dans le vin à l état libre et à l état salifié. Il est communément admis que l acide acétique constitue la très grande majorité de l acidité volatile, et que les autres acides de la série acétique, dont les plus significatifs sont l acide formique, l acide propionique et l acide butyrique, constituent une part minoritaire. Les acides de la série acétique, autres que l acide acétique, sont produits sur les raisins et la vendange, par les levures, champignons et bactéries qui peuvent s y développer. Dans ce cas, de l acide acétique est également produit. Les augmentations d acidité volatile pendant la vinification et la vie du vin sont exclusivement dues aux levures et aux bactéries lactique et acétique qui ne produisent alors que de l acide acétique. L évolution et la modernisation des techniques de laboratoire ont amené au développement de méthodes d analyses de type moléculaire, 1. OBJET DE L ÉTUDE comme, par exemple, le dosage du glucose et du fructose qui remplace progressivement l analyse des sucres réducteurs. C est aussi le cas de l analyse de l acide acétique. Ce développement du dosage de l acide acétique amène plusieurs questions : Quelle est précisément la part de l acide acétique dans l acidité volatile des vins? Quelle typologie d écart peut-on attendre entre un dosage d acidité volatile et un dosage d acide acétique sur des vins? Peut-on remplacer un dosage d acidité volatile par un dosage d acide acétique? Cette étude a pour but d apporter des éléments de réponse à la première question. La seconde question reste d ordres administratif et règlementaire. Cette étude a été réalisée de façon collaborative par plusieurs laboratoires d œnologie, équipés pour le dosage de l acidité volatile par méthode de référence, et pour le dosage de l acide acétique par méthode enzymatique. Les laboratoires ont été sélectionnés pour leur pratique régulière de ces méthodes sous accréditation. Le choix d une étude dans un cadre interlaboratoire et dans celui de l accréditation est primordial : Des études menées à partir des travaux d un seul laboratoire ne permettent pas d apporter en toute rigueur des conclusions généralisables à l ensemble des laboratoires. 2. MÉTHODE Le cadre strictement contrôlé de laboratoires accrédités apporte les garanties de raccordement des résultats au système international d unités. La méthode du dosage enzymatique de l acide acétique n est pas, à ce jour, une méthode «normalisée». Il existe même deux principes enzymatiques différents (acétate kinase, et acétyl Co-A synthétase). Par conséquent, la mise en œuvre de l étude dans un cadre de l accréditation est requise pour garantir et reconnaître la compétence des laboratoires pour ces méthodes non normalisées (comme prévu dans la norme ISO 17025, 5.4.4). 3. ÉTUDE DE L EFFET PARAMÈTRE SUR 19 VINS ISSUS DE DIFFÉRENTES RÉGIONS FRANÇAISES 3.1 MATÉRIEL ET MÉTHODE 19 vins ont été analysés pour les deux paramètres, acidité volatile et acide acétique, dans les laboratoires participants à l étude. Ces vins sont les suivants : 5 vins Languedoc-Roussillon, 5 vins Bourgogne, 5 vins Bordeaux, 4 vins liquoreux bordelais. Les vins ont été analysés avec 2, voire 3 répétitions, dans les différents laboratoires. Dans certains cas, les laboratoires n ont procédé qu à la détermination d un seul des deux paramètres. - AC ACaS = Détermination de l acide acétique par voie enzymatique, principe «Acétyl CoA Synthétase», méthode automatisée. Les calibrants utilisés sont des solutions synthétiques d acide acétique. Les calculs statistiques, dans cette première, réalisent la moyenne des résultats des laboratoires pour chaque paramètre, puis comparent ces deux séries de 19 moyennes obtenues. Cette mise en œuvre des données a pour objectif de minimiser l effet méthode et mettre en évidence autant que possible «l effet paramètre», c'est-à-dire le biais théorique entre l acidité volatile et l acide acétique. 3.2 RÉSULTATS Les méthodes employées sont les suivantes : - EV + Titr = Détermination de l acidité volatile par entraînement à la vapeur + Tritration. Correction du So 2, correction de l acide sorbique le cas échéant. Protocole OIV. - AC AK = Détermination de l acide acétique par voie enzymatique, principe «Acétate Kinase», méthode automatisée. Les calibrants utilisés sont des solutions synthétiques d acide acétique. L ensemble des résultats, exprimés en g.l -1 de CH 3 COOH, est consigné dans le tableau 1 (voir tableau 1, annexe 1, page 4 et le graphique 1, annexe 2, page 5) : L écart moyen global entre les deux paramètres est le suivant (= AV AC) : Ecart moyen Md Ecart type des écarts Sd 0,003 0,015 Article technique RFOE n 221, page 1

2 3.3 DISCUSSION L écart moyen (Md) entre les deux paramètres est très faible et non statistiquement significatif. Pour un analyste, cet écart est également non significatif au regard des incertitudes types (k=1) des méthodes de détermination de ces paramètres qui se situent communément dans les laboratoires autour de 0,02 g.l -1 (exprimé en CH 3 COOH) pour les valeurs basses (0,1 à 0,6 g.l -1 (exprimé en CH 3 COOH)), et autour de 0,04 g.l -1 (exprimé en CH 3 COOH), pour les valeurs plus fortes. L écart type des écarts (Sd) reste faible et montre que les différences moyennes entre les paramètres se situent dans une fourchette de +/ g.l -1 dans 95 % des cas. Il n y a aucun écart supérieur à 0,029 g.l -1 sur les vins étudiés ici, y compris sur les vins liquoreux issus de vendange botrytisés. 4. ÉTUDE DES ACIDES FORMIQUE, PROPIONIQUE ET BUTYRIQUE 4.1 OBJET Nous avons recherché la présence des acides formique, propionique et butyrique dans les 19 vins étudiés. 4.2 MATÉRIEL ET MÉTHODE Le distillat obtenu lors du dosage de l acidité volatile selon la méthode de référence OIV est analysé par électrophorèse capillaire pour la détermination de l acide formique, de l acide propionique et de l acide butyrique. Cette analyse a été réalisée dans un seul laboratoire, disposant du matériel adéquat. L électrophorèse capillaire employée est un appareil de type MDQ system de Beckman Coulter. L analyse de ces acides par électrophorèse capillaire n est pas possible sur un vin brut car l échantillon doit être dilué avant analyse pour limiter le bruit de fond. Dans ce cas, leurs teneurs se situent en dessous des seuils de détection. En purifiant l échantillon, la distillation permet à la fois de limiter fortement la dilution nécessaire et de diminuer le bruit de fond, ainsi elle rend possible le dosage de teneurs faibles en acides volatils. Les seuils de quantification suivants ont été établis : Acide Formique Acide Butyrique Acide Propionique 4.3 RÉSULTATS Limite de détection mg.l -1 meq.l -1 g.l -1 en CH3COOH Limite de quantification mg.l -1 meq.l -1 g.l -1 en CH3COOH4 3,3 0,07 0, ,22 0,013 3,3 0,04 0, ,11 0,007 3,3 0,04 0, ,14 0,008 Les résultats en italique sont entre les seuils de quantification et de détection. Ces résultats ne doivent pas être considérés comme des valeurs absolues mais comme des teneurs comprises dans l échelle [LD-LQ]. Les valeurs ont été converties en g.l -1 eq CH 3 COOH pour le confort de l interprétation. Formique Propionique 1 Languedoc 1 0,012 0,009 2 Languedoc 2 0,006 nd 3 Languedoc 3 0,008 nd 4 Languedoc 4 0,007 nd 5 Languedoc 5 0,006 nd 6 Bourgogne 1 0,009 nd 7 Bourgogne 2 0,012 nd 8 Bourgogne 3 0,036 nd 9 Bourgogne 4 0,008 nd 10 Bourgogne 5 0,032 nd 11 Bordeaux 1 0,023 nd 12 Bordeaux 2 0,009 nd 13 Bordeaux 3 0,015 nd 14 Bordeaux 4 0,015 nd 15 Bordeaux 5 0,022 nd 16 Liquoreux 1 0,008 nd 17 Liquoreux 2 0,014 nd 18 Liquoreux 3 0,036 nd 19 Liquoreux 4 0,056 nd Il n a pas été relevé la présence d acide butyrique au-dessus du seuil de détection dans aucun échantillon. Les teneurs en acide formique et en acide propionique restent faibles, au maximum égales au niveau d incertitude des méthodes acidité volatile et acide acétique. Il est intéressant de comparer la valeur d acide formique + propionique avec les écarts «acidité volatile acide acétique». Cette comparaison peut se faire ainsi graphiquement : (voir graphique 2, annexe 2, page 5) Il n y a pas de corrélation observable entre les deux grandeurs. Les écarts «acidité volatile acide acétique» ne sont pas individuellement expliqués en pratique par la présence de l acide formique et de l acide propionique, même si ces derniers sont de nature à générer un biais théorique. 5.1 OBJET 5. ÉTUDE DE LA TYPOLOGIE DES ÉCARTS ENTRE LES DEUX MÉTHODES Établir la typologie d écart entre les deux méthodes, et déterminer le niveau d incertitude du aux effets paramètre et aux effets méthode. 5.2 MATÉRIEL ET MÉTHODE Les mêmes données de comparaison interlaboratoire sur les 19 vins mentionnés plus haut sont employées pour cette étude. Cependant, l approche statistique est ici différente car elle considère les résultats individuellement de façon à mettre en évidence les «effets méthode». Aussi ne sont retenues que les lignes de résultats où un même laboratoire a effectué à la fois le dosage de l acidité volatile et le dosage de l acide acétique sur le même vin. 5.3 RÉSULTATS (voir graphique 3, annexe 3 page 6, et tableau 4 annexe 4, page 7) 5.4 TYPOLOGIE DES ÉCARTS En l absence de biais moyen significatif, il se confirme que les écarts observés individuellement sont liés essentiellement à l effet méthode, c'est-à-dire à l addition des incertitudes des méthodes de l acidité volatile et de l acide acétique. Article technique RFOE n 221, page 2

3 L étude de la variance des résultats obtenus ici donne un écart-type d effet méthode suivant : ET variance méthode acidité volatile : 0,019 g.l -1 (exprimé en CH 3 COOH) ET variance méthode acide acétique : 0,014 g.l -1 (exprimé en CH 3 COOH) ET Effet méthode combiné : 0,023 g.l -1 (exprimé en CH 3 COOH). Remarque : Cet ET effet méthode combiné est la composante majoritaire de l ET des écarts obtenu dans le paragraphe précédent (0,029). La différence entre les deux valeurs d écart type s explique par la présence d autres effets secondaires (effet prise d échantillon, etc.). En toute rigueur, il convient de rajouter le biais moyen pour obtenir l incertitude d écart entre les deux déterminations. Celui-ci étant faible, il n a que peu de répercutions sur le résultats final. Biais moyen : 0,004 g.l -1 (exprimé en CH 3 COOH) ET incertitude des écarts : 0,024 g.l -1 (exprimé en CH 3 COOH). Ce résultat signifie que, si un laboratoire trouve un résultat X d acidité volatile, alors le même laboratoire trouverait un résultat de X +/- 0,048 g.l -1 (exprimé en CH 3 COOH) en acide acétique dans 95 % des cas, et dans la limite des types de vin et des niveaux de concentration de cette étude. 5.5 CONSÉQUENCE POUR L ÉTUDE DE VALIDATION INTRALABORATOIRE Un laboratoire qui procèderait à la comparaison des deux méthodes sur la base d une moyenne statistique de 10 échantillons pourrait alors attendre sur le biais moyen un écart-type théorique de 0, = 0,008 g.l -1 (exprimé en CH 3 COOH). Ceci signifie que le biais obtenu statistiquement sur la moyenne de 10 échantillons dans un laboratoire se situera dans la fourchette de 0,004 +/- 0,016 g.l -1 (exprimé en CH 3 COOH) dans 95 % des cas. Ceci peut se formuler de la façon suivante : Acidité volatile = Acide acétique + 0,004 (exprimé en g.l -1 de CH 3 COOH) avec une incertitude de +/- 0,016 g.l 1 Cette relation ne doit pas être considérée comme générale et absolue. Elle est valable dans le cadre de cette étude, pour les types de vins et pour les niveaux d acidité volatile considérés (<1 g.l -1 exprimé en CH 3 COOH) CONCLUSION Cette étude montre que, pour les vins étudiés, et dans les gammes de concentration étudiées, les écarts entre des résultats acidité volatile et acide acétique sont produits par les effets méthodes (incertitude des deux méthodes), et que l effet paramètre pouvant produire un biais théorique n est pas significatif dans la pratique. Elle a été réalisée pour alimenter les travaux du groupe de travail du COFRAC sur la question de l acidité volatile et de l acide acétique. Les laboratoires suivants ont travaillé pour cette étude : les laboratoires de la Chambre d Agriculture de la Gironde (Pauillac, Blaye, Grézillac, Cadillac, Coutras), le laboratoire du Centre œnologique de Bourgogne, le laboratoire Oenoconseil LR, et le laboratoire Dubernet. Article technique RFOE n 221, page 3

4 ANNEXE 1 Tableau 1 : Résultats exprimés en g.l -1 de CH3COOH Article technique RFOE n 221, page 4

5 ANNEXE 2 Graphique 1 : Comparaison acidité volatile acide acétique Graphique 2 : Écarts AV-AC en fonction des teneurs en acide Formique + Propionique Article technique RFOE n 221, page 5

6 Graphique 3 : Comparaison AV - Acétique Analyse ANNEXE 3 Graphique 4 : Représentation des écarts AV- Acétique par rapport à AV Ecart moyen Ecart type des écarts Md = 0,004 g.l -1 (exprimé en CH 3 COOH) Sd = 0,029 g.l -1 (exprimé en CH 3 COOH) L écart type est ici plus élevé que dans le première partie de l étude car il recouvre les effets méthodes de façon complète. On relève quelques résultats (3) où la valeur trouvée en acidité volatile est nettement plus élevée que la valeur en acide acétique. Ces résultats sont isolés, hiératiques, et statistiquement aberrants. Article technique RFOE n 221, page 6

7 Tableau 4 : ANNEXE 4 Laboratoire Vin Acidité volatile Acide Acétique Moyenne AV Moyenne AC Ecart AV-AC 1 0,41 0,4 0,42 0,41 0,405 0,415-0, ,46 0,46 0,47 0,43 0,460 0,450 0, ,63 0,63 0,64 0,61 0,630 0,625 0, ,78 0,76 0,76 0,74 0,770 0,750 0, ,97 1,01 1,01 1,01 0,990 1,010-0, ,25 0,24 0,22 0,21 0,245 0,215 0, ,39 0,38 0,37 0,35 0,385 0,360 0, ,48 0,48 0,49 0,48 0,480 0,485-0, ,71 0,71 0,73 0,74 0,710 0,735-0,025 Labo ,99 0,97 0,98 0,97 0,980 0,975 0, ,27 0,26 0,24 0,24 0,265 0,240 0, ,37 0,38 0,39 0,38 0,375 0,385-0, ,51 0,52 0,54 0,54 0,515 0,540-0, ,72 0,7 0,73 0,72 0,710 0,725-0, ,93 0,92 0,96 0,97 0,925 0,965-0, ,47 0,49 0,47 0,47 0,480 0,470 0, ,64 0,64 0,65 0,65 0,640 0,650-0, ,77 0,8 0,79 0,79 0,785 0,790-0, ,91 0,91 0,91 0,91 0,910 0,910 0, ,416 0,38 0,392 0,404 0,404 0,392 0,396 0,400-0, ,441 0,453 0,441 0,453 0,465 0,453 0,445 0,457-0, ,612 0,612 0,6 0,624 0,612 0,624 0,608 0,620-0, ,771 0,747 0,759 0,759 0,722 0,735 0,759 0,739 0, ,98 0,931 0,992 0,98 0,992 0,967 0,968 0,980-0, ,282 0,257 0,282 0,233 0,208 0,233 0,274 0,225 0, ,38 0,429 0,38 0,367 0,392 0,392 0,396 0,384 0, ,551 0,49 0,514 0,502 0,49 0,49 0,518 0,494 0, ,735 0,71 0,747 0,747 0,771 0,735 0,731 0,751-0,020 Labo ,98 1,041 0,967 0,992 0,992 0,992 0,996 0,992 0, ,294 0,318 0,282 0,233 0,257 0,233 0,298 0,241 0, ,404 0,416 0,416 0,392 0,38 0,367 0,412 0,380 0, ,576 0,6 0,576 0,514 0,551 0,514 0,584 0,526 0, ,759 0,698 0,722 0,71 0,698 0,71 0,726 0,706 0, ,967 0,931 0,943 0,918 0,918 0,955 0,947 0,930 0, ,514 0,502 0,551 0,465 0,49 0,502 0,522 0,486 0, ,637 0,637 0,71 0,661 0,661 0,661 0,661 0,661 0, ,796 0,771 0,771 0,784 0,82 0,784 0,779 0,796-0, ,894 0,918 0,918 0,943 0,943 0,955 0,910 0,947-0, ,453 0,453 0,48 0,47 0,453 0,475-0, ,527 0,527 0,56 0,56 0,527 0,560-0, ,661 0,661 0,69 0,69 0,661 0,690-0, ,759 0,759 0,8 0,8 0,759 0,800-0, ,004 1,004 0,98 0,97 1,004 0,975 0, ,269 0,233 0,25 0,26 0,251 0,255-0, ,416 0,416 0,42 0,42 0,416 0,420-0, ,551 0,551 0,55 0,55 0,551 0,550 0, ,759 0,759 0,78 0,77 0,759 0,775-0,016 Labo ,992 0,992 0,96 0,97 0,992 0,965 0, ,269 0,343 0,28 0,3 0,306 0,290 0, ,416 0,416 0,41 0,44 0,416 0,425-0, ,551 0,649 0,58 0,61 0,600 0,595 0, ,686 0,722 0,73 0,75 0,704 0,740-0, ,931 0,98 0,96 0,97 0,956 0,965-0, ,527 0,502 0,52 0,51 0,515 0,515-0, ,686 0,673 0,66 0,67 0,680 0,665 0, ,82 0,808 0,8 0,77 0,814 0,785 0, ,906 0,906 0,92 0,88 0,906 0,900 0, ,71 0,7 0,61 0,62 0,705 0,615 0, ,8 0,79 0,81 0,81 0,795 0,810-0, ,04 1,05 0,93 1,03 1,045 0,980 0,065 Labo ,6 0,57 0,478 0,49 0,585 0,484 0, ,64 0,66 0,624 0,624 0,650 0,624 0, ,82 0,81 0,796 0,808 0,815 0,802 0, ,93 0,94 0,943 0,943 0,935 0,943-0, ,367 0,367 0,392 0,38 0,367 0,386-0, ,465 0,465 0,465 0,465 0,465 0,465 0, ,588 0,6 0,637 0,624 0,594 0,631-0, ,722 0,735 0,771 0,771 0,729 0,771-0, ,2 0,2 0,22 0,22 0,200 0,220-0,020 Labo ,4 0,4 0,34 0,34 0,400 0,340 0, ,49 0,48 0,5 0,49 0,485 0,495-0, ,71 0,72 0,73 0,73 0,715 0,730-0, ,88 0,89 0,89 0,89 0,885 0,890-0, ,931 0,943 1,065 1,065 0,937 1,065-0,128 L échantillon 5 du laboratoire 7 a été enlevé car le résultat a été déclaré aberrant. Article technique RFOE n 221, page 7