Exploration du Profil protéique dans les liquides biologiques. Pr A. Galmiche,

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1 Exploration du Profil protéique dans les liquides biologiques Pr A. Galmiche,

2 Electrophorèse et exploration du Profil protéique sérique 1. L électrophorèse des protéines sériques: technique et interprétation 2. Pathologie non-tumorale 2.1. Le syndrome inflammatoire 2.2. Le syndrome néphrotique 2.3. Hépatopathies chroniques et autres sources d altérations 3. Pathologie tumorale 3.1. Rappels sur les Immunoglobulines 3.2. Les gammapathies monoclonales 3.3. Diagnostic biologique des gammapathies monoclonales: immunofixation des protéines sériques, dosage des CLL 3.4. Amylose

3 Réalisation de l électrophorèse 1. Prélèvement sur tube sec (si tube hépariné: fibrinogène en plus) 2. Coagulation et récupération sérum 3. Dépôt sur gel d agarose (ou techniques capillaires) 4. Electrophorèse 5. Le gel est coloré, séché, puis interprété

4 Séparation électrophorétique des principales protéines du sérum α1-antitrypsin α1-lipoprotein (HDL) α2-macroglobuline, caeruleoplasmine, haptoglobine Albumine transferrine, β-lipoprotein, β2 microglobuline Immunoglobulines

5 Electrophorèse des Protéines Sériques: profil normal α1 α2 β1 β2 γ-globulines

6 Electrophorèse et exploration du Profil protéique sérique 1. L électrophorèse des protéines sériques: technique et interprétation 2. Pathologie non-tumorale 2.1. Le syndrome inflammatoire 2.2. Le syndrome néphrotique 2.3. Hépatopathies chroniques et autres sources d altérations 3. Pathologie tumorale 3.1. Rappels sur les Immunoglobulines 3.2. Les gammapathies monoclonales 3.3. Diagnostic biologique des gammapathies monoclonales: immunofixation des protéines sériques, dosage des CLL 3.4. Amylose

7 Le syndrome inflammatoire Infections (+++), néoplasies peuvent induire un syndrome inflammatoire Sous l effet de cytokines pro-inflammatoires: IL1, IL6, et TNFα, le foie synthétise les protéines de la réponse inflammatoire (PRI) Le diagnostic biologique de syndrome inflammatoire repose sur quelques examens de base la numération formule (polynucléose neutrophiles, thrombocytose, anémie), la vitesse de sédimentation (VS) la mise en évidence et le dosage des PRI: CRP, orosomucoide, haptoglobine

8 Profil électrophorétique du syndrome inflammatoire α1 α2

9 Diagnostic biologique et suivi du syndrome inflammatoire A l électrophorèse, les PRI migrent essentiellement dans la zone des α- globulines. Une hyper α-globulinémie évoque donc un syndrome inflammatoire Diagnostique et Suivi du syndrome inflammatoire: Dosage de la CRP (C Reactive Protein) constitue le dosage de référence CRP est activateur du complément La CRP est un marqueur précoce, sensible et spécifique de la réaction inflammatoire augmentant proportionnellement à son intensité, et apparaît dans les six heures suivant l'inflammation aiguë.

10 Le syndrome Néphrotique: définition & étiologies Pathologie rénale: protéinurie élevée (>3g/j), hypoalbuminémie (<30g/l) Le syndrome néphrotique est la traduction clinique d anomalies rénales très différentes, fonctionnelles ou anatomiques: amylose, diabète, glomérulonéphrites, pathologie auto-immune, altérations idiopathiques notamment Altération plus ou moins importante des propriétés de filtre du glomérule rénal définit syndrome néphrotique plus ou moins sélectif: sélective si constituée essentiellement albumine

11 Le syndrome Néphrotique: traduction clinique Hypoprotéinémie à l origine d oedèmes Fuite d immunoglobulines et de protéines du complément à l origine vulnérabilité vis-à-vis des infections Perte de protéines anti-coagulantes favorise thromboses Altérations métabolisme hépatique: dyslipidémies (hypercholestérolémie, hypertriglycéridémie)

12 Le syndrome Néphrotique: aspect de l électrophorèse des protéines sériques alb α2 Hypoalbuminémie, Hyper α-globulinémie

13 Les hépatopathies chroniques Consommation chronique d alcool favorise l apparition d états fibrotiques du foie. A stade évolué, cirrhose hépatique: Bloc béta-gamma A un stade évolué, la cirrhose peut se traduire par une insuffisance hépatocellulaire: cirrhose décompensée Défaut de synthèse de l albumine: hypoalbuminémie

14 Profil électrophorétique des hépatopathies chroniques hypoalbuminémie Bloc β2 γ-globulines γ β1

15 Autres variations d origines non tumorales Hypoalbuminémies liées aux états de dénutrition sévère β: augmentation de la transferrine dans anémies ferriprives Déficits génétiques: déficit en α1-antitrypsine

16 Electrophorèse et exploration du Profil protéique sérique 1. L électrophorèse des protéines sériques: technique et interprétation 2. Pathologie non-tumorale 2.1. Le syndrome inflammatoire 2.2. Le syndrome néphrotique 2.3. Hépatopathies chroniques et autres sources d altérations 3. Pathologie tumorale 3.1. Rappels sur les Immunoglobulines 3.2. Les gammapathies monoclonales 3.3. Diagnostic biologique des gammapathies monoclonales: immunofixation des protéines sériques, dosage des CLL 3.4. Amylose

17 Electrophorèse des protéines sériques et Gammapathies Monoclonales Pour l essentiel, les immunoglobulines migrent dans la zone des gamma Réponses Ig sont clonales Un pic détecté dans cette zone fait évoquer la prolifération anormale d un clone lymphoplasmocytaire L électrophorèse des protéines sériques constitue un examen clé pour le dépistage et le diagnostic de ces pathologies

18 Structure des Immunoglobulines Chaines lourdes Chaines légères

19 Chaque cellule B fabrique ses gènes d immunoglobuline par recombinaison Locus IgH

20 Maturation de la réponse: Switch d Isotype

21 Chaque cellule B possède un gène d Ig qui lui est propre. La production d une Ig en grandes quantités signe donc l expansion du clone lymphocytaire produisant cette immunoglobuline: donc faire évoquer et rechercher une néoplasie B!

22 Les étapes de la différenciation du lymphocyte B Moelle osseuse en périphérie

23 Néoplasies lymphocytaires B LLC Waldenström Myélome Ig sériques 50 % isotype IgM IgM IgG, IgA Cellule d origine Presomatic hypermutation Postsomatic hypermutation, pre isotype switching Postsomatic hypermutation, post isotype switching

24 Myélome, ou maladie de Kahler Prolifération de cellules différenciées en plasmocytes, produisant le plus souvent IgG ou IgA Tumeur souvent à l origine de lésions ostéolytiques, d insuffisance rénale

25 Maladie de Waldenström A la différence du myélome, il s agit d une cellule qui n est pas engagée de manière terminale dans la différenciation plasmocytaire: la maladie de Waldenstrom est éventuellement classable comme un lymphome prolifération lymphoplasmocytaire monoclonale avec infiltration des organes lymphoides périphériques et de la moëlle osseuse Sécrétion d une IgM monoclonale, Manifestations cliniques en rapport avec hyperviscosité sanguine

26 Les Gammapathies Monoclonales de signification indéterminée MGUS (Monoclonal Gammapathy of Undefined Significance) chez environ 3% des plus de 50 ans dans la population générale Un pic monoclonal retrouvé sans élément clinique ou biologique évocateur d un myélome ou d une maladie de Waldenstrom Risque de transformation maligne est d environ 1% par an. Surveillance clinique et biologique est mise en place

27 Electrophorèse et exploration du Profil protéique sérique 1. L électrophorèse des protéines sériques: technique et interprétation 2. Pathologie non-tumorale 2.1. Le syndrome inflammatoire 2.2. Le syndrome néphrotique 2.3. Hépatopathies chroniques et autres sources d altérations 3. Pathologie tumorale 3.1. Rappels sur les Immunoglobulines 3.2. Les gammapathies monoclonales 3.3. Diagnostic biologique des gammapathies monoclonales: immunofixation des protéines sériques, dosage des CLL 3.4. Amylose

28 Diagnostic biologique des Gammapathies Monoclonales Pour le biologiste, la difficulté essentielle consiste à affirmer l origine monoclonale d une Ig détectée en grande quantité dans le sérum L affirmation du caractère monoclonal repose sur 1. l observation du pic à l électrophorèse: aspect étroit et haut 2. Les examens complémentaires: immunofixation, dosage des CLL

29 Exemple de Gammapathie monoclonale α1 α2 β1 β2 γ-globulines

30 Exemple de Gammapathie monoclonale débutante

31 Particularité des immunoglobulines d isotype IgA β1 α1 α2 β2 γ-globulines

32 Cas particulier des chaînes légères libres Proliférations monoclonales de cellules B productrices de chaines légères libres (κ et λ) posent des problèmes de diagnostique biologique: passage urinaire rapide des CLL (protéine de Bence-Jones) L électrophorèse apparait souvent normale dans le sérum on teste donc également les urines dans contexte clinique évocateur

33 Electrophorèse urinaire et chaînes légères libres

34 Principe et application de l immunofixation au diagnostic des gammapathies monoclonales Permet d affirmer la clonalité et de typer immunoglobuline monoclonale L immunofixation est une technique plus sensible que l électrophorèse pour détecter une immunoglobuline monoclonale. fractionnement électrophorétique des protéines du sérum Les pistes électrophorétiques sont saturées avec immunsérums monospécifiques des chaines anticorps (anti-γ -α µ κ λ). Précipitation in situ des immunoglobulines

35 Immunofixation et diagnostic des gammapathies monoclonales Profil normal Gλ

36 Gammapathie monoclonale débutante Mλ

37 Profil oligoclonal

38 Profil oligoclonal Infections (virales ou bactériennes) sont par exemple à l origine de profils oligoclonaux Affections autoimmunes Patients greffés

39 Le dosage des CLL dans le diagnostic des gammapathies monoclonales Dosages en néphélémétrie / turbidimétrie sont disponibles pour les chaines légères κ et λ Le dosage des CLL et surtout rapport κ/λ déséquilibré quand une immunoglobuline monoclonale est produite (un seul isotype de CLL) Dosage utilisable en dépistage (mais résultats doivent être complétés par typage) et pour le suivi de certaines gammapathies monoclonales

40 Amylose AL Amylose primitive AL : A pour amylose et L pour chaîne légère d immunoglobuline. «Primitive» indique qu elle n est pas secondaire à une inflammation, au contraire de l amylose AA. La substance amyloïde se présente sous forme de fibres insolubles qui forment des dépôts au sein d un ou de plusieurs organes et en altère progressivement le fonctionnement (Reins, cœur, foie et système nerveux périphérique). L amylose AL est caractérisée par l agrégation de CLL sous forme de fibrilles. Dans l amylose AL, les cellules atteintes ressemblent à celles du myélome mais n ont pas tendance à proliférer. L amylose AL n est donc pas considérée comme un cancer.

41 Dosage des CLL et suivi Amylose AL La sensibilité de l immunofixation (IFE) est insuffisante pour les patients présentant soit une amylose systémique primitive. Ces patients n ont souvent pas de pic monoclonal Le diagnostic de la maladie repose sur l examen biopsique de tissus où est présente la substance amyloïde. L efficacité du traitement se mesure en estimant la diminution du taux de CLL dans le sang.

42 Profil protéique urinaire 1. Rappel sur la physiologie urinaire 2. Les tests adaptés à l exploration de la protéinurie 3. Les différents types de protéinuries 4. CAT en présence d une protéinurie à bandelette

43 Structure et fonction du Néphron Membrane glomérulaire - Autorise passage eau et solutés de bas PM - Rétention des protéines de haut PM (albumine, PM=70kDa) D. Sahali, Service de néphrologie, INSERM-AVENIR 581,Hôpital Henri Mondor, Créteil 3: podocytes 2: membrane basale 1: endothélium capillaire

44 Rappel sur la physiologie Rénale Urine primitive: processus de filtration glomérulaire -> Une faible proportion de protéines filtrées par glomérule Ces protéines filtrées sont pour l essentiel réabsorbées par le tubule proximal. Au final, protéinurie normale < 150 mg/24h. Protéinurie physiologique: essentiellement albumine, bêta2 microglobulines, mucoprotéines de Tamm Horsfall

45 1. Rappel sur la physiologie urinaire 2. Les tests adaptés à l exploration de la protéinurie 3. Les différents types de protéinuries 4. CAT en présence d une protéinurie à bandelette

46 Détecter et Mesurer protéinurie 1. La bandelette urinaire Evaluation semi-quantitative de la protéinurie Seuil 100 mg/24h pour l'albumine, 300 mg/24h protéines Pas de détection des CLL ou bas poids moléculaire. Faux positifs: urines alcalines, contamination par détergents -> Intérêt pour dépistage protéinuries 2. Dosage pondéral des protéines urinaires Protéines totales: Analyse effectuée sur urines des 24h Dosage: Normale < 0,15 g/j. Si les urines 24h ne sont pas disponibles, on peut calculer rapport protéinurie / créatininurie

47 Explorer qualitativement la protéinurie 3. Microalbuminurie Indication: mesure précoce d une atteinte glomérulaire alors que la protéinurie est encore négative à la bandelette - Albuminurie physiologique : <30 mg/24h. 4. L'électrophorèse des protéines urinaires L'électrophorèse permet de déterminer le caractère sélectif (>80 % d'albumine) ou non de la protéinurie. Permet également de retrouver les paraprotéines et chaînes légères des immunoglobulines. 5. L immunofixation des protéines urinaires / Dosage des CLL Techniques adaptées à la recherche sensible des composants monoclonaux, et notamment chaines légères libres (CLL)

48 1. Rappel sur la physiologie urinaire 2. Les tests adaptés à l exploration de la protéinurie 3. Les différents types de protéinuries 4. CAT en présence d une protéinurie à bandelette

49 1. Protéinuries Glomérulaires Passage protéines au travers d'une barrière glomérulaire lésée, dont la fonction normale est d'en empêcher le passage. Ce sont les protéinuries les plus fréquentes, et souvent les protéinuries quantitativement les plus importantes. C'est la protéinurie du syndrome néphrotique, de la glomérulonéphrite, de l éclampsie et du diabète. Une protéinurie sélective, constituée essentiellement d'albumine, aux stades les moins graves. Le caractère non-sélectif associé à gravité.

50 2. Protéinuries Tubulaires Consécutives à déficit de réabsorption tubulaire des protéines Présence de protéines de bas poids moléculaires (<67 kda). α1-microglobulines, RBP, B2-microglobulines, Chaines légères libres polyclonales Toxicité médicamenteuse, rejet de greffe, maladie vasculaire rénale

51 100%

52 3. Protéinuries Pré-rénales / de surcharge Présence d un composant monoclonal produit en grandes quantités dans le sang du patient dépassement capacité de réabsorption du rein Protéinurie de Bence Jones / Myélome

53 Toxicité rénale des CLL Les chaînes légères monoclonales produites ont des propriétés néphrotoxiques. peuvent former des fibrilles (amylose AL), ou des dépôts localisés dans les membranes internes du rein (maladie de dépôt des chaînes légères) ou dans le tubule interstitiel (cylindres myélomateux). néphropathie myélomateuse Association chaînes légères libres avec protéine de Tamm-Horsfall, formant cylindres myélomateux, des dépôts cireux qui bloquent les tubules distaux.

54 Toxicité rénale des CLL Environ 50% des patients atteints de Myélome ont des dommages rénaux, variant d une insuffisance légère (asymptomatique) à une insuffisance sévère. 10 à 15% des patients présentent une insuffisance rénale aigue. 10% des patients avec myélome maintenus sous hémodialyse à long terme. Mortalité élevée. La recherche de la protéinurie a donc une importance pronostique

55 Toxicité rénale des CLL Chaine légère + Atteinte tubulaire

56 Recherche de protéinurie de Bence Jones -> rechercher protéinurie de Bence-Jone lors de la découverte d une immunoglobuline monoclonale sérique / dans suivi d un myélome.

57 4. Protéinuries Post-rénales Contamination sanguine au niveau du tractus uro-génital présence α2-macroglobuline dans urines

58 5. Protéinuries hémodynamiques Protéinuries de faible abondance et transitoire < 2g/24h mécanismes possibles: augmentation de la fraction filtrée des protéines liée à une élévation des résistances (vasoconstriction, augmentation de la pression veineuse centrale) Causes fréquentes: orthostatisme, fièvre Surtout chez le sujet jeune (puberté) Ce sont des protéinuries «fonctionnelles», de très bon pronostic

59 1. Rappel sur la physiologie urinaire 2. Les tests adaptés à l exploration de la protéinurie 3. Les différents types de protéinuries 4. CAT en présence d une protéinurie à bandelette

60 CAT en présence protéinurie à bandelette -> examen clinique (HTA, diabète) -> refaire X2: caractère transitoire? -> analyse des urines de 24h, index de sélectivité? -> étude cytologique, ECBU -> Recherche composante monoclonale: immunofixation -> iono, électrophorèse sérum -> morpho appareil urinaire (écho, consultation uro néphro) éventuellement PBR chez l adulte

61 Place des examens de biochimie dans le diagnostic étiologique et le suivi des protéinuries 1. Atteinte Rénale? 1. La protéinurie est souvent le 1er signe d une atteinte rénale Elle peut rester longtemps le seul signe clinique -> dépistage (diabète ++) 2. Préciser niveau de l atteinte, pré- ou post-rénale? et nature de la néphropathie associée (glomérulaire, tubulaire, mixte) 2. Détecter présence d un composant monoclonal Électrophorèse protéines urinaires, Immunofixation urinaire, dosage CLL: immunoglobuline ou CLL?

62 Les protéines du LCR 1. Les test d exploration des protéines du LCR 2. Application en pathologie neurologique

63 Généralités sur le LCR Le liquide céphalo-rachidien (LCR) ou liquide cérébro-spinal (LCS), baigne cerveau et moelle épinière. Occupe l'espace sub-arachnoïdien, entre les méninges - l'arachnoïde, qui tapisse le versant interne de la dure-mère - la pie-mère, qui recouvre le système nerveux central

64 Généralités sur le LCR Le LCS est synthétisé au niveau des plexus choroïdes, au niveau du toit des ventricules cérébraux Son volume chez l'humain adulte est d'environ 150 ml. Production de l'ordre de 500 à ml/jour. Renouvelé en totalité toutes les 6 à 8 heures. Prélèvement par ponction lombaire, entre L4 et L5

65 Protéinorachie Dosage des protéines totales Prélèvement: 1 ml de LCR sur tube sec Les valeurs normales diffèrent suivant le site de prélèvement au niveau lombaire chez l adulte, 0.15 à 0.45 g/l Hyperprotéinorachieest un élément peu spécifique -observé dans tous les processus inflammatoires des méninges. Elle peut être associée à une réaction cellulaire, c est-à-dire à une augmentation du nombre de leucocytes dans le LCR (pléiocytose), ou encore être isolée (syndrome de Guillain-Barré).

66 Electrophorèse des Protéines du LCR Analyse des différentes fractions protéiques - Préalbumine - Albumine: produite par transsudation de l albumine sérique - Fraction tau: à l interface β γ globuline.. Transferrine désialilée Profil transsudatif: albumine augmentée, diminution pré-albumine et fraction tau traduit altération BHE par tumeur (compression), Guillain-Barré, ou AVC Profil exsudatif / oligoclonal: SEP, infections Profil monoclonal: localisation méningée d un myélome

67 Electrophorèse des Protéines du LCR Index de Delpech = IgG / Albumine LCR IgG / Albumine sérum Valeur normale < 0,65 Rapport supérieur à 0,65 en faveur synthèse intra-thécale d Ig

68 Sclérose en Plaques: intérêt de la mise en évidence de synthèse intrathécale d immunoglobulines Sclérose en Plaques (SEP): gaine de myéline est la cible processus inflammatoires évoluant par poussées Diagnostic par imagerie + Biologie, avec mise en évidence d une réponse immunitaire IgG au niveau du SNC L isoelectrofocalisation du LCR permet la mise en évidence d une synthèse intrathécale d Ig, consécutive à passage de BHE par lymphocytes

69 Isoélectrofocalisation du LCR: l examen de référence pour la mise en évidence des profils oligoclonaux dans le LCR Comparaison réponses IgG sérum / LCR - Isofocalisation - Immunoblot IgG Examen positif si > 5 bandes dans LCR: réponse oligoclonale

70 Place de l IEF dans le diagnostic de SEP (1) Freedman MS et al. Recommended Standard of Cerebrospinal Fluid Analysis in the Diagnosis of Multiple Sclerosis. JAMA Neurol 2005; 62:

71 Place de l IEF dans le diagnostic de SEP (2) Les critères du diagnostic de SEP 1. Les données cliniques suggestives, évaluées (prospectivement ou rétrospectivement) sur 1 an 2. 2 des 3 critères suivant - Imagerie RMN positive au niveau cérébral - Imagerie positive au niveau spinal - IEF positive L IEF est donc une aide au diagnostic de SEP Rôle pronostic / suivi en revanche discutable : pas d indication à refaire IEF en dehors d un doute diagnostic

72 Dosages de protéines spécifique: marqueurs d atteinte axonale Protéine Tau, Aβ m. Alzheimer Teunissen et al. Lancet Neurol 2005

73

74 Les objectifs du cours (1) 1. Pouvoir décrire les altérations de l électrophorèse des protéines sériques retrouvées dans les principaux syndromes non-néoplasiques et leur valeur diagnostique 2. Connaitre les principales pathologies hématologiques associées à la production d une paraprotéine sérique, et décrire les stratégies de biologie médicale adaptées à leur diagnostic 3. Connaitre le principe et les indications des examens biologiques complémentaires qui suivent: dosages des protéines de la réponse inflammatoire, immunofixation, dosages des chaines légères libres

75 Les objectifs du cours (2) 1. Connaitre les principales indications et la méthodologie des examens portant sur le profil urinaire 2. Les différents types de protéinuries 3. Néphrotoxicité des CLL 4. CAT en présence d une protéinurie dépistée à bandelette 5. Le profil protéique du LCR 6. Rôle de l IEF dans la prise en charge de sclérose en plaques

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