Etude de l acétylation et de la stabilité. épithéliales humaines tumorales, en. condition d hypoxie

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1 ZINDEL Marc Master EGPR /2005 Etude de l acétylation et de la stabilité de HIF-1α, in vitro, dans des cellules épithéliales humaines tumorales, en condition d hypoxie 1

2 Mots-clés : HIF-1α, hypoxie, angiogénèse, ARD-1 et acétylation. Sommaire RÉSUMÉ... 3 INTRODUCTION... 3 STRUCTURE DE HIF ETUDE DE LA STABILITÉ DE HIF-1α... 5 RÉGULATION DE HIF-1α EN NORMOXIE... 5 RÉGULATION DE HIF-1α EN HYPOXIE... 7 ETUDE DU FACTEUR ARD ARD1 ET ACTIVITÉ TRANSCRIPTIONNELLE DE HIF-1α EN HYPOXIE... 8 ARD1 ET STABILITÉ DE HIF-1α EN HYPOXIE... 9 STABILITÉ DE HIF-1α : UN PROCESSUS ACÉTYL-DÉPENDANT BILAN ET OBJECTIFS LA BERBÉRINE, CIBLES ET PROPRIÉTÉS ANTI-ANGIGÉNIQUES (5) INHIBITION DE LA MIGRATION CELLULAIRE INDUCTION DE LA DÉGRADATION DE HIF-1α RÉTABLISSEMENT DE L ACÉTYLATION DE HIF-1α CONCLUSION ET DISCUSSION REFERENCES

3 Résumé Hypoxia Inducing Factor (HIF-1) est un facteur de transcription jouant un rôle critique dans le développement des tumeurs en stimulant l activité angiogénique ce qui conduit à la vascularisation de la tumeur, chez les mammifères. HIF-1 est induit par hypoxie environnante, c'est-à-dire, lorsque le niveau d oxygène est inférieur à (21%). HIF-1 est un hétérodimère constitué de HIF-1β, exprimé constitutivement et de HIF- 1α, régulé par le niveau d oxygène. La stabilité et l activité de HIF-1α sont régulées, pour l une, par des modifications post-traductionnelles sur les domaines ODDD «Oxygen Dependent Degradation Domain» et pour l autre, par le C-TAD (Domaine de Transactivation). Les principales modifications sont des hydroxylations et des acétylations. Il a été démontré que l hydroxylation de P402, P564 et l acétylation de K532 sur le domaine ODDD permettaient l interaction avec le complexe pvhl «Von Hippel Lindau protein» et la dégradation de HIF-1α. Il est démontré dans ce travail que la seule acétylation de K532 est suffisante pour la dégradation de HIF-1α. Dans les tumeurs, HIF-1α n est plus régulé et la tumeur se vascularise. La berbérine, un alcaloïde d origine végétale, possède des propriétés anti-angiogéniques en rétablissant l acétylation de K532. Introduction Une tumeur en croissance à besoin d être alimentée en oxygène pour sa survie. Elle se trouve souvent isolées des veines et artères. Pour palier à cette carence, la tumeur va développer une vascularisation par l intermédiaire de HIF-1 pour «Hypoxia Inducing Factor 1» et de VEGF pour «Vascular Endothelial Growth Factor», les deux principaux acteurs de régulation de l angiogénèse cellulaire. HIF- 1α est un facteur de transcription de plus de 60 gènes, pour la majorité, des gènes impliqués dans la survie cellulaire, la prolifération cellulaire, l angiogénèse etc. (1)(9). 3

4 HIF-1 est un hétérodimère constitué des deux sous unités HIF-1α et HIF-1β (3). HIF- 1β est exprimé de façon constitutive et localisé dans le noyau (10). HIF-1α est exprimé dans le cytosol et dégradé en conditions de normoxie (Figure 1) (2). En hypoxie, HIF-1α est transloqué dans le noyau, s associe à HIF-1β et joue son rôle de facteur de transcription. HIF-1α possède un domaine ODDD pour «Oxygen Dependent Degradation Domain». Ce domaine est la cible de plusieurs modifications post-traductionnelles régissant sa stabilité (1), (3). En hypoxie dans les cellules tumorales, il y a perte de la régulation de HIF-1α et vascularisation autour de la tumeur. Structure de HIF-1 HiF-1 est un hétérodimère, constitué de HIF-1α (92,6 kda) et de HIF-1β (86,6 kda). Chaque sous unité possède un domaine bhlh «basic Helix-Loop-Helix» impliqué dans la dimérisation et un domaine PAS «Per-Arnt-Sim» de liaison à l ADN (3)(11). HIF-1β aussi appelé ARNT «Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator», n est pas régulé par l oxygène et est exprimé constitutivement dans le noyau (10). HIF-1α possède un domaine ODDD «Oxygen Dependent Degradation Domain», cible de plusieurs modifications post-traductionnelles, notamment des sites d hydroxylation et d acétylation (Figure 2) (1)(3). En normoxie, HIF-1α est dégradé par la protéasome et ne peut pas être transloqué dans le noyau pour se dimériser avec HIF-1β, il n y a donc pas d angiogénèse dans les conditions normales d oxygénation. 4

5 HIF-1α et HIF-1β possède des domaines de transactivation mais seulement le domaine de transactivation en C-terminal de HIF-1α est régulé par modifications post-traductionnelles (8). Etude de la stabilité de HIF-1α Régulation de HIF-1α en normoxie La régulation de HIF-1α est oxygène dépendante. Lorsque l on parle de normoxie, on considère expérimentalement une oxygénation autour de 21% d O 2 et en hypoxie, entre 0 et 1% d O 2. Le taux d oxygène en condition de normoxie régule HIF-1α négativement. La modulation de la stabilité de HIF-1α implique plusieurs protéines et plusieurs modifications post-traductionnelles. Les protéines ARD1, PHD, pvhl, FIH et p300/cbp interviennent dans la stabilité et l activité de HIF-1α. Les principales modifications post-traductionnelles affectant la stabilité se font sur ODDD et sont 5

6 deux hydroxylations apportées par la PHD «Prolyl-Hydroxylase Domain», en position P402 et P564, et une acétylation par la protéine ARD1 «arrest defective protein» en position K532 (Figure 3). Il a été montré que ces trois modifications permettaient l interaction avec le complexe pvhl «Von Hippel Lindau protein», ce qui provoquait la polyubiquitination de HIF-1α et sa dégradation par le protéasome (Figure 4) (1)(6). De cette façon, dans des conditions d oxygénation normale des tissus, il n y a pas d angiogénèse. Le domaine C-TAD peut être hydroxylé sur l asparagine 803 grâce au «Factor Inhibiting of HIF-1α» (FIH) (7)(8). Cette hydroxylation empêche l interaction de p300/cbp avec HIF-1α dans le noyau et ainsi la formation du complexe HIF-1α/p300/CBP activant les gènes cibles. D une part les modifications post-traductionnelles sur ODDD induisent la dégradation de HIF-1α et d autre part, l hydroxylation de C-TAD inhibe son activité transcriptionnelle. La répression de HIF-1α en normoxie est ainsi très efficace. 6

7 Régulation de HIF-1α en hypoxie En hypoxie, le faible niveau d oxygène fait que toutes ces modifications posttraductionnelles ne se font plus, le complexe pvhl n interagit plus avec HIF-1α et donc n est plus dégradé par le protéasome (figure 5). HIF-1α se transloque alors dans le noyau et peut se dimériser avec HIF-1β. D autre part, l hydroxylation de C- TAD est réprimée, HIF-1α retrouve une activité transcriptionnelle maximum, il y a donc angiogénèse (8). Il se passe la même chose dans les cellules tumorales. Nous allons donc chercher à retrouver la régulation qui s opère en normoxie dans les cellules saines afin de contrer le développement de la tumeur. 7

8 Etude du facteur ARD1 ARD1 et activité transcriptionnelle de HIF-1α en hypoxie ARD1 est responsable de l acétylation de la lysine 532 sur le domaine ODDD de HIF- 1α. Il a été remarqué que la surexpression de ARD1 dans des cellules HEK293 (cellules embryonnaires de fibroblastes de rein humain) induisait une baisse de l activité transcriptionnelle de HIF-1α. Les cellules ont été cotransfectées avec 1µg, 2µg et 3µg de plasmide exprimant ARD1, avec HIF-1α et avec HIF-1β. Deux pools de cellules ont été transfectés transitoirement, l un par un plasmide contenant l élément de réponse à l hypoxie (HRE) en amont du gène rapporteur de la luciférase et l autre par le gène de la luciférase avec un mutant inactif de HRE (4). On remarque alors que dans des conditions de normoxie, il n y a aucune expression du gène rapporteur. On voit par contre qu en hypoxie et sans présence de ARD1, l activité luciférase est de environ 9 fois celle de l expression basale et plus la quantité de ARD1 transfectée est grande et moins il y a d activité luciférase (Figure 6). ARD1 jouerait vraisemblablement un rôle important dans la régulation de HIF-1α. 8

9 ARD1 et stabilité de HIF-1α en hypoxie ARD1 joue donc un rôle sur l activité transcriptionnelle de HIF-1α, mais dans une autre expérience, il est bien montré que ARD1 intervient sur la stabilité de la protéine HIF-1α et par conséquent sur son activité transcriptionnelle. Il s agit d un western blot sur des cellules HT1080 (cellules de fibrosarcome humain) et des cellules HT1080 transfectées avec pcmv-ard1, en conditions de normoxie et d hypoxie. Il est démontré que les cellules non transfectées avec ARD1 en hypoxie, expriment fortement HIF-1α (Figure 7). Et lorsqu il y a transfection avec ARD1, il n y a presque plus d expression de HIF-1α alors que la RT-PCR faite en parallèle révèle que le taux de messagers de HIF-1α reste inchangé tout au long de l expérience (Figure 7) (4). La seule activité de ARD1 suffit à déstabiliser HIF-1α. L acétylation unique du domaine ODDD serait donc suffisante pour conduire à la dégradation de HIF-1α et non la combinaison avec les deux autres hydroxylations. Les mêmes résultats ont été observés avec une transfection de ARNm antisens de ARD1 (AS-ARD1) dans la même lignée cellulaire. En normoxie et avec AS-ARD1, il y a retour d une expression de HIF-1α et lorsqu on se place en hypoxie plus AS-ARD1, l expression de ARD1 est alors quasiment nulle et celle de HIF-1α encore plus forte (4). 9

10 Stabilité de HIF-1α : un processus acétyl-dépendant Afin de s assurer que l acétylation de HIF-1α est suffisante pour sa dégradation, deux expériences sont réalisées. Pour déterminer l état d acétylation de HIF-1α en hypoxie, une immunoprécipitation avec des anticorps anti-acétyl-lysine est faite sur des cellules HT1080 en présence de MG132, un inhibiteur du protéasome (figure 8). Le western blot de l immunoprécipitation montre qu en hypoxie et en présence de 10

11 MG132, HIF-1α n est plus acétylé contrairement aux conditions de normoxie (4). Pour confirmer l hypothèse d une dégradation acétyl-dépendante de HIF-1α, des cellules HEK293 sont transfectées avec HIF-1α muté sur la lysine 532 en arginine sur domaine ODDD, HIF-1α et pvhl sont coimmunoprécipités pour montrer l interaction entre pvhl et le domaine ODDD de HIF-1α. Les résultats montre que la seule mutation de la lysine 532 en arginine induit la perte de 75% de l interaction pvhl-oddd par rapport à la protéine sauvage et donc une perte de la dégradation de HIF-1α (Figure 9) (4). On peut maintenant conclure que la stabilité de HIF-1α est acétyl-dépendante, contairement à ce qui avait pu être démontré. Il avait été prouvé qu il fallait l interaction du complexe pvhl sur les trois acides aminés modifiés posttraductionnellement sur ODDD (P402, P564 hydroxylées et K532 acétylée), pour que HIF-1α soit dégradé alors que l acétylation unique de K532 est suffisante. 11

12 Bilan et objectifs Nous cherchions à savoir quel était le mécanisme de régulation de la stabilité de HIF- 1α et de comprendre pourquoi en hypoxie il y avait perte de cette dégradation. Maintenant nous pouvons dire que ce processus répond principalement à l acétylation de la lysine 532 du domaine ODDD de HIF-1α. Un objectif thérapeutique serait de pouvoir rétablir cette acétylation et de cette façon retrouver la dégradation de HIF-1α par le protéasome. Le criblage à haut débit a révélé que la berbérine, un alcaloïde végétal, extrait de Huanglian (Coptis chinensis), déjà connue pour ses vertus anti-inflammatoires et antiseptiques, se révèle avoir des propriétés anti-angiogéniques. La berbérine, cibles et propriétés anti-angigéniques (5) Il a été montré que la berbérine empêchait l expression de HIF-1α et de VEGF «Vascular Endothelial Growth Factor» dans les cellules SC-M1 (cellules d adénocarcinome gastrique). HIF-1α et VEGF étant les deux acteurs principaux dans la régulation de l angiogénèse cellulaire, la berbérine se révèle très intéressante. Nous allons seulement voir les propriétés de la berbérine sur HIF-1α, notre protéine d intérêt dans cette étude. 12

13 Inhibition de la migration cellulaire Les cellules SC-M1 ont été soumises à des conditions d hypoxie seule et d hypoxie combinée à de la berbérine. La mesure de la migration cellulaire est directement faite sur les plaques et révèle que la migration cellulaire en hypoxie seule est d environ 2,5 fois celle en normoxie. En présence de berbérine en hypoxie, le taux de migration cellulaire redescend au niveau basal, la migration cellulaire induite par l hypoxie est contrée complètement par l ajout de berbérine (figure 10). Induction de la dégradation de HIF-1α Un western blot sur les cellules SC-M1 en hypoxie seule et en hypoxie traitées à la berbérine. L expression de HIF-1α en hypoxie seule, disparaît par l ajout de berbérine dans le milieu de culture (figure 11.A). Une RT-PCR sur les même cellules, traitées de 0 à 36h durant, à la berbérine, ne fait apparaître aucun changement du taux de messager de HIF-1α (figure 11.B). La berbérine a bien une action sur la stabilité de la protéine et non sur sa transcription. 13

14 Rétablissement de l acétylation de HIF-1α Le western blot de l immunoprécipitation des protéines acétyl-lysine des cellules SC- M1 traitées à la berbérine en hypoxie, fait apparaître une bande qui n apparaît pas sans le traitement à la berbérine (figure 12). On peut en conclure que la berbérine rétablit l acétylation qui ne se faisait plus en hypoxie seule, et par conséquent, le mécanisme de dégradation de HIF-1α par le protéasome. 14

15 Conclusion et discussion La berbérine est une molécule à visé thérapeutique très prometteuse, elle rétablit l acétylation de HIF-1α perdue dans les cellules tumorales soumises à l hypoxie, et ainsi conduit à sa dégradation. On retrouve le phénotype des conditions de normoxie, en hypoxie tumorale. Sans HIF-1α, il n y a plus d angiogénèse et sans angiogénèse, la vascularisation et l oxygénation de la tumeur sont très compromises. Il reste à étudier la toxicité potentielle de la berbérine, son mécanisme d action exact et de réaliser par la suite une étude de «drug design», de cette façon à espérer améliorer ses effets et de pouvoir la combiner à d autres molécules. References. (1) Hypoxia-inducible factor (HIF-1)α: its protein stability and biological functions. Ji-Won Lee et al. Exp. Mol. Med (2) Loss of HIF-1 in endothelial cells disrupts a hypoxia-driven VEGF autocrine loop necessary for tumorigenesis. Tang et al. CANCER CELL, (3) Signalling via the hypoxia-inducible factor-1a requires multiple posttranslational modifications. Brahimi-Horn et al. CELLULAR SIGNALLING, (4) Regulation and Destabilization of HIF-1 by ARD1-Mediated Acetylation. Joo-Won et al. CELL, (5) Berberine Inhibits HIF-1 Expression via Enhanced Proteolysis. Lin et al. MOLECULAR PHARMACOLOGY, (6) HIF α targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2 sensing. Ivan et al. Science

16 . (7) Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain: a hypoxic switch. Lando et al. Science 2002a. (8) FIH-1 is an asparaginyl hydroxylase enzyme that regulates the transcriptional activity of hypoxia-inducible factor. Lando et al. Genes Dev. 2002b. (9) Targeting HIF-1 for cancer therapy. Semenza et al. Nat Rev Cancer (10) Induction of phosphoglycerate kinase 1 gene expression by hypoxia. Roles of ARNT and HIF1alpha. Li et al. J Biol Chem (11) Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of HIF-1α. Jiang et al. J Biol Chem