MODE OPERATOIRE. Pyroséquençage 18s : Première PCR (amorces FF390/FR1) + nested MID-adaptateur. Pyroséquençage 18s. PCR1 (FF390/FR1) + nested (mids)

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1 Version : 0 Page : 1 / 8 Pyroséquençage 18s PCR1 (FF390/FR1) + nested (mids) Version Date Modificateur Descriptif 0 13/12/2013 M. Lelievre Création du document

2 Version : 0 Page : 2 / 8 1- Mots clés PCR, champignons, pyroséquençage, 18s 2- Objectif / principe Le pyroséquençage est une technique de séquençage haut-débit qui permet de produire jusqu à 1 million de séquences par RUN avec la technologie 454 GS-FLX et environ séquences avec la technologie 454 JUNIOR. Cette technique permet de s affranchir de l étape de clonage (donc gain de temps et d argent) et nécessite seulement une PCR. A l heure actuelle, les séquences obtenues sont en moyenne de 450bp. Le pyroséquençage du gène codant pour l ARNr 18S s appuie sur l amplification PCR d une région de ce gène. La préparation des échantillons se fait en 2 étapes de PCR : une étape de PCR avec les amorces cibles FF390/FR1 seules ciblant l ensemble des taxons présents dans l échantillon, une étape de PCR emboitée (ou nested-pcr) avec comme matrice ADN le premier produit PCR, en utilisant les amorces FR1-adaptateurB / FF390-MID-adaptateurA. L amorce FF390 est supplémentée, en plus de sa séquence commune, d un MID (ou Multiplex Identifier, correspondant à une séquence de quelques nucléotides en 5 ) qui permettra de définir l origine de la séquence obtenue dans le pool de séquences final. Le jeu d amorce contient également des adaptateurs A ou B qui permettent de réaliser le séquençage. A ce jour, 35 MIDs sont disponibles permettant de mélanger 31 échantillons sur un même RUN. Donc 31 échantillons peuvent être poolés dans un même tube pour un seul RUN. Ce mode opératoire décrit ces 2 réactions PCRs pour amplifier une région du 18S à l aide d une polymérase thermostable pour étudier la diversité et la structure des communautés présentes au sein de l échantillon. 3- Consignes de sécurité Port de gants et blouse obligatoire 4- Durée de l expérience 1 à 2 heures de préparation des ADNs selon la quantité Environ 2 heures de PCR dans le thermocycleur pour la première PCR Environ 45 minutes de PCR emboitée 5- Matériel et produits nécessaires Matériel spécifique : thermocycleur 9700 Applied Biosystem (utiliser toujours le même) Produits et consommables : - Stock biologie moléculaire (ss-sol conservatoire GenoSol) : dntp, T4, eau 5 PRIME, Taq - Spécifiques : amorces (congélateur PCR)

3 Version : 0 Page : 3 / 8 6- Méthode (G.E-TR-076) a. Première PCR Remarques préliminaires : Réserver et allumer le thermocycleur voire la hotte PCR avant de commencer Une seule pcr par échantillon est nécessaire pour cette première PCR pyro 18s 1. Dans la salle PCR (JAMAIS D ADN DANS CETTE SALLE), sortir dans une boîte opaque les produits nécessaires au mix pour la décongélation sauf les enzymes : tampon 10X SANS MgCl2, MgCl2, dntp, primers (10µM). Un bloc froid -20 C bleu est disponible pour sortir les enzymes. 2. Nettoyer la hotte pcr avec du RNA/DNA away. 3. Sous la hotte PCR, glisser sous la hotte une paire de gants, l eau 5PRIME, un bloc froid 96 puits et les microtubes/barrettes qui vont être utilisés. 4. Allumer les UV (15-20 minutes environ). 5. Une fois les UV éteints, noter les tubes et préparer le mix selon le tableau suivant et dans l ordre. Le mix ci-dessous est valable pour 1 échantillon. Multiplier chaque volume par le nombre d échantillons + témoin négatif (*2 : un qui sera fermé sous la hotte et un après avoir mis tous les ADN dans les tubes)/positif + étalon interne. Produit (concentration initiale) Tampon 10X (SANS MgCl2) Kit Roche avec Taq MgCl2 (25mM) Kit Roche avec Taq dntp (25 mm each) Roche Primer 1 (R888) (10µM) Eurogentec Primer 2 (F479) (10µM) Eurogentec H2O 5 PRIME Taq polymérase ** (3 U/µL) High fidelity Roche T4 gene 32** (500 µg/ml) MP Bio Mix/ech (µl) Rôle du produit 2.5 Assure la stabilité du ph optimal pour la Taq (8,3 > ph > 8,8) 3 0,2 Elongation du brin néosynthétisé. Tous les nucléotides doivent avoir la même concentration (supérieure au Km des ADN polymérases) afin d éviter les erreurs de réplication 1 Oligonucléotides (20 à 25 bases) encadrant la séquence cible. 1 Oligonucléotides (20 à 25 bases) encadrant la séquence cible ,6 1,25 Eau totalement déionisée pour ne pas modifier la concentration en sels à laquelle agit la polymérase. Enzyme thermostable qui assure l élongation du brin complémentaire à partir d une amorce nucléotidique. Enzyme protectrice de la Taq polymérase et de son action contre les inhibiteurs de PCR pouvant contenir les ADNs de sol Mix à répartir par tube 23 Sur portoir réfrigéré Sortir de la hotte PCR avec les tubes fermés et aller dans un laboratoire d ADN analytique et ajouter les ADN aux mixs.

4 Version : 0 Page : 4 / 8 Vortexer (après décongélation totale) tous les tubes avant utilisation, sauf les enzymes qu il faut homogénéiser par aspiration/refoulement pour ne pas les abîmer. * * Les enzymes (Taq et T4) sont à ajouter au mix au dernier moment. Il faut donc les sortir juste avant utilisation dans un bloc froid -20 C étant donné leur sensibilité aux variations de chaleur. Toutes les manipulations se feront à partir de maintenant en dehors de la salle PCR pour éviter toute contamination des futures PCRs 6. Ajouter 2µl d ADN préalablement dilué à 2,5ng/µl à chaque tube de PCR sans oublier les témoins négatif (mix seul) et positif (mix + souche). 7. Placer les tubes dans le thermocycleur après avoir fait préchauffer le couvercle à 105 C. Vérifier et lancer le programme: temps t Dénaturation 3min 94 C Dénaturation 30sec 94 C Hybridation 1 min 52 C Elongation 1min 72 C x35 cycles Elongation finale 5min 72 C Conservation infini 18 C A cette étape, les PCRs peuvent être stockées au réfrigérateur à 4 C pour une durée limitée (24/48H) ou au congélateur à -20 C pour une longue durée. Les PCR sont vérifiées sur gel agarose 2% puis purifiées par AMPure (1 AMPure/produit PCR) sauf les témoins négatif et positif. Les témoins négatifs et positifs sont à jeter. L élution finale se fait dans 25µl de tampon Roche. Les produits PCR purifiés sont ensuite quantifiés purs au Quantifluor. Si vous observez des amorces hybridées entre elles en grande quantité sur votre gel, prévenez votre référent technique. b. PCR nested sur produits de la première PCR Remarques préliminaires : Réserver et allumer le thermocycleur 9700 Applied biosystem (le même que pour la PCR1) voire la hotte PCR avant de commencer, Une seule répétition de PCR par échantillon est suffisante pour cette seconde PCR nested pyro 18S. 1. Dans la salle PCR (JAMAIS D ADN DANS CETTE SALLE), sortir dans une boîte opaque les produits nécessaires au mix pour la décongélation sauf les enzymes : tampon 10X avec MgCl2, dntp, primers (10µM). Un bloc froid -20 C bleu est disponible pour sortir les enzymes. 2. Nettoyer la hotte pcr avec du RNA/DNA away. 3. Sous la hotte PCR, glisser sous la hotte une paire de gants, l eau 5PRIME, un bloc froid 96 puits et les microtubes/barrettes qui vont être utilisés.

5 Version : 0 Page : 5 / 8 4. Allumer les UV (15-20 minutes environ). 5. Une fois les UV éteints, noter les tubes et préparer un mix global à répartir en sous-mix par jeu d amorce selon le tableau suivant et dans l ordre. Le mix ci-dessous est valable pour 1 échantillon et un jeu d amorce + MID/adaptateur. Multiplier chaque volume par le nombre d échantillons. Produit (concentration initiale) Tampon 10X (avec MgCl2) Kit Roche avec Taq dntp (25 mm each) Roche Primer 1 (FF390-mid-A) (10µM) Eurogentec Primer 2 (FR1-B) (10µM) Eurogentec H2O 5 PRIME Taq polymérase ** (3 U/µL) High fidelity Roche T4 gene 32** (500 µg/ml) MP Bio Mix/ech (µl) Rôle du produit 2.5 Assure la stabilité du ph optimal pour la Taq (8,3 > ph > 8,8) 0,2 Elongation du brin néosynthétisé. Tous les nucléotides doivent avoir la même concentration (supérieure au Km des ADN polymérases) afin d éviter les erreurs de réplication 0.5 Oligonucléotides (20 à 25 bases) encadrant la séquence cible. 0.5 Oligonucléotides (20 à 25 bases) encadrant la séquence cible. 17,45 0, Mix à répartir par tube 23 Sur portoir réfrigéré Eau totalement déionisée pour ne pas modifier la concentration en sels à laquelle agit la polymérase. Enzyme thermostable qui assure l élongation du brin complémentaire à partir d une amorce nucléotidique. Enzyme protectrice de la Taq polymérase et de son action contre les inhibiteurs de PCR pouvant contenir les ADNs de sol Sortir de la hotte PCR avec les tubes fermés et aller dans un laboratoire d ADN analytique et ajouter les ADN aux mixs. Vortexer (après décongélation totale) tous les tubes avant utilisation sauf les enzymes qu il faut homogénéiser par aspiration/refoulement pour ne pas les abîmer. * * Les enzymes (Taq et T4) sont à ajouter au mix au dernier moment. Il faut donc les sortir au dernier moment dans un bloc froid -20 C étant donné leur sensibilité aux variations de chaleur. Toutes les manipulations se feront à partir de maintenant en dehors de la salle PCR pour éviter toute contamination des futures PCRs 6. Ajouter 2µL d ADN préalablement dilué à 2,5ng/µl à chaque tube de PCR sans oublier le témoin négatif (mix+produit pcr témoin négatif PCR1). 7. Placer les tubes dans le thermocycleur après avoir fait préchauffer le couvercle à 105 C.

6 Version : 0 Page : 6 / 8 Vérifier et lancer le programme: temps t Dénaturation 3min 94 C Dénaturation 1 min 94 C Hybridation 1 min 52 C Elongation 1min 72 C Elongation finale 5min 72 C Conservation infini 18 C 7 cycles Les PCR sont vérifiées sur gel agarose 2% et purifiées sur kit Qiagen MinElute (volume final 10µl avec du TE Roche 1X). Les produits PCR purifiés sont ensuite quantifiés au Quantifluor (après dilution au 1/3 ème avec une prise d essai de 2µL minimum de produit PCR). A cette étape, les PCRs peuvent être stockées au réfrigérateur à 4 C pour une durée limitée (24/48H) ou au congélateur à -20 C pour une longue durée. La préparation de la banque nécessite de préparer un mélange équimolaire de 1000 à 2000ng (selon les volumes à apporter pour être précis) et purifier le mélange par AMPure. Ce mélange sera dosé par fluorométrie (quantifluor) puis le nombre de copies de 18S/µL sera estimé avant envoi pour séquençage. Nb copies 18SµL = (Cadn (g/µl)*nombre Avogadro)/(taille 18S (pb)* poids moléculaires d une pb) amorce sens-adapt cible (18S) amorce anti-sens-mid-adapt taille 18S pb Navogadro 6,02E+23 PM (1pb) Réactifs chimiques, éléments de sécurité Néant 8- Evacuation des déchets Les microtubes et autres consommables sont éliminés dans des poubelles jaunes de laboratoire prévues à cet effet. Ces poubelles sont évacuées tous les mardis matins par une société privée. Les boites de cônes Sorenson et P2-P10 bleus Dutscher sont à évacuer dans les cartons de recyclage à l extérieur et au RDC du bâtiment Dommergues côté entrée TRAM. Des cartons sont disponibles à l intérieur des différents laboratoires.

7 Version : 0 Page : 7 / 8 Les papiers/gants sont à évacuer dans les poubelles classiques de déchets ménagers. 9- Référence(s) bibliographique(s) Berry D, Ben Mahfoudh K, Wagner M and Loy A. Barcoded primers used in multiplex amplicon pyrosequencing bias amplification. Appl Environ Microbiol (2011) - 77(21):

8 Version : 0 Page : 8 / 8 ANNEXE : Liste des séquences des amorces PCR1 : Oligo sens (FF390): CGATAACGAACGAGACCT Oligo antisens (FR1) : ANCCATTCAATCGGTANT PCR nested : Chacun des MIDs disponibles à ce jour ont été validés par un RUN de pyroséquençage réalisé sur un seul ADN de sol amplifié avec chacun. MID007 CGTGTCTCTA MID093 CGAGACGCGC MID010 TCTCTATGCG MID094 CGTATGCGAC MID013 CATAGTAGTG MID095 CGTCGATCTC MID017 CGTCTAGTAC MID129 CAGACGTCTG MID019 TGTACTACTC MID132 CGATCTGTCG MID021 CGTAGACTAG MID160 CGTGAGCTGA MID034 CACGCTACGT MID161 CGCGACATCT MID035 CAGTAGACGT MID162 CGTGCTGTGT MID036 CGACGTGACT MID163 CGCACGCTGT MID055 CGATCGTATA MID164 CGCTATCTAT MID056 CGCAGTACGA MID166 CATAGTGACA MID057 CGCGTATACA MID167 CATCGAGCAG MID058 CGTACAGTCA MID169 CGAGCTCATG MID059 CGTACTCAGA MID170 CATATCTCGT MID089 CACGTAGATC MID171 CGATCACAGT MID090 CACGTGTCGC MID172 CGAGCTAGCT MID091 CATACTCTAC MID174 CACAGAGCTA MID092 CGACACTATC