VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION
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- Henri Fournier
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1 FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAL SECTIE - SECTION: Analyses Spéciales VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaptation I-MET-LFSAL-025B Dosage de l histamine dans des échantillons de poissons par HPLC-UV HPLC-Fluorimétrie Poissons 04/02/2010
2 FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAL SECTIE - SECTION: Analyses Spéciales Résumé des critères de performance : Justesse : 4 (pages 4 et 5) dossier de validation du 04/02/2010 (édition 1). Rendement: 6 (page 7), dossier de validation du 04/02/20010 (édition 1). Répétabilité et reproductibilité intra-laboratoire, 5 (page 6), dossier de validation du 04/02/2010 (édition 1). LOD & LOQ : 8 (page 8 et 9) : 25 ppm (LOD) & 50 ppm (LOQ) La validation répond aux exigences de la procédure LAB 00 P180 Le laboratoire qui veut appliquer cette méthode doit démontrer que les critères ci-dessous soient remplis pour les combinaisons matrices/paramètres : Justesse : max 10 % relatif pour des résultats corrigés sur le rendement dans la gamme ppm Rendement: max 20 % relatif dans la gamme ppm LOD & LOQ : 8 (page 8 et 9) : 25 ppm (LOD) & 50 ppm (LOQ) Reproductibilité intra-laboratoire : doit satisfaire à l équation d Horwitz Historique de validation: Edition Révision par/date Motif de la révision Modifications 1 M. Evrard / Adaptation au nouveau template Adaptation au nouveau template du dossier de validation du 04/ avec annexe photos
3 FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAL SECTIE - SECTION: Analyses Spéciales VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par I-MET-LFSAL-025B Dosage de l histamine dans des échantillons de poissons par HPLC-UV HPLC-FLUO Poissons Totale Ir MARC EVRARD, chef de section Evrard Handtekeningen - Signatures: Marc 04/02/2010 Sé Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction) Periode van validatie Période de validation Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par C. Haudestaine / L. Keyaert /Y. Bouamar Experts techniques Start - Début: 11/01/2010 Einde - Fin: 04/02/210 Adaptation du dossier de validation au template : juin 2012 Handtekeningen - Signatures: Ir Marc Evrard Chef de section Sé Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /9
4 FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAL SECTIE - SECTION: Analyses Spéciales Dossier de Validation des histamines dans les poissons riches en histidine par HPLC-UV. L histamine est une amine biogène produite après la mort du poisson sous l action de certaines bactéries. Ces bactéries produisent une enzyme qui va transformer l histidine acide aminé présent à forte teneur dans certains poissons en histamine. L histidine peut se trouver sous forme libre mais aussi sous forme liée dans les pigments tels que l hémoglobine et la myoglobine. Les microorganismes responsables de la formation de l histamine se développent principalement à des températures supérieures à 7-10 C dans les ouïes et les viscères du poisson. Cependant, de récentes recherches ont montré que certaines bactéries productrices d histamine étaient actives entre 0 et 5 C. Les conditions nécessaires à la formation de l histamine sont : Présence en quantité élevée d histidine libre Présence en nombre important des bactéries produisant l histidine décarboxylase Une validation principale a été réalisée sur un mélange de sardines, de thons et de maquereaux à l huile (égouttés) en même proportion massique. Les différents poissons ont été mélangés, aliquotés en tubes falcon et congelés. Les essais sur la matrice principale se sont fait à l aide d ajouts dosés d histamine à % de la norme Bien que similaires, deux autres matrices ont été testées afin de tester la répétabilité et le rendement d extraction sur ces matrices ; les deux matrices secondaires sont : - thon frais + maquereau frais + sardines fraîches en même proportions massiques - anchois saumurés. Les essais sur les matrices secondaires se sont fait à l aide d ajouts dosés d histamine à % de la norme sur les poissons frais et % de la norme pour les poissons saumurés Sur la validation principale, les paramètres pris en compte sont : - la linéarité - l exactitude (rendement, gamme de 50 à 400 ppm) et la justesse (échantillon Fapas, gamme de 120 à 340 ppm) - la précision (répétabilité et reproductibilité intralaboratoire à % des normes). - La sélectivité, spécificité LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /9
5 FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAL SECTIE - SECTION: Analyses Spéciales 1. Normes dans les poissons n=9, c=2 : m=100 mg/kg et M= 200 mg/kg (pour produits de la pêche fabriqués à partir d espèces de poissons associés à une grande quantité d histidine : voir Règlement 2073/2005, annexe1, chapitre 1 : 1.25) n=9, c=2 : m=200 mg/kg et M= 400 mg/kg (pour produits de la pêche ayant subi un traitement de maturation aux enzymes dans la saumure, fabriqués à partir d espèces de poissons associés à une grande quantité d histidine : voir Règlement 2073/2005, annexe1, chapitre 1 : 1.26.). Mais la maturation enzymatique est exceptionnelle dans le cas de conserves de poissons. 2. La linéarité Le modèle linéaire sur une gamme de 35 à 550 µg/g en 5 points a été retenu. Les critères concernant la linéarité sont les suivants : - Un coefficient de détermination >= 0.99 ; - La gamme de concentration de la droite dans la validation comme en routine doit couvrir les valeurs des pics détectés ; des dilutions des extraits finaux sont, le cas échéant, effectués. - Un écart maximum de chaque point <= 10 % (pourcentage résiduel selon la formule ci-dessous) par rapport au modèle. Valeur théorique Valeur estimée Valeur théorique 100 Les résultats de validation sont tous calculés à partir de régressions linéaires au sens des moindres carrés (intégration sur la hauteur) respectant les 3 critères énoncés ci-dessus. 3. La sélectivité et la spécificité 3.1. La spécificité La spécificité est démontrée par l absence de pics aux temps de rétention des analytes dans les échantillons blancs donc non fortifiés pour chaque matrice dans chaque séquence d analyses de la validation. Pour tout pic <LOD, la valeur du blanc est retranchée de son dopé. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /9
6 FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAL SECTIE - SECTION: Analyses Spéciales 3.2. La sélectivité. La détection en UV étant non sélective (dans le cas de l histamine, pas de critère DAD probants), un contrôle (DBG) à été ajouté afin de garantir une «sélectivité» sur base du temps de rétention relatif de l histamine par rapport à ce DBG. Il faut observer dans le chromatogramme 2 pics correspondants au pic de l histamine et un standard de référence chromatographique (DBG) entre 5 et 15 minutes ; les temps de rétentions absolus de l histamine et du DBG peuvent varier en fonction de la vie de colonne et de petites différences de compositions dans le tampon d élution mais la différence des temps de rétentions relatifs de 2 injections (entre l échantillon et la vérification la plus proche) d histamine (par rapport au DBG) ne devra pas excéder 5 % selon la formule : Rt Rt hista1 DBG1 Rt Rt hista _ vérif DBG _ vérif 100 5% Tous les chromatogrammes de la validation respectent le critère de la formule ci-dessus. A noter également, que dans le cas de la vérification de la justesse (sur échantillons Fapas, cf cidessous), ces mêmes échantillons, en plus du caractère quantitatif, ont tous été confirmés qualitativement en ELISA (MET-LFSAL-025) en contrôle 3ième ligne (cf 4).. 4. La justesse Pour avoir une idee de la justesse de la méthode, 3 échantillons Fapas répétés 8 fois dans des conditions de répétabilité. Ces échantillons ont été séléctionnés pour parcourir au maximum la gamme d étalonnage. A vu des résultat ci-dessous, l écart maximum entre la valeur estimée et la valeur vraie est de maximum 3.8 % ce qui est grandement acceptable et en tout cas prouve que la méthode HPLC est plus juste que la méthode Elisa.. A) Valeur cible (check vwa 418) : 123 ppm résultat corrigé sur le rendement : ppm (Elisa : ppm). Technicien : Y. Bouamar Justesse (différence relative) : 100*( )/123 = 2.3 % Pesée Résultat en ppm Result. Corr. Rend BlancMatrice ,0039 2,41 DopéMatrice2 100ppm 2 5, , ,90 CHECK , ,01 120, , ,01 120, , ,01 119, , ,36 120, , ,27 121, , ,10 119, , ,04 119, , ,36 118,91 123,64 120,16 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /9
7 FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAL SECTIE - SECTION: Analyses Spéciales B) Valeur cible (fapas 2757) : 226 ppm résultat corrigé sur le rendement : ppm (Elisa : ppm). Technicien : keyart Luc Justesse (différence relative) : 100*( )/226 = 3.8 % Pesée Résultat en ppm Result. Corr. Rend BlancMatrice ,0071 0,00 DopéMatrice2 200ppm 2 5, ,39 100,05 FAPAS , ,60 230,48 FAPAS , ,77 228,66 FAPAS , ,78 229,66 FAPAS , ,96 241,84 FAPAS , ,96 236,84 FAPAS , ,27 241,15 FAPAS , ,22 235,10 FAPAS , ,43 232,31 234,62 234,50 C) Valeur cible (fapas 2760) : 342 ppm résultat corrigé sur le rendement : ppm (Elisa : 360 ppm). Technicien : Bouamar Y. Justesse (différence relative): 100*( )/342 = 0.04 % Pesée Résultat en ppm Result. Corr. Rend BlancMatrice ,0071 0,00 DopéMatrice2 200ppm 2 5, ,39 100,05 FAPAS , ,27 340,09 FAPAS , ,68 343,51 FAPAS , ,80 342,63 FAPAS , ,47 341,30 FAPAS , ,61 342,44 FAPAS , ,89 343,72 FAPAS , ,77 341,59 FAPAS , ,83 339,66 342,04 341,87 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /9
8 FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAL SECTIE - SECTION: Analyses Spéciales 5. Répétabilité et reproductibilité intralaboratoire. 5.1 Validation principale (thons, maquereaux, sardine à l huile). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert Concentration Répétabilité Reproductibilité CV r du dopage r (2.8XSr) R (2.8XSr) (%) (ppm) ppm ppm n=12 CV r max CV R CV R 2/3 (%) max CV Horwitz Histamine n=12 CV Horwitz Toutes les RSD de répétabilité et de reproductibilité intra-laboratoire (respectivement < 3 et 5 %) satisfont à l équation de Horwitz. 5.2 Validation secondaire sur répétabilité (thons, maquereaux, sardine au naturel). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert Concentration Répétabilité CV r du dopage r (2.8XSr) (%) (ppm) ppm n=4 CV r max 2/3 CV Horwitz Histamine Toutes les RSDr (respectivement < 1.30) satisfont à l équation de Horwitz. 5.3 Validation secondaire sur répétabilité (anchois saumurés). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert Concentration Répétabilité CV r du dopage r (2.8XSr) (%) (ppm) ppm n=4 CV r max 2/3 CV Horwitz Histamine Toutes les RSDr (respectivement < 1.71) satisfont à l équation de Horwitz. Pour chaque concentration, les matrices de la validation secondaire présentent des RSDr inférieures ou égales à celles de la validation principale. Il est dès lors de moindre importance d investiguer la reproductibilité sur ces matrices secondaires. Les critères de répétabilité et de reproductilité de la validation principale leur seront aplliqués LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /9
9 FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAL SECTIE - SECTION: Analyses Spéciales 6. Exactitude (rendement de l extraction) 6.1 Validation principale (thons, maquereaux, sardine à l huile). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert Histamine Concentration du dopage (ppm), n=12 Concentration calculée en ppm Rendement (%) Validation secondaire sur répétabilité (thons, maquereaux, sardine au naturel). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert Concentration du dopage (ppm), n=4 Concentration calculée en ppm Rendement (%) Histamine Validation secondaire sur répétabilité (anchois saumurés). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert Concentration Concentration Rendement (%) du dopage (ppm), n=4 calculée en ppm Histamine En routine, les résultats sont rendus corrigés sur le rendement de l échantillon de contrôle Fapas (par rapport à sa valeur de référence soit +/- 20 %) ou à défaut d un Blanc dopé à 100 ppm. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /9
10 FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAL SECTIE - SECTION: Analyses Spéciales 7. Modélisation de l incertitude de mesure relative (k=2) L incertitude est calculée pour des résultats corrigés sur le rendement (pas d incertitude sur le biais) 50 ppm 7% 100 ppm 9.2 % 200 ppm 6.2 % 400 ppm 5.1 % La gamme d intérêt (selon les normes) varie de 100 à 400 ppm. Elle est ici modélisée de 100 à 400 ppm linéairement point par point et ce pour une interprétation plus simple y = 0,03x + 12,2 Y= incertitude relative (%) X = concentration en µg/g) y = 0,0055x + 7, série1 série2 Linéaire (série1) Linéaire (série2) 8. Limite de détection et de quantification Dans la matrice la plus difficile d un point de vue rendement d extraction (anchois saumurés), le rapport S/B multiplié par 5 correspond à une teneur d environ ppm. Les pics sont parfaitement détectables à cette teneur mais une chute significative des rendements est constaté. Ci dessous les résultats pour un dopage à 30 ppm sur des anchois saumurés et à 25 ppm sur du thon, maquereaux et sardines à l huile ; dans cette matrice, à 25 ppm, les rendements restent dans la moyenne de la validation (proche de 100 %). Comme les matrices, en routine, peuvent-être variables et que nous faisons une correction sur le rendement, nous prenons une sécurité et fixons la LOD à 25 ppm (environ 5*S/B) et la LOQ à 50 ppm (la teneur la plus basse inclue dans notre validation). Ces valeurs restent confortables étant donné que la norme la plus basse est à 100 ppm et que nous acceptons une variation de 20 % sur les rendements d extractions LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /9
11 FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAL SECTIE - SECTION: Analyses Spéciales Techniciens : Bouamar Y, Haudestaine Cl. thon, maquereaux, sardines à l'huile Colonne1 Colonne2 Colonne3 Colonne4 Colonne5 Colonne6 Pesée Résultat en ppm Valeur cible fct pesée Rendement % BlancMatrice ,0039 2,41 2,182 DopéMatrice2 25ppm 1 3 5, ,65 24,99 98,62 DopéMatrice2 25ppm 2 4 5, ,37 24,89 101,91 DopéMatrice2 25ppm 3 5 5, ,26 24,91 101,39 DopéMatrice2 25ppm 4 6 5, ,65 24,99 102,65 DopéMatrice2 25ppm 5 7 5, ,69 24,95 98,94 DopéMatrice2 25ppm 6 8 5, ,69 24,89 99,19 DopéMatrice2 25ppm 7 9 5, ,40 24,92 97,94 DopéMatrice2 25ppm ,009 25,41 24,96 101,82 Anchois saumurés Colonne1 Colonne2 Colonne3 Colonne4 Colonne5 Colonne6 Colonne62 Pesée Résultat en ppm Valeur cible fct pesée Valeur sans blanc Rendement % BlancMatrice ,0039 7,91 DopéMatrice4 30ppm 1 3 5, ,23 29,99 21,32 71,08 DopéMatrice4 30ppm 2 4 5, ,88 29,87 20,97 70,21 DopéMatrice4 30ppm 3 5 5, ,72 29,90 20,81 69,61 DopéMatrice4 30ppm 4 6 5, ,49 29,99 21,58 71,97 DopéMatrice4 30ppm 5 7 5, ,80 29,94 20,89 69,76 DopéMatrice4 30ppm 6 8 5, ,38 29,87 21,47 71,89 9. Stabilité/robustesse. La présente validation et méthode repose sur la publication suivante : Validation and comparison of analytical methods for the determination of histamine in tuna fish samples, A.L. Cinquina, F. Longo, A. Cali, L. De Santis, R Baccelliere, R. Cozzani; Journal of Chromatography A, 1032 (2004), Dans cette publication repose une étude de robustesse ayant conduit au choix des paramètres utilisés en routine. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /9
12 MET LFSAL 025B Annexe photos AFSCA LFSAL
13 Préparation de la phase mobile (MeoH:tampon phosphate + ion pairé)
14 Préparation de la séquence HPLC
15 Exemple de séquence HPLC
16 Préparation des points d étalonnage à partir de la solution mère
17 Scellage des bouchons
18 Vortexer
19 Mise en vial des points d étalonnage
20
21 Numérotation des vials
22 Préparation des échantillons
23 Mixer
24 Pesée
25 Ajout d HClO4
26 Vortexer
27 Centrifuger à 4 C
28 Récupération du surnageant (répéter l extraction 3X)
29 Ajout de DBG dans chaque échantillon
30
31 Mise au trait
32 Filtration sur PTFE et mise en vial
33
34 Mise des vials dans l autosampler
35 Séparation chromatographique (DBG & histamine) HISTA DGB
36 Echantillon conforme (pic de DBG et absence d histamine) DBG
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