SVANOVIR MG-Ab. Mycoplasma gallisepticum Test d anticorps

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1 SVANOVIR MG-Ab Mycoplasma gallisepticum Test d anticorps

2 Contenu N d article Microplaque / Microtitre plate Microplaque (96 puits) sensibilisée avec l antigène non infectieux MG (scellée et gardée au sec). (2) 12x 8 Conjugué / Conjugate Lyophilisé (anticorps monoclonal anti-mg conjugué à la peroxydase) 2 Solution de PBS Tween / PBS-Tween Solution Concentrée 20 x Solution de substrat / Substrate Solution (TMB contenant H2O2) - CONSERVER Á L OBSCURITÉ! Solution Stop / Stop Solution Contient de l acide sulfurique (2M) - CORROSIF A. Sérum Contrôle Positif / Positive Control Serum -Contient des conservateurs 1 x 125 ml 1 x 20 ml 1 x 10 ml 1 x 2.5 ml B. Sérum Contrôle Négatif / Negative Control Serum - Contient des conservateurs 1 x 2.5 ml Cette notice concerne le kit SVANOVIR MG-Ab ELISA kit: Article number SVANOVIR MG-Ab 2

3 SVANOVIR MG-Ab Mycoplasma gallisepticum Test d anticorps Nom et application SVANOVIR MG-Ab est un kit de détection immunoenzymatique (ELISA) pour la détection d anticorps spécifiques dirigés contre MG dans le sérum et le jaune d œuf à partir de différentes espèces aviaires. Informations générales Mycoplasma gallisepticum (MG) est une infection qui se produit naturellement chez les poulets et les dindes, et répandue mondialement. Elle est communément décrite comme une maladie respiratoire chronique (MRC) chez le poulet ou une sinusite infectieuse chez les dindes. Les signes les plus caractéristiques de la maladie sont les râles respiratoires, toux, écoulement nasal chez le poulet et la sinusite chez les dindes. Les autres hôtes naturels peuvent être les faisans, perdrix, cailles, paons, perroquets, canards et les oies. Les manifestations cliniques sont généralement lentes à se développer et la maladie a un long parcourt, et provoque une baisse de production d œuf chez les poules pondeuses. Dans les élevages de poulets, la plupart des épidémies se produisent entre 4-8 semaines d âge et les signes d infection sont souvent renforcés par d autres infections respiratoires et Escherichia coli. Il semble y avoir un lien direct entre la séropositivité et la protection contre la maladie. La perte économique due à la réduction de la croissance, à la baisse de production d œufs et à l augmentation des coûts des médicaments fait de cette infection une des maladies les plus coûteuses à laquelle est confrontée l industrie de la volaille. Principe La méthode du kit repose sur un test de compétition en phase solide (ELISA). Dans cette méthode, les échantillons sont exposés à l antigène MG non infectieux dans les puits de la microplaque. Si les anticorps MG sont présents dans l échantillon testé, ils se lient à l antigène viral dans le puits et bloquent les sites de l antigène. Si les anticorps MG sont absents de l échantillon, les sites vont rester libres. Quand le conjugué HRP est ajouté, il se lie aux sites libres sur le virus. L excès non lié et éliminé par rinçages avant l ajout de la solution de substrat. Une couleur bleue se développe qui est due à la conversion du substrat par le conjugué. Un résultat négatif est indiqué par l apparition d une couleur bleue. La réaction est arrêtée par l ajout de la solution stop ; la couleur vire au jaune. Le résultat est lu par un spectrophotomètre pour microplaque, où la densité optique (DO) est mesurée à 450 nm. SVANOVIR MG-Ab 3

4 Matériels nécessaires mais non fournis 1. Micropipettes de précision 2. Embouts jetables pour micropipette 3. Eau distillée, déionisée ou de l eau ultrapure 4. Pipette à canaux multiples ou laveur de microplaques 5. Récipient de 1 à 2 litres pour le PBS Tween 6. Spectrophotomètre à microplaques (filtre de 450 nm) Information sur les échantillons Sérum : 50 µl de sérum ou du plasma sont nécessaires pour chaque puits. Des échantillons frais, réfrigérés ou congelés sont utilisables. Jaune d œuf: 20µl de jaune d œuf sont nécessaires pour chaque puits. Préparation des réactifs : Tampon PBS-Tween: Diluer au 1/20 la solution concentrée de PBS-Tween dans de l eau purifiée. Préparer 500 ml par plaque en diluant 25 ml dans 475 ml d eau et bien mélanger. N.B. Avant la dilution, s assurer qu il ne reste pas de cristaux dans le tampon. Pour dissoudre les restes de cristaux, réchauffer et bien mélanger. Conjugué anti-mg : Reconstituer le conjugué HRP lyophilisé avec 11,5 ml de tampon PBS-Tween dilué. Ajouter soigneusement le tampon dans la bouteille. Laisser reposer la solution une minute puis la vortexer. Préparer immédiatement avant l emploi. Le conjugué reconstitué restant peut-être stocké à -20 C pendant 4 semaines puis décongelé et recongelé jusqu à 3 fois. Pré-dilution des échantillons de jaune d œuf : Pour tester les échantillons de jaune d œuf, ils doivent être pré-dilués au 1/5 dans du tampon PBS-Tween dilué et mélangés. Précautions 1. Lire attentivement les instructions et s y conformer strictement. 2. Conserver le kit et tous les réactifs entre 2-8 C. 3. Laisser les réactifs atteindre la température ambiante entre C avant utilisation. 4. Manipuler tout le matériel conformément aux bonnes pratiques de laboratoire. 5. Ne pas mélanger les composants ni les manuels de différents lots de kits. 6. Prendre soin d éviter toute contamination des composants du kit. 7. Respecter la date de péremption du kit. 8. Ne pas manger, boire, ni fumer là où sont manipulés les échantillons et les réactifs. 9. Changer d embout de micropipette pour chaque échantillon. 10. Ne jamais pipeter à la bouche. 11. Inclure des contrôles de sérum négatif et positif sur chaque plaque ou série de barrettes. 12. N utiliser que de l eau distillée, déionisée ou ultrapure pour la préparation des réactifs. 13. Lors de la préparation des tampons, mesurer le volume requit. 14. La solution stop contient de l acide sulfurique qui est corrosif. 15. L élimination des matériaux biologiques doit être réalisée dans le respect des réglementations locales, régionales et nationales. Recommandations! Le volume des réactifs est suffisant pour au moins 10 tests séparés. Les barrettes dont l emballage est ouvert peuvent être conservées entre 2-8 C pendant 4 semaines au maximum. Le conjugué reconstitué ne doit pas être stocké au réfrigérateur. SVANOVIR MG-Ab 4

5 Protocole 1. Laisser les réactifs atteindre la température ambiante C avant utilisation. Numéroter toutes les barrettes. 2. Ajouter 100 µl de contrôle positif (réactif A) et 100 µl de contrôle négatif (réactif B) dans les puits sélectionnés. Pour une confirmation, il est recommandé d utiliser les contrôles en duplicat. 3. Ajouter les échantillons Sérum échantillons A. Ajouter 50 µl de tampon PBS-Tween dilué dans chaque puits qui sera utilisé pour les échantillons sérums. B. Ajouter 50µl d échantillon sérum dans les puits sélectionnés. Échantillons de jaune d œuf Ajouter 100 µl d échantillon de jaune d œuf prédilué dans les puits sélectionnés. Les échantillons peuvent être testés en simple ou en doublons. Toutefois, pour un test de confirmation, il est recommandé de tester les échantillons en doublons. 4. Couvrir la plaque et l incuber pendant 30 minutes à température ambiante C 5. Laver la plaque/les barrettes 3 fois avec 300µL de tampon PBS-Tween dilué : à chaque cycle de lavage, remplir les puits, vider la plaque, et tapoter sur du papier absorbant pour éliminer les restes de liquide. 6. Ajouter 100µl de conjugué HRP dans chaque puits. Couvrir la plaque et incuber à pendant 30min à température ambiante C. 7. Répéter l étape 5 8. Ajouter 100 µl de solution de substrat dans chaque puits. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante C. Commencer le décompte quand le premier puits est rempli. 9. Arrêter la réaction en ajoutant 50µl de la solution stop dans chaque puits et mélanger. Ajouter la solution stop dans le même ordre que la solution de substrat (étape 8). 10. Mesurer la densité optique (DO) des contrôles et des échantillons à 450 nm à l aide d un spectrophotomètre pour microplaques. Mesurer la DO dans les 15 minutes suivant l ajout de la solution d arrêt afin d éviter les fluctuations des valeurs de DO. Calculs 1. Calculer les valeurs de DO moyennes pour chacun des contrôles et échantillons. 2. Calculer la valeur de pourcentage d inhibition (PI) pour le contrôle positif et les échantillons, en utilisant la formule suivante : PI = DO contrôle Négatif DO échantillons ou contrôle positif DO contrôle Négatif x100 Interprétation des résultats Critère de validité Pour garantir la validité de l essai, les valeurs de DO des duplicats du contrôle négatif ne doivent pas différer de plus de 25% de la valeur moyenne de ces duplicats. En outre, les valeurs des contrôles doivent être comprises dans les limites suivantes : DO Contrôle Négatif > 0.6 PI Contrôle Positif > 40 Pour les tests invalides, la technique peut être suspectée et l essai doit être répété. Interprétation PI > 40 Positif PI Douteux PI < 30 Négatif Les échantillons avec un PI entre 30 et 40 sont considérés comme douteux et doivent être re-testés. Si les résultats sont encore douteux, l élevage devra être ré-échantillonné et testé à nouveau sous jours. SVANOVIR MG-Ab 5

6 Produit par SVANOVA Distribué par BIOSELLAL SAS Bâtiment Accinov 317 Avenue Jean Jaurès LYON France +33 (0) Support technique +33 (0) SVANOVIR MG-Ab 6

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