Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale (Axe Bio-imagerie) Resp. Olivier CORITON UMR 1349 IGEPP INRA LE RHEU

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1 Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale (Axe Bio-imagerie) Resp. Olivier CORITON UMR 1349 IGEPP INRA LE RHEU

2 Offre actuelle, Contour

3 Cytogénétique Moléculaire?

4 Cytogénétique Moléculaire? née de la rencontre «Biologie moléculaire» et «Cytogénétique traditionnelle» FISH L outil principal est l Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur préparation chromosomique permet une «Analyse fine de la structure des chromosomes»

5 FISH Les outils de cytogénétique moléculaire permettent de développer des projets scientifiques d études des génomes pour : 2 à 5 Mb Caractérisation cytogénétique du matériel végétal impliquant des hybrides interspécifiques ou des espèces polyploïdes : identification des chromosomes parentaux ou introgression, Evolution structurale des génomes chez des espèces polyploïdes, Caractérisation des translocations chromosomiques par liaison entre la cartographie génétique et physique, 1 kb Cartographie physique fine sur chromosomes en méiose (stade pachytène) et sur fibres d ADN permettant la caractérisation fine de l ordre du kb autour de locus d intérêt ou la détection d un remaniement chromosomique

6 Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur chromosomes Accès aux chromosomes? 1- Chromosomes en Mitose 2- Chromosomes en Méiose

7 Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur chromosomes Accès aux chromosomes? Préparation des lames 1- Chromosomes en Mitose: Pointe de racines Sélection des lames au DAPI Le DAPI ou 4',6'-diamidino-2-phénylindole est une molécule fluorescente capable de se lier fortement aux bases adénine (A) et thymine (T) de l'adn

8 Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur chromosomes mitoses Multi-espèces Niveau de Polyploïdie : 2X 2X 2X 2X 2X 4X 4X 6X 8X Taille de 2-10 µm

9 Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur chromosomes Accès aux chromosomes? Préparation des lames 2- Chromosomes en Méiose: Anthères

10 Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur chromosomes en méiose Leptotène Zygotène Pachytène Diplotène Diacinèse Métaphase I Anaphase I Anaphase I Métaphase II Anaphase II Télophase II Tétrade Stade pachytène (les chromosomes sont appariés sur toutes leurs longueurs) Stade métaphase I Résolution x 15

11 Prestations proposées par la Plate-Forme 1- L hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures polyploides ou hybrides 2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'adn répétées (FISH) 3- Localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC-FISH) 4- Analyse Caryotypique : Comptage chromosomique

12 Prestations proposées par la plate-forme 1- L hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures : Polyploïdes ou Hybrides interspécifiques

13 Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploïde Le blé tendre, Allohexaploide 2n=6X=42 0,5 MYA Ae. speltoides A-genome T. urartu YA? B-genome D-genome

14 Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploide Mix sondes ADN Génomique D-probe-digoxgénine B-genome A-genome chromosomes «cible» Hybridation A-probe-biotine? B-genome D-genome Détection Anti-corps Fluo Anti-dig-Fluorescéine Avidin- Texas red

15 Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploïde Filtre DAPI Filtre Fluorescein Filtre Texas Red

16 Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploide Translocation 4A/7B Translocation 4A/7B

17 Exemple 2 : Techniques FISH + GISH sur Blé dur, tétraploide (AABB) Chr 1A ou 5A? 4A/7B 4A/7B Chr 1A ou 5A?

18 Exemple 3 : Technique GISH-like -> Le COLZA, Allotétraploide B. rapa AA, 2n= YA B. oleracea CC, 2n=18 B. napus AACC, 2n=38

19 Exemple 3 : Technique GISH-like -> Le COLZA, Allotétraploide Sonde ADN répétée spécifique du génome C B. rapa AA, 2n=20 B. oleracea CC, 2n=18 B. napus AACC, 2n=38

20 Exemple 4 : Technique GISH chez un hybride interspécifique Résistance à la sècheresse Fétuque x Ray-Grass Introgression Hybride

21 Prestations proposées par la Plate-Forme 1- L hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures polyploides ou hybrides 2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'adn répétées (FISH) 3- Localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC-FISH) 4- Analyse Caryotypique : Comptage chromosomique

22 Prestations proposées par la plate-forme 2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'adn répétées (FISH) Télomérique 1U 5U 5S 6S Seq v v spécifique de génome ADN ribosomique Centromérique

23 Prestations proposées par la Plate-Forme 1- L hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures polyploides ou hybrides 2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'adn répétées (FISH) 3- Localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC-FISH) 4- Analyse Caryotypique : Comptage chromosomique

24 Prestations proposées par la plate-forme 3- Changements structuraux : localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC-FISH) ADN Génomique Fragmentation Identification de délétion, translocation

25 Prestations proposées par la Plate-Forme 1- L hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures polyploides ou hybrides 2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'adn répétées (FISH) 3- Localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC-FISH) 4- Analyse Caryotypique : Comptage chromosomique

26 Prestations proposées par la plate-forme (4) Analyse Caryotypique : Comptage chromosomique Iris Spartine Rose

27 Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale? Equipement / Personnel Conditions d accès Cout des prestations Formations Démarche Qualité

28 Plate-Forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale INRA- UMR 1349 Institut de Génétique, Environnement et Protection des Plantes (IGEPP) - LE RHEU

29 1- Équipements Laboratoire de Cytogénétique Moléculaire Microscopie * Epifluorescence Axioplan 2 Zeiss * Système d'imagerie Caméra refroidie (Photometrics Cool SNAP HQ) Logiciel d'acquisition METAVUE (UNIVERSAL IMAGING) 2- Personnel Permanent

30 3- Accès La plate-forme étant ouverte à 50% de sa capacité vers les équipes de recherche extérieures : Site web : Un appel d offre accompagné d une plaquette de présentation Pour la prise en charge des prestations en fonction des demandes, nous avons deux niveaux d engagement : soit nous répondons à une prestation complète soit nous accueillons du personnel des unités demandeuses

31 4- Cout des prestations Localisation sur les chromosomes de séquences d'adn répétée (FISH) = 40 Euros/lame Hybridation génomique in situ (GISH) qui permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures hybrides interspécifiques ou polyploïdes = 45 Euros/lame Localisation physique de clones BAC sur les chromosomes (BAC-FISH) sur chromosomes en mitose et en méiose (stade pachytène) = 40 Euros/lame Le BAC-Fiber-FISH qui permet l'analyse d'arrangements de séquences sur fibre d'adn peignées (BAC Fiber-FISH) = 40 Euros/lame -> 240 Euros pour 6 lames

32 5- Formations La plate-forme a également une mission de formation et d'information auprès des chercheurs, techniciens et stagiaires pour un transfert de technologie. Exemples : * Sur Bananier - Afin de caractériser des translocations, le BAC-FISH a été mis au point sur la plate-forme de cytogénétique de Montpellier -> optimiser les techniques de marquage des clones BAC et de détection * Sur Caféier diploïde (C. canephora), nous avons pu mettre au point et former du personnel à la technique du BAC-FISH

33 6- Qualité La PF est adossée à la démarche qualité mise en place par l unité sous l animation de deux groupes de travail «AQR» et «Métrologie» en lien avec un animateur qualité suivant le référentiel INRA (ISO 9001). Les principales actions «qualité» mises en œuvre sur la PF ont été : (1) Mise en place des cahiers de laboratoires, (2) Rédaction des Modes Opératoires, (3) Document unique OPPI (Outil de Pilotage de la Prévention à l INRA), (4) Métrologie : Contrôle des températures (Frigo, Congélateur, Etuve) (OCEASOFT) Contrôle des balances Contrôle annuel des micropipettes METTLER TOLEDO

34 Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale ( ) Contact : olivier.coriton@rennes.inra.fr