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1 abc Ann Biol Clin 2004, 62 : Journée thématique de l Association française de cytométrie Microbilles et cytométrie : de l analyse cellulaire à l analyse moléculaire Institut Curie, Paris, 17 janvier 2003 Microbilles et nanobilles en microscopie : outil de réglage spatial, spectral et dynamique Application à la colocalisation moléculaire E. Kahn Inserm U 494, CHU Pitié-Salpêtrière, 91, boulevard de l Hôpital, Paris kahn@imed.jussieu.fr Tirés à part : E. Kahn Résumé. L article développe une méthodologie de recherche basée sur l utilisation des billes fluorescentes, qui est applicable aux préparations cellulaires ou tissulaires marquées en fluorescence et observées sur des microscopes confocaux à balayage laser. Les billes fluorescentes servent à simuler les fluorochromes et déterminent leur détectabilité dans les préparations. Elles permettent en outre de vérifier que les appareils de mesure sont correctement alignés pour que les images permettant de juger de la co-localisation soient pertinentes. Les méthodes d analyse factorielle appliquées aux séquences d images obtenues sur cet appareil permettent de séparer les fluorochromes ayant servi à marquer les sites sur les préparations. Les propriétés physico-chimiques des fluorochromes servent à cette décomposition : spectres d émission et dynamiques d extinction. Les séquences d images sont obtenues soit par sélection spectrale à l aide d une série de filtres, soit par balayages successifs de la préparation maintenue immobile. En ce qui concerne l aspect tridimensionnel, les séquences obtenues par déplacement en profondeur sont décomposées et permettent de restituer les plans d observation, tout en améliorant la lisibilité des préparations. Ces plans d observation qui sont décalés en cas de mauvais alignement des sources d excitation peuvent alors faire l objet après recalage d une superposition d images pour réaliser la co-localisation. Mots clés : microscopie confocale, billes, traceur, analyse d image Summary. This article illustrates a methodology which can be used on cellular and tissular specimens prepared with fluorochromes and analyzed by laser scanning confocal microscopy. Fluorescent beads are used to simulate the fluorochromes and they determine their detectability inside the preparations. They can also be used to verify that the microscopes are set properly so that the resulting images can be analyzed and are reliable to evaluate possible colocalizations. Methods of factor analysis are applied to optical section series obtained on the microscope to characterize the fluorochromes that are used to stain different locations of the specimen. Photophysical properties (emission spectra, decay rates) of the fluorochromes are used to obtain the differentiation. Section series are obtained either by spectral selection via a sequence of filters or by successive scans of the same specimen. Concerning the threedimensional analysis, differentiation of series that are obtained by z displacement leads to the restoration of focal planes and improves the legibility of specimens. These planes which are not at the same depth when the excitation sources are not aligned can the be superimposed to achieve the co-localization. Key words: confocal microscopy, microsphere, tracer, image processing Ann Biol Clin, vol. 62, n 1, janvier-février

2 Le microscope confocal à balayage laser [1] améliore le microscope à fluorescence classique [2, 3] par la réalisation d une optimisation du chemin optique en chaque point de l image qui est obtenue par balayage de l ensemble de l échantillon observé. Le principe de base pour observer les échantillons fluorescents est d augmenter au maximum la lumière reçue tout en minimisant l excitation, ce qui est réalisé en utilisant des lasers comme source et des photomultiplicateurs comme détecteurs. Les molécules fluorescentes dans l échantillon absorbent et émettent à des longueurs d onde caractéristiques. Des filtres sont choisis pour obtenir le meilleur rendement à l excitation et à l émission. Ils sont calculés pour encadrer les spectres d excitation et d émission de chacun des fluorochromes. Les filtres ou les miroirs dichroïques permettent de séparer l excitation de l émission. En fluorescence classique, les sources sont des lampes (tungstène, quartz - halogène, xénon et mercure) et leurs caractéristiques spectrales sont utilisées pour exciter les fluorochromes. En microscopie confocale, elles sont remplacées par des lasers qui fournissent la lumière monochromatique nécessaire à l imagerie ponctuelle de ces microscopes. Le laser argon est souvent utilisé car il réalise deux pics d émission, l un à 488 nm et l autre à 514 nm. Ces pics sont intéressants pour exciter respectivement la fluorescéine isothiocyanate (FITC) qui est un fluorochrome très courant et facile à utiliser et le tétraméthyl rhodamine isothiocyanate (TRITC) qui le remplace progressivement car il est plus spécifique. Un collimateur (ouverture numérique) est placé à l émission devant le détecteur pour réduire la lumière émise en dehors du plan focal. Les objectifs doivent avoir des propriétés de transmission élevées et ne pas développer d autofluorescence interne. L huile d immersion doit également ne pas développer d auto-fluorescence. De la qualité des objectifs dépend le bon recueil de la lumière et une bonne résolution que l on peut traduire en terme d ouverture numérique élevée. D un objectif d ouverture numérique de 1.4 résulte une profondeur de champ d environ 0.6 µm. La principale contrainte vient du blanchiment des fluorochromes qui est fonction du temps d observation, qui dans le cas de la FITC est rapide, et qui s effectue à des vitesses différentes selon les fluorochromes. Certains fluorochromes comme l iodure de propidium sont très stables. Ces vitesses peuvent servir à les différencier dans le cas des multimarquages. À partir de ces éléments, l utilisation des billes vient permettre de bien caractériser chacun des éléments de la chaîne d acquisition tant en terme de fluorescence qu en terme de résolution spatiale. Les billes fluorescentes sont des outils qui modélisent les fluorochromes et permettent de vérifier leur détectabilité et de conditionner les caractéristiques de leur détection (choix des longueurs d onde d excitation, des filtres d émission, de l amplification et de la sensibilité du détecteur, analyse de la vitesse de blanchiment, présence d auto-fluorescence, perte de spécificité, altérations de balayage, décalages dans les chemins optiques). Une méthodologie de base est développée dans cette présentation, ainsi qu une méthodologie plus élaborée basée sur l analyse factorielle, pour que les images qui sont obtenues en microscopie confocale soient fidèles à la réalité des préparations cellulaires et tissulaires marquées en fluorescence. Méthodes Pour caractériser les fluorochromes, la méthode habituelle est d utiliser le microscope en plaçant chacun des détecteurs sur des chemins optiques séparés et d utiliser des filtres passe-bande spécifiques pour chaque fluorochrome. Les problèmes de localisation des marqueurs fluorescents qui résultent de la superposition des images peuvent être résolus a posteriori en utilisant les méthodes d analyse factorielle qui vont extraire le spectre des fluorochromes sur des préparations ayant subi un marquage multiple, sur la base des séquences spectrales acquises à l émission. Ils peuvent également être résolus a posteriori sur la base d une séquence acquise à l émission quand la dynamique de blanchiment globale (figure 1), est décomposée par l analyse factorielle de la séquence d images et que les caractéristiques spectrales ou dynamiques de chacun des fluorochromes sont restituées pour former les images relatives à chacun des fluorochromes, [4]. Les études 3D sont effectuées à partir des séquences en profondeur (coupes optiques). Des reconstructions 3D sont obtenues à l aide de logiciels commerciaux [5] ou sont développées spécifiquement en fonction de besoins plus pointus (angles d ob- Caractérisation par la vitesse de blanchiment Séquence temporelle d'images UA Laser excitation 488 émission (blanchiment) nm = a (i) x temps Image factorielle Intensité + b (i) x Image factorielle Facteurs Iodure de propidium FITC temps Figure 1. Caractérisation par la vitesse de blanchiment de nanobilles fluorescentes incluses dans une microbille, excitées par un laser argon (sélection de la longueur d onde 488 nm) : la décomposition linéaire réalisée par la méthode d analyse factorielle permet d extraire les vitesses de blanchiment des billes caractérisées par leurs fluorochromes et de former les images des billes correspondantes. 80 Ann Biol Clin, vol. 62, n 1, janvier-février 2004

3 Microbilles et nanobilles en microscopie servation particuliers). Le bruit et les variations de fond sont en général éliminés par seuillage. Le filtrage des hautes fréquences avant la reconstruction améliore l observation en éliminant les artefacts. Les distorsions peuvent être corrigées à partir de mesures réalisés en x, y, z sur des billes sphériques rigides et calibrées. L analyse en profondeur est réalisée à l aide de l analyse factorielle appliquée aux coupes optiques sériées (séquences en z) [6]. Elle caractérise et souligne les différences de profondeur et fournit des images qui correspondent à des images de plans focaux, c est-à-dire des plans où l on obtient la mise au point au microscope des objets placés sur des plans différents. Analyse d images Reprenant les techniques d analyse factorielle générales [7], l analyse factorielle des séquences d images médicales (AFSIM) a été développée pour traiter plus spécifiquement des séquences d images biomédicales [8]. Elle traite des mélanges de composés qui se caractérisent par leur comportement physique, par exemple l épaisseur des composés. Les hypothèses de linéarité sont formulées. L AF- SIM réduit les séquences d images en un nombre limité d images factorielles sur la base de courbes appelées facteurs qui sont extraites des séquences et qui résument chacune des évolutions particulières de chaque composé du mélange dans la séquence. Les pixels des matrices sont combinés en clusters. L analyse des correspondances est effectuée sur les évolutions de chaque cluster. Puis une analyse oblique est réalisée sur les résultats de l analyse des correspondances pour effectuer la recherche des facteurs positifs. Les images factorielles sont calculées sur la matrice d image d origine par projection oblique sur les facteurs. Une version de base gratuite de l AFSIM est maintenant disponible chez Apteryx ( Dans le cas des images qui sont issues du microscope confocal, les coupes optiques sont des images 2D et les séquences 3D comportent une propriété physique (vitesse de blanchiment, spectre, intensité d émission). On peut dès lors imaginer des séquences 4D qui intègrent deux propriétés physiques. Le traitement des séquences 4D a été rendu possible avec l AFSIM-4D [9]. Des séquences d images 4D dans lesquelles les propriétés spectrales et dynamiques des fluorochromes sont prises en compte sont ainsi analysées [10]. par l usage d un microscope confocal où chacun des détecteurs reçoit les émissions de chacun des fluorochromes selon un chemin optique qui lui est dédié. Quand le signal est faible cela n est généralement pas réalisable en l état et un traitement des séquences d images a posteriori se révèle nécessaire d autant que ce traitement permet de résoudre les problèmes de superposition d image et permet d extraire l auto-fluorescence comme s il s agissait un fluorochrome. L analyse factorielle permet aussi de détecter des objets en reconstruisant des images focales qui discriminent les variations de profondeur là où les méthodes classiques de reconstruction 3D se révèlent inopérantes. Rendre spécifiques les spectres d excitation et d émission des fluorochromes est nécessaire pour que les images soient crédibles. La figure 2 est une séquence spectrale qui montre qu une émission rouge peut être rendue spécifique à l observation par des billes d europium servant au test préalablement à l observation de marquages à l europium. La vitesse de blanchiment est aussi un moyen de caractérisation des fluorochromes. La figure 3 montre qu à partir de la séquence temporelle caractérisant l extinction de deux billes fluorescentes il est possible en passant par l utilisation de l analyse factorielle, non seulement de suivre l évolution temporelle de chacun des fluorochromes portés par les billes mais aussi de mettre en évidence des défauts de balayage du microscope. Des fluorochromes comme la FITC sont faciles à utiliser, mais son faible temps d émission et le fait d un spectre d émission proche de celui de l auto-fluorescence en font un outil dangereux d interprétation [11]. La TRITC est plus facile à différencier d emblée de l auto-fluorescence car elle a un temps d émission plus long même si son spectre d excitation est différent. Le couple de marqueurs Thiazole orange - Fast Red s est révélé plus fiable d interprétation que le couple de marqueurs Iodure de propidium - FITC pour caractéri- Microscopie confocale (Leica TCS SPL) (Laser Spectra Physics 2018) Billes marquées de 1 µm Europium 610 nm Résultats et discussion L accession à la position des marquages dans les préparations est le point le plus important de la démarche pour que les images réalisées soient crédibles. La solution passe 54 µm Excitation laser ultraviolet (-> rouge : de 594 à 630 nm) Figure 2. Séquence spectrale de 10 images réalisée entre 594 et 630 nm servant à caractériser l émission de billes d europium excitées en ultraviolet. Ann Biol Clin, vol. 62, n 1, janvier-février

4 ser les images ponctuelles présentées par les séquences d ADN du papillomavirus humain. L auto-fluorescence vient de l huile d immersion, du milieu de montage, des cellules et des tissus. Quand on utilise une source d excitation ultraviolette (360 nm), les phénomènes d auto-fluorescence sont accrus. Des études impliquant différentes longueurs d onde d excitation ont été réalisées par Kahn et al. [12] pour différencier des groupes de fluorochromes comme la FITC, le TRITC et le DAPI et analyser les variations dans l acquisition des images du fait de plusieurs sources d excitation sur des billes Excitation 543 nm Bille colorée à l'iodure de propidium (coupes confocales) Excitation 488 nm Microscopie confocale (Sarastro 2000) Séquence temporelle de deux billes marquées à la FITC et au Texas Red a Coupes confocales b T = 1 T = 64 Excitation : 361 & 364 nm 12,8 µm Microscopie confocale (Sarastro 2000) Séquence en profondeur (billes verte et rouge) Superposition trichrome Figure 4. Coupes confocales obtenues sur une bille marquée à l iodure de propidium et excitée sur trois longueurs d ondes différentes par trois lasers différents. Il en résulte des décalages en x, y visibles sur la superposition des coupes et des décalages en z. Images et courbes factorielles 25,6 µm Figure 3. a. Séquence temporelle réalisée sur deux billes marquées respectivement à la FITC et au Texas Red ; b. Résultat de l analyse factorielle montrant les évolutions temporelles de chacune des billes et montrant des défauts liés au balayage. Excitation : 488 nm 25,6 µm Figure 5. Série de coupes confocales réalisée en profondeur sur deux billes marquées respectivement à la FITC et au Texas Red. L intensité de fluorescence passe par un maximum quand la mise au point sur chacune des billes est la meilleure. 82 Ann Biol Clin, vol. 62, n 1, janvier-février 2004

5 Microbilles et nanobilles en microscopie de contrôle marquées à l iodure de propidium, dans un premier temps (figure 4). Cette étude a mis en évidence le décalage des images lorsque les excitations utilisées proviennent de sources différentes ( nm, 488 nm et 543 nm) et a montré la capacité à corriger les décalages en z en s appuyant sur des méthodes d analyse factorielle. Des études ont été réalisées sur des couples de billes marquées à la FITC et/ou au Texas Red et à l iodure de propidium, pour montrer la capacité à différencier des variations dans le positionnement en profondeur de ces billes [6]. La figure 5 montre une séquence en profondeur réalisée sur deux billes que l analyse factorielle (figure 6) différencie du bruit de fond dans leurs positions en Z. L ensemble de ces travaux démontre la nécessité d avoir recours à des billes de contrôle pour rendre pertinentes les interprétations basées sur les superpositions d images (colocalisations). Bruit de fond Microscopie confocale (Images et courbes factorielles) Excitation : 488 nm 25,6 µm Superposition trichrome Figure 6. Résultat de l analyse factorielle de la série de la figure 5 montrant trois plans d observation, un plan à l équateur d une bille, un plan au pôle de l autre bille, et un plan visualisant le bruit dû au montage des billes. Références 1. Pawley J. Handbook of biological confocal microscopy. Second edition. New York : Plenum Press, Wang YL, Lansing Taylor D. Fluorescence microscopy of living cells in culture. Part A. San Diego : Academic Press, Wang YL, Lansing Taylor D. Fluorescence microscopy of living cells in culture. Part B. San Diego : Academic Press, Kahn E, Hotmar J, Frouin F, et al. Spectral and dynamic confocal fluorescence characterization of cytogenetic preparations by factor analysis. Anal Cell Pathol 1996 ; 12 : Kahn E, Hotmar J, Bernheim A. 3D FISH chromosomal studies on nuclei from cytogenetic preparations by confocal microscopy. Analyt Quant Cytol Histol 1996 ; 18 : Kahn E, Frouin F, Hotmar J, Di Paola R, Bernheim A. Confocal fluorescence analysis of the depth and focus of cytogenetic preparations. Analyt Quant Cytol Histol 1997 ; 19 : Harman HH. Modern factor analysis. Chicago : University of Chicago Press, Di Paola R, Bazin JP, Aubry F, et al. Handling of dynamic sequences in nuclear medicine. IEEE Trans Nucl Sci 1982 ; 29 : Kahn E, Lizard G, Pélégrini M, et al. Four-dimensional factor analysis of confocal image sequences (4D-FAMIS) to detect and characterize low copy numbers of human papillomavirus DNA by FISH in HeLa and SiHa cells. J Microsc 1999 ; 193 : Kahn E, Frouin F, Bruzzoni-Giovanelli H, Calvo F, Di Paola R, Linares-Cruz G. Confocal-multilabelling, ultrasensitive Tunel analysis of DNA breaks in individual cells. Analyt Quant Cytol Histol 1999 ; 21 : Kahn E, Lizard G, Frouin F, Roignot P, Chardonnet Y, Di Paola R. Laser scanning confocal microscopy and factor analysis of biomedical image sequences (FAMIS) to detect and characterize HPV DNA sequences by FISH in HeLa cells. Cytometry 1997 ; 28 : Kahn E, Frouin F, Souchier C, et al. Confocal multilaser focusing and single-laser characterization of ultraviolet excitable stains of cellular preparations. Cytometry 2000 ; 40 : Ann Biol Clin, vol. 62, n 1, janvier-février