Colloque GFP Bordeaux

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1 Colloque GFP Bordeaux Développement d un test de screening en microplaques pour l évaluation de la toxicité de pesticides chez deux espèces de microalgues marines SESSION 2 : «IMPACT ENVIRONNEMENTAL» Mardi 17 mai 2016 Valentin Dupraz, Sabine Stachowski-Haberkorn, Dominique Ménard, Marie-Hélène Devier, Hélène Budzinski, Farida Akcha

2 Problématique France : 1 er pays utilisateur de pesticides en Europe ( tonnes en 2012, UIPP) : Agriculture Pesticides Cours d eau Eaux côtières Impacts sur les organismes aquatiques? Aval Source : INRA Amont Eaux côtières 2

3 Projet PHYTOCOTE Usage des produits phytosanitaires dans les agrosystèmes, transferts potentiels vers les écosystèmes et effets des changements de pratiques agricoles ( ) Site d étude : Bassin versant expérimental de Marcillac (Blayais, Gironde) 626 ha de surface agricole utile 444 ha de vignes Contact avec les acteurs locaux 3

4 Objectifs Objectifs de la thèse : 1. Caractériser la contamination chimique d un milieu aquatique exposé à une source d émission connue (principalement viticulture) Déploiement de POCIS : différents lieux et périodes Disques en acier inoxydable Sorbant Membranes POCIS Source : INRA Amont Aval Eaux côtières 4

5 Objectifs Objectifs de la thèse : 2. Tester la toxicité des extraits de POCIS Producteurs primaires (phytoplancton) 2 microalgues marines : Tisochrysis lutea (Tiso) & Skeletonema costatum (Skc) Consommateurs primaires (huîtres) Larves d huître (Crassostrea gigas) SCREENING PHYTO SCREENING HUITRES Choix des molécules les plus pertinentes 3. Étudier le transfert et la toxicité des pesticides par voie trophique sur des consommateurs primaires 5

6 Principe Screening Phyto Miniaturisation du test de toxicité en ballons de culture : Tester un grand nombre de conditions simultanément = SCREENING Stabilité chimique des molécules dans les microplaques Reproductibilité des tests microplaques/ballons de culture Validation avec des contaminants modèles 1. Détermination de CE 50 pour une large gamme de pesticides : Susceptibles d être retrouvés sur la zone d étude et ubiquistes 2. Application aux extraits de POCIS 6

7 Méthodologie Screening phyto Utilisation de microplaques 24-puits : 6 réplicats témoins solvant (Ts ; % max) ; 3 réplicats témoins sans solvant (T) 5 concentrations testées simultanément, 3 réplicats par concentration Molécules testées : Herbicides Diuron S-métolachlore Glyphosate Insecticides Fipronil Imidaclopride + solvants (méthanol & DMSO) Ts1 Ts2 Ts3 C1 C1 C1 C2 C2 C2 C3 C3 C3 T2 T2 T2 C4 C4 C4 C5 C5 C5 Ts4 Ts5 Ts6 Durée du test : 96 h Mesure quotidienne de la fluorescence à 684 nm Taux de croissance µ (h -1 ) : LL FF = µt + F 0 CE 50 basée sur le µ 96 h calculée avec la macro RegTox (Eric Vindimian ) Possibilité de tester 4 pesticides sur les deux espèces simultanément! 7

8 Résultats Stabilité chimique Analyses chimiques par LC-MS/MS : Tests abiotiques (sans microalgues) : 2 milieux de cultures : f/2 (Tiso) et f/2-si (Skc) Aucune diminution de la concentration observée Augmentation au bout de 96 h = évaporation du milieu Analyse des autres molécules prévue ultérieurement 8

9 Résultats Validation du SCREENING 5 4,5 4 Tisochrysis lutea 3,69 3,93 Ballons Microplaque Skeletonema costatum 18,52 Ballons Microplaque CE 50 diuron (µg.l -1 ) 3,5 3 2,5 2 1,5 CE 50 diuron (µg.l -1 ) ,63 1 0, µ_0-96 h CE 50 similaires entre ballons et microplaque 0 µ_0-96 h CE 50 de la microplaque supérieure «Effet diuron» lié au mode d action TEST VALIDÉ TEST NON VALIDÉ 9

10 Résultats Validation du SCREENING CE 50 diuron (µg.l -1 ) 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 Tisochrysis lutea 3,69 3,93 Ballons Microplaque CE 50 S-métolachlore (µg.l -1 ) Skeletonema costatum 106,03 94,48 Ballons Microplaque 0 µ_0-96 h CE 50 similaires entre ballons et microplaque 0 µ_0-96 h CE 50 assez similaires entre ballons et microplaque TEST VALIDÉ TEST VALIDÉ 10

11 Résultats 1 er SCREENING Molécules S-métolachlore Glyphosate Imidaclopride Fipronil Concentrations Tiso (µg.l -1 ) Concentrations Skc (µg.l -1 ) 30 ; 60 ; 90 ; 120 ; 150 % maximum de méthanol = 0,04% 200 ; 400; 600 ; 800 ; ; 400; 600 ; 800 ; 1000 Skc : Amélioration de la CE 50 pour le S-métolachlore : 85,2 µg.l -1 [80,1 ; 90,9] Autres molécules : aucun effet significatif mis en évidence Tiso : aucun effet significatif mis en évidence Nécessité d augmenter les concentrations pour obtenir des CE 50 11

12 Résultats 2 ème SCREENING Molécules S-métolachlore Glyphosate Imidaclopride Fipronil Concentrations Tiso (mg.l -1 ) Concentrations Skc (mg.l -1 ) % maximum de méthanol et DMSO = 0,08% 1 ; 2; 4 ; 8 ; 16 1 ; 2; 4 ; 8 ; 16 Skc : Obtention d une CE 50 pour le glyphosate : 19,7 mg.l -1 [18,1 ; 22,5] Tiso : Effet significatif du S-métolachlore à 16 mg.l -1 : 10% d inhibition Solvants et imidaclopride : aucun effet significatif Problème de solubilité Problème de solubilité Sensibilité variable selon les molécules Insecticides semblent peu toxiques sur ces microalgues 12

13 Discussion et perspectives Avantages : économie de matériel, d espace et de temps Inconvénients : biais liés à la fluorescence ; moins précis que la densité cellulaire Remplit la fonction de SCREENING Obtention de CE 50 pour une large gamme de pesticides Application à des modèles de prédiction des effets mélanges Concentration Addition (Loewe and Muischnek, 1926) Independant Action (Bliss, 1939) Séjour dans l équipe de Nina Cedergreen (Copenhague, Danemark) Nature des interactions entre les molécules Meilleure compréhension des effets des extraits de POCIS 13

14 Conclusion Extraits de POCIS Phytoplancton Exposition des deux premiers niveaux trophiques à des mélanges représentatifs de la zone d étude Huîtres Transfert trophique Génération de données concernant l impact éventuel des phytosanitaires utilisés en viticulture sur les deux premiers niveaux trophiques marins 14

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